LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

ACARA II

UJI KUANTITAS DAN KUALITAS DNA

Disusun Oleh :

Kelompok 9

1. Rahajeng Ayu Sabrina 1903016025

2. Olla Nur Fairuziah 1903016029
3. Yustiana Catherine 1903016115
4. Miftah Nur Arini 1903016063
5. Leonardo Yonatan 1903016111

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS MULAWARMAN

SAMARINDA

2021
 I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah
DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah
diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji
kualitatif.
Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu,
spektrofotometri Vis (Visible) dan Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet
Visible). Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi
adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum
elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang
cahaya tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua cahaya yang dapat
dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun selama ia
dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak
(visible).
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible.Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm karena sinar UV
tidak dapat dideteksioleh mata, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini
terkadang merupakan senyawa yangtidak memiliki warna bening dan transparan.
Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan
sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebihcanggih sudah
menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu
photodiode yang dilengkapi dengan monokromator (Hapsari, 2012).
Spektrofotometri merupakan alat yang menggunakan dua buah sumber
cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk
alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai
sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator
(Hapsari, 2012).
Uji kualitas DNA menggunakan spektrofotometri adalah dengan mengukur
DNA murni hasil isolasi pada panjang gelombang 260 nm, dimana DNA
menyerap cahaya palingkuat. Perhitungan kemurnian yang paling umum adalah
dengan menentukan rasio absorbansidari panjang gelombang 260 nm dibagi
dengan absorbansi dari panjang 280 nm. Kualitas DNA juga dapat dilihat dari
hasil elektroforesis gel agarosa 1%. (Wasdili, 2018).
Uji keberhasilan DNA yang kedua ialah uji kuantitatif dengan menggunakan
nanodrop spektrofotometri. Prinsip kerja nano drop spektrofotometri ialah DNA
murni mampu menyerap cahaya ultraviolet karena adanya basa purin dan
pirimidin. Hasil uji nano dropialah berupa nilai kemurnian DNA pada
Å260/Å280 dan nilai konsentrasi DNA. DNA berkualitas baik berdasarkan uji
nano drop memiliki kemurnian 1,8-2,0 (Hikmatyar, 2015).
Dalam dunia industri farmasi, proses penjaminan mutu yang cepat dan
handal mutlak diperlukan. Oleh karena itu, kebutuhan suatu metode analisis yang
cepat dan memenuhi persyaratan kesahihan suatu metode yang dapat menunjang
hal tersebut sangat tinggi. Spektrofotometer UV merupakan salah satu metode
yang sederhana, cepat dan lazim digunakan dalam laboratorium industri farmasi
untuk analisis suatu sediaan obat. Hanya saja, spektrofotometri UV biasanya
digunakan dalam analisis sediaan obat dengan zat aktif tunggal. Penggunaan
instrument spektrofotometer UV dalam analisis sediaan obat multikomponen
sangat sulit dilakukan, mengingat permasalahan spektra yang tumpang-tindih
antar komponen. Untuk mengatasi permasalahan tersebut, diperlukan pengolahan
data secara statistic yakni menggunakan metode kalibrasi multivariat
“kemometrika”. Kombinasi metode spektrofotometri UV dengan kalibrasi
multivariat dapat digunakan dalam menganalisis senyawa multikomponen yang
memiliki spektra UV overlapping (Danzer et al, 2004)
Keanekaragaman genetik dapat terjadi karena adanya perubahan nukleotida
penyusun DNA. Perubahan ini mungkin dapat mempengaruhi fenotipe suatu
organisme yang dapatdilihat secara langsung atau mempengaruhi reaksi individu
terhadap lingkungan tertentu. Secara umum keanekaragaman genetik dari suatu
populasi dapat terjadi karena adanya mutasi, rekombinasi, atau migrasi gen dari
satu tempat ke tempat lain.
 Rumus untuk mengukur konsentrasi DNA, yaitu :

Keterangan :

Å260 = Nilai absorbansi pada 260 nm

50 = Ketetapan (larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan nilai 50

ug untai ganda DNA per ml).

