EKSTRAKSI DAN PCR

PADA SPESIMEN SARS COV-2

SITTI MANTASIA
RSUP DR WAHIDIN SUDIROHUSODO
2021
Workflow Uji Molekuler SARS CoV-2

RNA PCR Data

Isolation Reaction Analysis
 Ekstraksi RNA
Mengisolasi asam nukleat dari berbagai material selular di dalam spesimen

Dilakukan di BSL II

Menghilangkan material penghambat yang tidak diperlukan dalam reaksi PCR

Inaktivasi virus (lysis buffer) HARUS dilakukan di dalam BSC class 2 (Biosafety Cabinet)
 Metode Ekstraksi
• Metode Phenol-Chloroform

Konvensional

• Metode Spin Column

Berbasis Kit • Metode Magnetic Bead
 Tahapan yang terjadi dalam proses
ekstraksi materi genetik
• Proses pemecahan sel sehingga DNA/RNA dapat terilis keluar
Lysis • Bahan: SDS (Sodium dedocyl Sulfat), Proteinase K

• Proses pengikatan DNA/RNA sehingga dapat terpisah dari protein dan materi
pengotor lainnya
Binding • Bahan: Poly A (Polyadenylic acid)

• Tahapan pencucian materi genetik DNA/RNA agar terpurifikasi

• Wash 1:Guanidine-HCl dan Tris-HCl ditambah ethanol
Wash • Wash 2 :NaCl, Tris-HCl ditambah ethanol

• Tahapan resuspensi dengan penambahan larutan buffer sebagai pelarut dari

materi DNA/RNA
Elute • Bahan: Water, PCR grade
Metode ekstraksi spin column

Lysis: SDS (Sodium Dedocyl Sulfat),Proteinase K

Binding: Poly A

Wash 1:Guanidine-HCl dan Tris-HCl ditambah

ethanol
Wash 2 :NaCl, Tris-HCl ditambah ethanol

Elution: Water, PCR Grade

RNA murni di simpan pada suhu -20 ◦C

 PCR (Polimerase Chain Reaction)
In 1983  PCR ditemukan oleh Kary Mullis dari Cetus Corporation
PCRMetode yang cepat dan sederhana, untuk memperbanyak
urutan DNA spesifik yang diinginkan

PCR dapat digunakan untuk amplifikasi DNA maupun RNA (cDNA)

Perbanyakan template DNA atau complementary DNA (cDNA)

dengan menggunakan enzim Taq Polymerase secara in vitro

Tahapan utama PCR :

1. Denaturasi (Suhu 95°C)

2. Annealing (Suhu 50-60°C)

3. Ekstensi/Elongasi (Suhu 72°C)

 Sistematika

Nucleic Acid
Amplification Test
(NAAT)

Prinsip PCR dan RT-PCR

RT-PCR Konvensional dan

Realtime
 Nucleic Acid Amplification Test (NAAT)

• Mendeteksi materi genetik

• Sensitif dan spesifik
• Cepat
• Memerlukan tahapan
persiapan sampel
• Memerlukan peralatan
khusus
• Memerlukan fasilitas lab
khusus BSL 2
• PCR
• Sekuensing
 PCR, RT-PCR, rRT-PCR

PCR = Polymerase Chain Reaction

RT–PCR = Reverse Transcription–PCR

rRT-PCR atau qRT-PCR = Realtime RT-PCR

 Komponen Reagensia PCR

• Deoksiribonukleotida
trifosfat (dNTP)
• Enzim termostabil PCR
Taq DNA polimerase Reagensia
• Ion Mg2+
• Buffer
• Primer Forward
Spesifik
• Primer Reverse
• Template DNA/cDNA
 Komponen Reagensia PCR
• Taq Polymerase
Enzim yang berfungsi untuk
membentuk untai DNA
komplementer pada template DNA
• MgCl2
Menyediakan ion yang diperlukan untuk reaksi
enzimatis
• dNTP’s (Deoxynucleotide triphosphates)
Nukleotida untuk membentuk strands DNA
(Adenine, Cytosine, Guanine, Thymine)
• Buffer
Memelihara pH optimal untuk kerja enzim
 Komponen Reagensia PCR
• Primers
Menempel pada singl-stranded
template DNA Memulai reaksi
pembentukan DNA utas baru
- Forward primer : Menempel pada DNA anti-
sense
- Reverse primer : Menempel pada DNA sense
• Template
Template yang akan diperbanyak/diamplifikasi
berupa DNA atau cDNA
Proses PCR
Tahap 1:
Denaturasi
ds DNA ss DNA
60 detik, 90°-95°C

