Modul 1.

In Silico (Desain Primer)

Capaian Pembelajaran
1. Mahasiswa menjelaskan prinsip-prinsip dasar desain primer yang baik.
2. Mahasiswa mampu menggunakan perangkat lunak untuk mendesain primer.
3. Mahasiswa mampu menggunakan primer yang telah didesain dalam reaksi PCR.

Ringkasan Praktikum
Praktikum in silico Biologi Molekuler terdiri atas 3 modul, yaitu Modul 1 (desain
primer), Modul 2 (kloning dan restriksi), dan Modul 3 (analisis hasil sekuensing). Praktikum
pertama in silico pertama akan membahas tentang desain primer. Kegiatan praktikum
meliputi pengenalan prinsip-prinsip dasar mendesain primer dan cara menggunakan
perangkat lunak dalam proses mendesain primer.
Bentuk praktikum meliputi kuliah interaktif bersifat tutorial kepada beberapa kelompok
mahasiswa yang dibantu oleh beberapa asisten praktikum. Kegiatan yang dilakukan oleh
mahasiswa adalah mengikuti setiap tahapan kerja yang sudah ada di modul tahap demi tahap.
Setiap tahapan yang dilakukan harus dicatat dalam bentuk jurnal harian yang ada di dalam
modul. Hasil pekerjaan dari setiap tahap merupakan data praktikum yang kemudian harus
dianalisis dan dibahas melalui beberapa pertanyaan yang sudah ada di dalam modul.
Hasil evaluasi pembelajaran adalah jurnal harian yang dikumpulkan pada hari yang sama
di tiap modul yang dikerjakan. Mahasiswa juga harus membuat laporan akhir dari rangkaian
3 modul praktikum in silico yang sudah dilakukan. Bentuk laporan akhir berupa hasil dan
pembahasan dari keluruhan kegiatan dalam 3 modul.

Alat dan Bahan

A. Alat
1. Laptop
2. Koneksi internet
3. Perangkat lunak Bioedit versi 7.2.5 dan fastPCR
B. Bahan
1. Urutan nukleotida

Cara Kerja
A. Mendesain primer untuk DNA Barcode spesies ikan Atractosteus spatula
Unduh urutan nukleotida gen COI dari database NCBI. Ketik nomor accession
berikut di kolom pencarian.
1. HQ557341.1 2. JN853325.1 3. JN853326.1
4. JN853324.1 5. JN853327.1 6. JN853328.1
Simpan semua urutan nukleotida dalam format fasta atau .txt (Kalian masukkan ke
dalam Tabel 1. Di Hasil dan Pembahasan
Buka perangkat lunak Bioedit. Ikuti langkah-langkah berikut:
1) Pada menu file pilih new alignment, akan muncul jendela instruksi untuk
memasukkan urutan nukleotida.
2) Pilih kembali pada bagian file kemudian cari bagian import untuk
memasukkan keenam file dalam format fasta atau .txt tadi yang sudah diunduh.
3) Lakukan analisis mmultiple alignment dengan cara memilih bagian accesory
application kemudian klik pada ClustalW multiple alignment. Tunggu
beberapa saat sampai perangkat lunak selesai bekerja.
4) Pilih bagian alignment kemudian pilih create consensus sequence. Simpan
urutan nukleotida hasil konsensus dari 6 urutan nukleotida tadi pada file .txt
(Pindahkan urutan nukleotida hasil konsensus pada Tabel 2.)

Halaman 1 dari 5
Praktikum Biologi Molekuler (Departemen Biologi FMIPA UI) Tahun 2017
 5) Setelah diperoleh urutan nukleotida hasil konsensus, langkah selanjutnya adalah
mendesain primer untuk mengamplifikasi gen COI hasil konsensus tadi. Kita
memerlukan akses ke laman http://bioinfo.ut.ee/primer3/. Pada laman tersebut,
kalian cukup memasukkan urutan gen COI hasil konsensus tadi. Tunggu sampai
diperoleh 5 kandidat primer yang direkomendasikan. (Kalian catat kelima
rekomendasi primer yang dihasilkan ke dalam Tabel 3.)
B. Menilai kualitas primer yang telah didesain
Produk rekomendasi primer yang dihasilkan pada tahap kerja sebelumnya harus
diukur beberapa parameter sehingga dapat dikategorikan sebagai primer yang baik.
Oleh karena itu, pengujian dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak melalui
laman http://www.idtdna.com/calc/analyzer.
Masukkan satu per satu pasangan primer mulai dari primer forward dan primer
reverse. Tunggu sampai hasil beberapa parameter pengujian keluar. (Catat data
parameter pengukuran dalam Tabel 4.)
C. Menguji primer dalam program PCR virtual
Pengujian spesifitas primer yang didesain menggunakan program virtual PCR.
Langkah pertama yang harus dilakukan adalah menyesuaikan dengan komposisi
reagen yang digunakan. Jika reaksi PCR memiliki komposisi sebagai berikut:
Konsentrasi primer = 0,5 M
Konsentrasi MgCl2 = 50 mM
Konsentrasi dNTP = 10 mM
Lakukan pengukuran primer parameter seperti pada Tabel 4 menggunakan perangkat
lunak di laman http://www.idtdna.com/calc/analyzer. (Catat data tersebut dalam
Tabel 5.)
Pengujian tingkat spesifik primer terhadap target dapat menggunakan bantuan
perangkat lunak yang ada di laman https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/.
Uji tiap pasang primer yang akan digunakan pada laman di atas. Pada kolom enter
accession masukkan kode urutan nukleotida NC_008131.1. Sementara itu, pada
kolom primer forward dan primer reverse masukkan primer yang menurut kalian
paling sesuai berdasarkan analisa parameter pada Tabel 4. dan Tabel 5.
Pada kolom PCR product size nilai min adalah 70 dan nilai max 1500. Kolom
database pilih nr dan pada kolom organism isi dengan 7917. (Catat hasil yang
diperoleh pada Tabel 6.)
Pengujian keberhasilan desain primer terhadap amplifikasi dari gen COI spesies ikan
Atractosteus spatula dapat menggunakan perangkat lunak FastPCR 6.5.
Langkah-langkah yang harus dilakukan sebagai berikut:
1) Pada jendela pernagkat lunak FastPCR 6.5 pilih kolom in silico PCR. Isi pada
bagian General Sequence dengan urutan nukleotida dari accession number
NC_008131.1. Kemudian pada kolom Pre-designed primers list isi dengan
urutan primer forward dan reverse dengan memberikan tanda > sebelum urutan
nukleotida. Klik ikon umtuk memulai analisa. (Catat hasil simulasi yang
keluar pada Tabel 7.)