1.2 Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum Uji Kuantitas dan Kualitas DNA adalah sebagai
berikut :
1. Untuk mengukur konsentrasi DNA
2. Untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA
 II. METODE PRAKTIKUM
2.1 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum Uji Kuantitas dan Kualitas
DNA ini adalah:
 Alat
1. Spektrofotometer biasa
2. Nanodrop spektrofotometer
3. Pipet miko
4. Tip
5. Kuvet spektrofotometer
6. Tissue
 Bahan
1. DNA hasil ekstraksi
2. Aquades

2.2 Prosedur Kerja

Prosedur kerja pada praktikum Uji Kuantitas dan Kualitas DNA ini adalah
sebagai berikut :
 Menggunakan Spektrofotometer
1. Masukkan 1 ml aquades ke dalam kuvet spektrofotometer sebagai Blanko
spektrofotometer.
2. Pipet 2 μl sampel DNA hasil ekstraksi, masukkan ke dalam kuvet yang
sudah berisi 998 μl aquadest. Campur larutan DNA dengan cara
meresuspensi menggunakan pipet dengan pengenceran 500 x.
3. Baca nilai absorbansi DNA sampel pada λ260 n.
4. Lakukan pembacaan yang ke-2 pada λ280 nm.
5. Tentukan rasio absorbansi λ260 nm dan λ280 nm.
6. Hitung konsentrasi DNA yang diperoleh
7. Faktor pengenceran adalah 1000 μl/ 2 μl = 500
 Menggunakan Nanodrop Spektrofotometer
1. Ambil aquades sebagai blanko sebanyak 2 μl masukkan ke dalam ke
pedestal bagian bawah, kemudian lengan pedestal diturunkan dan
menekan tombol blank.
2. Bersihkan pedestal bagian bawah dan atas menggunakan kertas tissue.
3. Mengambil 2 μl sampel yang akan diukur ke pedestal bagian bawah,
kemudian menurunkan lengan pedestal dan menekan tombol measure.
4. Setelah semua sampel selesai diukur, pedestal bagian bawah dibersihkan
menggunakan kertas tissue.
5. Kemudian diprint untuk mencetak data hasil pengukuran.
6. Jika menggunakan Nanodrop spektrofotometer, nilai absorbansi pada
λ230 (protein), λ260 (DNA) dan λ280 (RNA) serta nilai kuantitas DNA
dan kualitas DNA (perbandingan λ260/ λ280) sudah diinformasikan
secara langsung.
 III. HASIL PENGAMATAN

Berdasarkan hasil pengamatan yang didapatkan pada uji kuantitas DNA

sebagai berikut :

Tabel 3.1 Hasil Pengukuran Kemurnian DNA menggunakan Spektrofotometer

(pengenceran 500 x) (2 µL DNA di uji dalam 1 ml air)

No Kuantitas DNA A260 A280 Kemurnian

Sampel (ng/µL) (A260/A280)
1 17675 0.707 0.3589 1.9699
2 21905 0.8762 0.4636 1.8900
3 18295 0.7318 0.5358 1.3658
4 11755 0.4702 0.2657 1.7697
5 22322.5 0.8929 0.465 1.9202
6 24365 0.9746 0.4072 2.3934
7 11107.5 0.4443 0.2848 1.5600
8 11062.5 0.4425 0.25 1.7700
9 14160 0.5664 0.3041 1.8624
10 14477.5 0.5791 0.351 1.6499
11 15060 0.6024 0.3221 1.8702
12 22212.5 0.8885 0.5048 1.7601
13 17020 0.6808 0.3027 2.2491
14 14670 0.5868 0.3121 1.8802
15 17102.5 0.6841 0.362 1.8898

Tabel 3.2 Hasil Pengukiran Kemurnian DNA menggunakan Nanodrop (tanpa

pengenceran)

No Kuantitas DNA A260 A280 Kemurnian

Sampel (ng/µL) (A260/A280)
1 396.33 7.895 3.507 2.25
2 431.45 8.587 5.142 1.67
3 421.73 8.395 4.690 1.79
4 321.67 6.422 3.509 1.83
5 443.89 8.832 4.698 1.88
6 433.21 8.622 4.467 1.93
7 189.92 3.824 1.941 1.97
8 279.43 5.589 2.823 1.98
9 467.34 9.295 4.742 1.96
10 511.46 10.165 5.322 1.91
11 342.23 6.828 3.711 1.84
12 223.57 4.488 2.026 2.22
13 453.67 9.025 5.861 1.54
14 337.81 6.741 3.566 1.89
15 456.89 9.089 4.637 1.96
 IV. PEMBAHASAN