Tahap 2:
Annealing
Penempelan Primer
F dan R
30-45 detik, 50°-
60°C

P Tahap 3:
Elongasi
P Perpanjangan untai
DNA baru oleh Taq
Polymerase
1-2 menit, 72°C
 Proses PCR
• Kemampuan PCR
untuk menghasilkan
Gen Target
Exponential jutaan copi DNA
Amplification (amplikon) dalam
waktu yang sangat
singkat menjadikan
PCR sangat sensitif

Jumlah copy • Tetapi, hal tersebut

DNA : 2n dapat mengakibatkan
n: siklus PCR timbulnya
kontaminasi sebagai
hasil positif palsu
235 = 34 milyar
copy DNA (false positive)
 RT-PCR
• Reverse Transcript-Polymerase Chain
Reaction, bukan realtime-PCR
• Proses pembentukan cDNA dari template RNA
dengan menggunakan enzim reverse transcriptase.
• Amplifikasi DNA dengan template RNA

• Terdiri dari 2 tahap:

RT : Reverse Transcription cDNA
Synthesis
PCR : DNA Amplification
Pemeriksaan virus SARS-CoV-2
dengan metode NAAT
menggunakan prinsip apa?

PCR?

RT-PCR?
Proses RT-PCR
 Komponen Reagensia RT-PCR
PCR RT-PCR
• dNTP • dNTP
• enzim • enzim termostabil
termostabil Taq DNA
Taq DNA polimerase
polimerase • Ion Mg2+
• Ion Mg2+ • Buffer
• Buffer • enzim
• Primer Forward Reverse
• Primer Reverse Transcriptase
• Template : DNA • Primer Forward
• Primer Reverse
• Template : RNA
 RT-PCR

Two Step RT-PCR One Step RT-PCR

RNA
RNA cDNA Transfer

Reverse transcription
Reverse +
Amplification
transcription amplification
 Metode RT-PCR

Konvensional Realtime

Hasil amplifikasi Hasil amplifikasi

dianalisis pada dapat dianalisis
saat proses RT- pada saat proses
PCR selesai RT-PCR
(end point) berlangsung
RT-PCR Konvensional (gel based)
Alur pengerjaan RT-PCR
Konvensional
 Elektroforesis
• Teknik pemisahan molekul
berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan
listrik

• Amplikon DNA hasil RT-PCR bermuatan

negatif
dialiri arus listrik akan bergerak ke arah
kutub positif

• Pita amplikon akan berpendar di

bawah sinar UV dikarenakan
adanya senyawa intercalating dye
yang berikatan dangan DNA untai
ganda
 Elektroforesis
Komponen:
• 1.5-2% agarose (dilarutkan dalam 1x TBE)
• Gel Stain (SYBR Safe, GelRed, Ethidium
Bromide)
• Loading Buffer/Loading dye
• 1x TBE Buffer
• DNA Ladder

Analisis Hasil:
• tidak terdapat pita DNA amplifikasi pada
kontrol negatif dan memiliki pita DNA
amplifikasi sesuai ukuran (pasang
basa/base pair) target DNA pada kontrol
positif.

• Hasil dinyatakan positif bila ukuran pita

DNA sampel memiliki panjang basa
yang sama dengan kontrol positif.
 Realtime RT-PCR (rRT-PCR)

• Teknik amplifikasi (perbanyakan)

DNA dimana produk amplifikasi
dapat dianalisis pada setiap
siklusnya menggunakan fluorogenic
probe.

• Menggunakan alat thermal cycler yang

dilengkapi dengan detektor untuk membaca
sinyal fluorensensi dan mengubahnya
menjadi sinyal digital sehingga dapat
dianalisis oleh komputer.
 Komponen Reagensia rRT-PCR
Konvensional Real Time
• PCR Buffer (ion Mg) • PCR Buffer (ion Mg)
• dNTPs • dNTPs
• Enzim Reverse • Enzim Reverse
Transcriptase Transcriptase
• Enzim Taq • Enzim Taq Polymerase
Polymerase
• Primer Forward
• Primer Forward
• Primer Reverse
• Primer Reverse
• Probe
Probe : Sekuen
oligonukleotida pendek yang
didesain untuk berhibridisasi
5’
dengan sekuen target 3’
 Jenis Probe