Hasil dan Pembahasan

Tabel 1. Urutan nukleotida gen COI dari spesies Atractosteus spatula
Accesion Urutan nukleotida Panjang
Number pasangan basa
HQ557341.
Modul 1. In Silico (Desain Primer)

1
JN853325.1
JN853326.1
JN853324.1
JN853327.1
JN853328.1

Tabel 2. Urutan nukleotida hasil konsensus

Urutan nukleotida Panjang pasangan
basa

Tabel 3. Urutan primer hasil rekomendasi

Nama Primer Urutan Nukleotida Panjang basa
COI 1 F
COI 1 R
COI 2 F
COI 2 R
COI 3 F
COI 3 R
COI 4 F
COI 4 R
COI 5 F
COI 5 R

Tabel 4. Hasil pengukuran desain primer

Nama %GC Tm Struktur Self dimer Struktur
Primer hairpin sekunder
COI 1 F
COI 1 R
COI 2 F
COI 2 R
COI 3 F
COI 3 R
COI 4 F
COI 4 R
COI 5 F
COI 5 R

Tabel 5. Hasil pengukuran desain primer setelah penambahan komponen reaksi PCR
Nama %GC Tm Struktur Self dimer Struktur
Primer hairpin sekunder
COI 1 F
COI 1 R
COI 2 F
COI 2 R
COI 3 F
COI 3 R

Halaman 3 dari 5
Praktikum Biologi Molekuler (Departemen Biologi FMIPA UI) Tahun 2017
 COI 4 F
COI 4 R
COI 5 F
COI 5 R

Tabel 6. Hasil pengujian tingkat kecocokan desain primer dengan database

Nama Primer Urutan Nukleotida Produk Accession Number
PCR yang Cocok
Forward
Reverse

Tabel 7. Hasil simulasi FastPCR

Nama Urutan Posisi Produk PCR Suhu Annealing
Primer Nukleotida Penempelan
Primer
Forwar
d
Reverse

Pertanyaan Pembahasan
1. Berdasarkan data pada Tabel 1., berapa kisaran panjang pasang basa yang ada pada
gen COI di spesies ikan Atractosteus spatula?
2. Berapa panjang basa dari urutan nukleotida hasil dari multiple alignment ? Mengapa
kalian harus melakukan analisis multiple alignment?
= 652bp.. Analisis Multiple Alignment perlu dilakukan untuk menentukan sekuens
consensus dri beberapa sekuens sejajar untuk analisis lebih lanjut dan juga
menghasilkan informasi lebih banyak dibandingkan analisis satu sekuens saja.
3. Berapa kisaran panjang urutan primer yang direkomendasikan? Apakah primer-primer
tersebut masuk ke dalam kategori primer yang baik? Jelaskan jawaban kalian!
=18-30 bp. Ya, karena primer2 tersbt memenuhi ciri/syarat primer yang baik. Syarat
primer yang baik yaitu memiliki panjang berkisar antara 18 30 basa. Primer dengan
panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas primer rendah sehingga
memungkinkan terjadinya mispriming.Kandungan GC yang ideal dalam primer
adalah sekitar 50%. Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai
ganda DNA terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer
akan berpengaruh di dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Suhu optimalnya
berkisar antara 50 0C sampai 60 0C. Selain itu, juga tidak boleh terjadi self
dimmer,pair dimmer, atau hairpin (Roche diagnostics 2006 : 41).
4. Berdasarkan hasil pengukuran beberapa parameter, primer mana yang menurut kalian
adalah primer yang baik? Jelaskan karakter-karakter hasil pengukuran yang
mendukung hal tersebut!
= Primer ke 3.
5. Berdasarkan data pada Tabel 5., hal apakah yang membedakan dengan data pada
Tabel 4.? Jelaskan mengapa hal tersebut dapat terjadi!

6. Berdasarkan desain primer yang kalian pilih, bagaimana kalian menjelaskan apakah
primer tersebut spesifik atau tidak?
Modul 1. In Silico (Desain Primer)

7. Berdasarkan hasil simulasi PCR, bagaimana hasil reaksi PCR yang kalian lakukan?
Jelaskan perbedaan antara Ta dan Tm!

Halaman 5 dari 5
Praktikum Biologi Molekuler (Departemen Biologi FMIPA UI) Tahun 2017