4.1 Uji kuantitas

Kemurnian DNA yang diperoleh pada penelitian ini berkisar antara 1.519-
1.962. Dari 15 sampel DNA memiliki nilai kemurnian 1.8-2.0 yang menunjukkan
DNA yang diisolasi telah murni (Wilson dan Walker, 2010). Prinsip dasar pada
spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada
partikel koloid apalagi suspensi. DNA yang mengandung basa-basa purin dan
pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya
UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau phenol dapat menyerap
cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini,
sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260
nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280) dan nilai kemurnian DNA
berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011).
Menurut Haris et al (2003), konsentrasi DNA akan berdampak pada kualitas
fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi DNA yang terlalu rendah akan
menghasilkan fragmen yang sangat tipis pada gel atau bahkan tidak terlihat
secara visual, sebaliknya konsentrasi DNA yang terlalu tinggi akan menyebabkan
fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan antara satu fragmen dengan
fragmen lainnya. Konsentrasi hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh 2 faktor
yaitu kecepatan ekstraksi pada waktu ekstraksi dan komposisi penambahan lisis
buffer. Faktor kecepatan ekstraksi merupakan faktor paling berpengaruh karena
pada tahap lisis sel dan presipitasi pengambilan supernatant harus dilakukan per
sampel, sehingga beberapa sampel terjadi pengendapan DNA (Komalasari,
2009).
Salah satu keuntungan pemakaian analisis keragaman genetik tanaman
dengan menggunakan teknik molekuler yang memanfaatkan teknologi
amplifikasi PCR adalah kuantitas DNA yang diperlukan hanya sedikit. Di
samping itu, dalam pelaksanaan teknik RAPD tingkat kemurnian DNA yang
dibutuhkan tidak perlu terlalu tinggi, atau dengan kata lain teknik amplifikasi
 PCR relatif toleran terhadap tingkat kemurnian DNA (Maftuchah dan Zainuddin,
2013). DNA yang sudah diukur konsentrasinya diencerkan sehingga
mendapatkan konsentrasi yang seragam untuk digunakan dalam analisis PCR.
Selanjutnya dilakukan pengecekan kualitas DNA dengan elektroforesis gel untuk
mengetahui tingkat kemurnian DNA dari kontaminan RNA dan keutuhan DNA
hasil isolasi.