1. Non-specific Detection
using DNA Binding Dyes
SYBR Green Dye

2. Specific Detection
Target Specific Probes
Probe : TaqMan
Jenis Probe: SYBR Green

Intercalating dye yang akan

berpendar jika berikatan dengan
DNA untai ganda dan tidak
berikatan maupun berpendar jika
tidak ada DNA untai tunggal.

pada tahapan annealing dan

elongasi SYBR Green akan
berikatan dengan DNA untai
ganda dan berpendar.
Jenis Probe: Taqman
Pada tahap annealing,
Taqman probe akan
berikatan dengan
template DNA

pada proses elongasi DNA

untai baru, ikatan hidrogen
antar basa penyusun
penyusun Taqman probe akan
terputus (terhidrolisis) oleh
enzim Taq Polymerase.

Proses hidrolisis Taqman

probe menyebabkan adanya
pendaran fluorogenic dari
Reporter dye yang akan
ditangkap oleh kamera
Realtime RT-PCR
Alur pengerjaan rRT-PCR
 Hasil rRT-PCR
Kurva
Kurva amplifikasi PCR yang amplifikasi
berbentuk sigmoid terdiri dari 3
fase yaitu eksponensial, linear
dan plateu

Hasil akhir rRT-PCR berupa nilai

Ct yang merupakan perpotongan
antara garis threshold dengan
kurva amplifikasi.

Garis Threshold adalah garis yang

berada di atas baseline sinyal
fluorescence, sehingga sinyal
fluorescence yang terdeteksi di
atas threshold adalah sinyal yang
digunakan dalam menentukan
nilai Ct
 Analisis Hasil rRT-PCR
Kualitatif
• Penentuan hasil positif atau
negatif dari nilai Ct yang
terdeteksi.
• Positif: nilai Ct dibawah cut off
materi
genetik dari virus target ada di
dalam sampel
• Negatif: nilai Ct di atas cut off
atau tidak memiliki kurva
amplifikasi tidak di temukan
materi genetik virus target di
dalam sampel
• Semakin banyak DNA kopi
template (cetakan), semakin awal
sinyal terdeteksi, dan semakin
rendah nilai Ct
 Analisis
Analisis Hasil
Hasil rRT-PCR
rRT-PCR
• Validasi hasil rRT-PCR kualitatif adalah sebagai berikut:
a) Tidak terbentuk kurva amplifikasi pada kontrol negatif.
b) Terbentuk kurva amplifikasi pada kontrol positif dan nilai
Ct dalam kisaran yang diharapkan.
c) Kurva amplifikasi harus berbentuk sigmoid untuk hasil
positif.
d) Pemeriksaan housekeeping gene yang merupakan
gen yang terdapat di dalam sel epitel manusia.
e) Hasil housekeeping positif menunjukkan bahwa
proses ekstraksi asam
nukleat dan proses pengambilan spesimen telah
dilakukan dengan benar.
Konvensional vs Realtime
Konvensional vs Realtime
 Singleplex rRT-PCR

• Mendeteksi satu target

DNA atau RNA dalam
satu reaksi PCR dengan
menggunakan satu
pewarna fluoresensi.

• Kelebihan: lebih sensitif

• Kekurangan: reagensia
yang diperlukan lebih
banyak dan waktu yang
diperlukan lebih lama.
 Multiplex rRT-PCR

Identifikasi dua
atau lebih DNA
target dalam 1
reaksi PCR, dalam
hal ini
menggunakan
metode Realtime
PCR
 Multiplex rRT-PCR
Kelebihan:
 Mendeteksi dua atau lebih DNA target
dalam satu reaksi
pemeriksaan.
 Spesimen yang diperiksa lebih banyak
 Lebih ekonomis.
 Efisien ketika jumlah spesimen terbatas.

Kekurangan:
 Optimisasi dan validasi untuk memastikan
efisiensi dari
amplifikasi pada masing-masing target
DNA.
 Reagensia Realtime dengan kemampuan
 Jenis Probe vs Detektor

 Deteksi SARS-CoV2 menggunakan

realtime RT-PCR Taqman
 Jenis probe yang digunakan Probe

adalah hidrolisis
probe/Taqman probe
5’
 Label probe yang digunakan 3’
bergantung pada desain probe yang
dibuat atau dari kit yang tersedia di
pasaran.
 Terdapat
labelberbagai
probe disesuaikan
macam labeldengan
probedetektor yang
yang tersedia
terdapat
di dalam mesin Thermal cycler yang dimiliki di laboratorium
 Alur rRT-PCR
Persiapan
mastermix
(area 1: clean
room)
Penambahan
RNA
(area 2) Amplifikasi DNA
di dalam Thermal
Cycler (area 3)
Master mix
Alur rRT-PCR