4.2 Uji kualitas

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur
konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut
mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Spektrofotometer menunjukkan isolasi
DNA telah berhasil, dapat dilihat dari fragmen DNA yang tampak pada gel.
DNA genom dapat diisolasi dengan berbagai macam teknik. Pada prinsipnya, sel
harus dipecah terlebih dahulu menggunakan beberapa agensia, baik secara fisik
maupun kimiawi. Senyawa yang sering digunakan untuk memecah sel pada
isolasi DNA genom adalah CTAB. Senyawa CTAB biasanya digunakan untuk
isolasi DNA dari jaringan tanaman. Setelah sel dipecah selanjutnya dilakukan
isolasi dan pemurnian DNA (Yuwono, 2008). Sudjadi (2008) teknik pemecahan
sel dapat dibagi dalam metode fisik, metode mekanik, dan metode kimiawi. Sel
diperlakukan dengan pemaparan senyawa kimiawi yang mempengaruhi dinding
sel. Metode kimiawi lebih banyak digunakan untuk preparasi DNA. Dalam suatu
teknik isolasi DNA masih diperlukan suatu tahapan untuk meminimalkan
senyawa-senyawa kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR seperti
polisakarida dan metabolit sekunder. Hal ini disebabkan keberadaan polisakarida
dan metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi
asam nukleat (Maftuchah dan Zainuddin, 2013).
Kandungan senyawa sekunder dalam sel tanaman berbeda-beda, maka setiap
tanaman membutuhkan prosedur isolasi yang optimum agar diperoleh DNA
genom yang dapat digunakan sebagai bahan dalam analisis molekuler. Optimasi
prosedur tersebut dapat dilakukan terhadap komposisi larutan bufer lisisnya
ataupun teknik penanganan fisik dalam pemisahan DNA genom dari senyawa
lain. Pada prinsipnya optimasi prosedur ini bertujuan melindungi DNA genom
dari degradasi akibat senyawa sekunder yang dilepaskan ketika sel dihancurkan
atau kerusakan akibat penanganan fisik (Restu et al., 2012).
Pita DNA yang tebal dan mengumpul (tidak menyebar) menunjukkan
konsentrasi yang tinggi dan DNA total yang diekstrak dalam kondisi utuh.
Sedangkan, pita DNA yang terlihat menyebar menunjukkan adanya ikatan antar
molekul DNA yang terputus pada saat proses ekstraksi berlangsung, sehingga
genom DNA terpotong menjadi bagian-bagian yang lebih kecil. Terputusnya
ikatan antar molekul tersebut dapat disebabkan oleh adanya gerakan fisik yang
berlebihan yang dapat terjadi dalam proses pemipetan, pada saat dibolak-balik
dalam ependorf, disentrifus, atau bahkan karena temperature yang terlalu tinggi
dan karena aktivitas bahanbahan kimia tertentu (Irnawati, 2003).

Kemurnian DNA yang diperoleh pada penelitian ini berkisar antara 1,3658-
2,3934. Dari 15 sampel DNA, terdapat 7 sampel yang memiliki nilai kemurnian
1,8-2,0 yang menunjukan DNA yang terisolasi telah murni. sampel yang
terisolasi murni yaitu sampel nomor 1, 2, 5, 9, 11, 14, dan 15. sedangkan sampel
yang memiliki nilai kemurnian di bawah 1,8 dan diatas 2,0 yang artinya tidak
terisolasi dengan murni yaitu sampel nomor 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, dan 13.
Selain kemurnian, konsentrasi DNA juga telah diperoleh dari praktikum ini.
Konsentrasi DNA yang dihasilkan berkisar antara 11062,5 - 24365 ng/µL.
Konsentrasi paling tinggi diperoleh pada sampel 6 sebesar 24365 ng/µL,
sedangkan konsentrasi paling rendah diperoleh pada sampel 8 sebesar 11062,5
ng/µL.
 V. KESIMPULAN
Adapun kesimpulan yang dapat diperoleh dari praktikum ini adalah sebagai
berikut :
1. Konsentrasi DNA dari sampel yang paling tinggi hingga yang paling rendah
adalah sampel nomor 6, 5, 12, 2, 3, 1, 15, 13, 11, 14, 10, 9, 4, 7, dan 8. Untuk
konsentrasi DNA yang paling tinggi terdapat pada sampel 6 sebesar 24.365
ng/µL dan konsentrasi DNA yang paling rendah terdapat pada sampel 8 sebesar
11.062,5 ng/µL.
2. Nilai kemurnian dari sampel yang paling tinggi hingga yang paling rendah adalah
sampel nomor 6, 13, 1, 5, 2, 15, 14, 11, 9, 8, 4, 12, 10, 7, dan 3. Untuk nilai
kemurnian yang paling tinggi terdapat pada sampel 6 sebesar 2,3934 dan nilai
kemurnian yang paling rendah terdapat pada sampel 3 sebesar 1,3658.
Kemurnian yang paling baik sesuai dengan standar rasio DNA 1,8–2,0 terdapat
pada sampel 1, 2, 5, 9, 11, 14, dan 15.
 DAFTAR PUSTAKA

Danzer, K., Otto, M., and Currie, L.A., 2004, Guideline for Calibration in Analytical
Chemistry Part 2. Multispecies Calibration (IUPAC Technical Report), Pure
Appl. Chem., 76(6) : 1215-1225.
https://scholar.google.com/scholar?hl=id&as_sdt=0%2C5&q=Danzer%2C+K.
%2C+Otto%2C+M.%2C+and+Currie%2C+L.A.%2C+2004&btnG=#d=gs_qab
s&u=%23p%3DwgAyrSIOvTkJ. Diaskses pada tanggal 22 November 2021.