Pre-PCR

Alur kerja
searah

PCR
 Area Pre-PCR: Clean Room

Penyimpanan dan penanganan reagen rRT-PCR

• disimpan di dalam refrigerator dan freezer di
area 1 (clean room).
• Reagen rRT-PCR harus di alikuot dalam volume
kecil, untuk menghindari kontaminasi.
• Reagen stok harus disimpan pada suhu -20oC
• Reagen kerja (working solution) yang
digunakan dengan frekuensi harian, dapat
disimpan pada suhu 2-8oC (tergantung
ketentuan).
• Ruangan harus bersih dari berbagai agen
biologis (RNA,
DNA, sampel. Produk PCR, kultur )
 Primer dan Probe
WHO merekomendasikan beberapa Primer
dan Probe Set
dengan beberapa target gen sebagai berikut:
 Tahapan Preparasi Master Mix
a) Dilakukan di dalam Laminar Air Flow (LAF) ruang bersih
(clean room)
b) Mengeluarkan master mix dari refrigerator/freezer.
c) Memastikan semua reagensia tercampur dengan baik
dengan cara vortex cepat dan spin down
d) Menyiapkan PCR worksheet untuk menghitung jumlah
reaksi master mix yang dibutuhkan
e) Memperhatikan instruksi dari reagen rRT-PCR yang
digunakan mengenai rekomendasi kondisi suhu saat
mencampur master (suhu ruang atau dingin 4-8◦ C)
f) Teknik memipet harus dikuasai dengan baik oleh petugas
 Singleplex: Protokol US CDC
Target : N1, N2, RP
Reagensia : Superscript III One Step rRT-PCR with
Platinum Taq

Komponen 1 reaksi 14 reaksi

(µl) (µl)
Nuclease-free water 5,5 77
2x reaction mix 12,5 175
primer & probe 1,5 21
(N1/N2/RP)
Enxyme Mix 0,5 7
Total 20 280
Contoh perhitungan reaksi:

Jumlah sampel 11 + 1 reaksi Non template control (NTC) + 1 reaksi Positive

template
control (PTC) + 1 reaksi pippeting error = Total reaksi: 14 reaksi
RP gene yang merupakan gen yang terdapat di dalam
sel epitel manusia
 AREA 1 : PCR Master Mix Preparation

Komponen 1 reaksi 14 reaksi

(µl) (µl)
Nuclease-free water 5,5 77
2x reaction mix 12,5 175
primer & probe 1,5 21
(N1/N2/RP) N N R
1 2 P
Enxyme Mix 0,5 7
Total 20 280 Master mix

Masing-masing master
mix dialiquot @ 20 µl ke
dalam 96 PCR well plate
atau realtime PCR strip 8
 AREA 1 : PCR Master Mix Preparation

Masing-masing master mix

dialiquot @ 20 µl ke dalam 96
N N R PCR well plate atau realtime PCR
1 2 P Strips
Master
1mix 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A N1 N2 RP N1 N2 RP
NTC NTC NTC
B N1 N2 RP N1 N2 RP PCR plate ditutup
C N1 N2 RP N1 N2 RP menggunakan
D N1 N2 RP N1 N2 RP
E N1 N2 RP N1 N2 RP optical caps strip
PTC PTC NTC ATAU alumunium
F N1 N2 RP
G N1 N2 RP foil selama
H N1 N2 RP berpindah ruangan.
5 µl nuclease-free water
ditambahkan pada well
NTC
 AREA 2 : Penambahan RNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sampl
e1 A N1 N2 RP N1 N2 RP
NTC NTC NTC
Sampl
B N1 N2 RP N1 N2 RP
e2
C N1 N2 RP N1 N2 RP
Sampl D N1 N2 RP N1 N2 RP dst hingga
e3
E N1 N2 RP N1 N2 RP sample ke -11
PTC PTC NTC
F N1 N2 RP
G N1 N2 RP
H N1 N2 RP