Fatchiyah, 2011. Pelatihan analisis fingerprinting DNA tanaman dengan metode

RAPD. Modul. Laboratorium sentral ilmu hayati Universitas Brawijaya,
Malang.

Hapsari, Rizqi. 2012. Uji Kuantitatif dan Kualitatif DNA Pule Pandak (Rauvolfia
serpentina L.). Skripsi. Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
https://digilib.uns.ac.id/dokumen/detail/27315. Diakses pada tanggal 22
November 2021.

Haris, N., Hajrial. A, Nurita. T.M, dan Agus. P. 2003. Kemiripan genetik klon karet
(Hevea brasiliensis Muell Arg.) berdasarkan metode amplified fragment length
polymorphisms (AFLP). Menara Perkebunan 71(1): 1-15.

Heyne. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Terjemahan Badan Litbang Kehutanan,

Departemen Kehutanan. Jakarta.

Hikmatyar, Mohamad Fazri., Royani, Juwartina Ida., dan Dasumiati. 2015. Isolasi
dan amplifikasi DNA keladi tikus (Thyponium flagelliform) untuk identifiksai
keragaman genetik. Jurnal Bioteknologi dan Biosains Indonesia. Vol 2(2): 42–
48. http://ejurnal2.bppt.go.id/index.php/JBBI/article/view/507/pdf_1. Diakses
pada tanggal 22 November 2021.
Lubis, Wisuda Pratama. 2021. Uji Kuantitatif DNA Dengan Spektrofotometer. Scribd.
https://id.scribd.com/document/502299506/Uji-Kuantitatif-Dna. Diakses pada
tanggal 22 November 2021.

Maftuchah dan A. Zainuddin. 2013. Studi Pendahuluan Variasi Genetik Jarak Pagar
(Jatropha curcas L.) Lokal Berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA.
Pusat Pengembangan Bioteknologi Universitas Muhammadiyah Malang.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kanisius, Yogyakarta. 279 hlm.

Wasdili, Fini Ainun Qolbi dan Gartinah, Tintin. 2018. Penentuan kualitas isolasi
DNA Salmonella Typhimurium dengan metode spektrofotometri dan
elektroforesis. Prosiding Pertemuan Ilmiah Nasional Penelitian dan
Pengabdian Masyarakat (PINLITAMAS). Vol 1(1): 578–582.
http://repository2.stikesayani.ac.id/index.php/pinlitamas1/article/download/431/
388/. Diakses pada tanggal 22 November 2021.

Wilson, K and J. Walker. 2010. Principles and Techniques of Biochemistry and

Molecular Biology. Cambridge University Press, UK. 761 p.

Wisuda Pratama. L., 2021. Uji Kuantitatif DNA Dengan Spektrofotometer. Scribe.
https://id.scribd.com/document/502299506/Uji-Kuantitatif-Dna. Diakse pada
tanggal 22 November 2021.

Yowono, T. Bioteknologi Pertanian. Gadjah Mada University Press.

 LAMPIRAN

 Mengukur konsentrasi DNA menggunakan Spektrofotometer

Alat dan Bahan Proses memasukkan aquades ke

dalam kuvet spektrofotometer

Proses memasukkan sampel DNA Proses memasukkan sampel ke

hasil ekstraksi ke dalam kuvet berisi dalam spektrofotometer
aquades

Nilai absorbansi sampel DNA pada

A260 dan A280 serta rasionya
 Mengukur konsentrasi DNA menggunakan Nanodrop Spektrofotometer

Alat Nanodrop Spektrofotometer Alat dan Bahan

Proses memasukkan aquades ke Hasil menekan tombol blank pada

pedestal layar nanodrop spektrofotometer

Proses membersihkan pedestal Proses memasukkan sampel DNA

menggunakan tissue hasil ekstraksi ke pedestal
Hasil menekan tombol measure pada layar
nanodrop spektrofotometer, terlihat
informasi nilai absobansi A230, A260,
A280, nilai kuantitas DNA, dan kuantitas
DNA (A260/A280)