Tambahkan 5 µl RNA template ke dalam

masing-masing master
mix N1, N2, N3, RP
 AREA 2 : Penambahan RNA
a. Dilakukan di area lab 2, di dalam BSC Kelas II (Tipe A2)
b. Menyimpan master mix PCR di dalam kulkas suhu 2-8oC.
c. Mengenakan APD khusus area 2.
d. Sebelum bekerja, membersihkan BSC menggunaan
hipoklorit 1% dan alkohol 70%.
e. Mengambil master mix dari dalam kulkas dan RNA. Jika
memungkinkan simpan RNA dalam cooler rack (agar
tetap dingin) selama proses penambahan RNA ke dalam
master mix.
 Hasil rRT-PCR
Beberapa hal yang harus diperhatikan di dalam menganalisa hasil rRT- PCR:

a. Hasil NC harus negatif dan tidak menunjukan kurva

amplifikasi.

b. Hasil PC menunjukkan kurva amplifikasi dengan rentang

kisaran nilai Ct diantara 30-35. Jika PC menunjukkan kurva
amplifikasi nilai Ct >35 atau negatif segera lakukan
pengulangan penyiapan reagensia master mix dengan
memperhatikan ketelitian dan kemananan kontrol kualitas
reagensia
 Hasil rRT-PCR

Beberapa hal yang harus diperhatikan di dalam

menganalisa hasil rRT-
PCR:
c. Hasil RP menunjukkan kurva amplifikasi dengan nilai
Ct <35, mengindikasikan adanya material genetika
RNA dari spesimen manusia. Nilai RP menunjukkan
bahwa proses asam nukleat dan pengambilan
spesimen telah dilakukan dengan benar. Jika nilai RP
negatif juga menunjukkan kemungkinan reagensia
mix yang kurang baik

d. Sampel menunjukkan hasil positif ditandai dengan

adanya kurva amplifikasi dengan nilai ct berdasarkan
Hasil rRT-PCR (Singleplex)
PTC

Positi
ve

NTC negati
ve
NTC tidak
menunjukkan
amplifikasi

PTC menunjukkan
amplifikasi dengan
nilai CT dalam
kisaran 25-30

Hasil positif bila CT ≤

40
 INTERPRETASI HASIL
Contoh Interpretasi hasil berdasarkan protokol US CDC

2019 2019 RP Interpretasi Hasil

nCoV_N1 nCoV_N2
+ + + Positif SARS-CoV2
Hanya salah satu + Inconclusive Dilakukan tes
target positif ulang
- - + Negatif SARS-CoV2
- - - Invalid
Cut off value untuk nilai positif berbeda untuk setiap
protocol
US CDC protocol, hasil dinyatakan positif bila CT ≤ 40

Hasil RP positif menunjukkan bahwa proses ekstraksi

asam nukleat dan proses pengambilan spesimen telah
dilakukan dengan benar
Interpretasi hasil

RP No. Target Reporter Quencher

1. RdRp FAM None
2. E HEX None
E 3. RP Cy5 None
RdRp
Pengaturan threshold dan
pembacaan nilai Ct harus
dilakukan untuk setiap
dye fluoresensi sesuai
dengan masing-masing
protokol yang digunakan
 Interpretasi hasil
Hasil Invalid dan inconclusive
 Kurva amplifikasi tidak berbentuk sigmoid walaupun nilai ct terbentuk
dan memotong garis threshold. Kurva amplifikasi normal harus
berbentuk sigmoid yang menunjukkan adanya amplifikasi secara
eksponensial. Untuk kasus ini, sebaiknya threshold diatur di atas
kurva ini (Jika memungkinkan).
 Nilai RP negatif atau tidak ada kurva amplifikasi. Hal ini
menunjukkan tidak adanya material genetik, mengindikasikan
pengambilan spesimen yang kurang baik
 Hasil tidak valid bisa juga disebabkan reagensia yang rusak
 Interpretasi hasil
Hasil?
RP:
negative

Invalid
Not Sigmoid result
Curve

RP
gene
RdRp
gene
E
gene
Interpretasi hasil

Hasil?
Not sigmoid RP: positive
curve E gene negative
RdRp negative

Negative

SARS-CoV2

RP
gene
RdRp
gene
E
gene
 Permasalahan
Masalah Kemungkinan penyebab
Komposisi mastermix tidak optimal
Suhu PCR tidak optimal
Tidak ada Ada inhibitor
amplifikasi Template RNA/DNA rusak
Probe terdegradasi
Kontaminasi
Sinyal pada kontrol Probe terdegradasi
negatif Primer Dimer
Konsentrasi template terlalu tinggi
Sinyal terdeteksi
terlalu Probe terdegradasi
awal Primer Dimer
• SEKIAN DAN TERIMA KASIH