LAPORAN PRAKTIKUM BIOINFORMATIKA

DESIGN PICK PRIMER MENGGUNAKAN PRIMER3PLUS, PRIMERQUEST DAN PERLPRIMER

Nama NIM

: Baital Izzatul Badriyah : 0910910001

Tanggal Praktikum : 29 Maret 2012

LABORATORIUM BIOLOGI KOMPUTASI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

BAB III METODE PRAKTIKUM

3.1

Waktu dan Tempat Praktikum Bioinformatika yang berjudul Design Pick Primer Menggunakan Primer3Plus,

PrimerQuest dan PerlPrimer ini dilaksanakan hari Kamis, 29 Maret 2012, pukul 15.10-17.00 WIB dan bertempat di Laboratorium Biologi Komputasi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.

3.2

Cara Kerja 3.2.1 Design Pick Primer Menggunakan Primer 3 Plus Langkah-langkah membut design pick primer menggunakan Primer3Plus, yaitu diketikan keyword primer3plus pada jendela browsing Google>search, atau dapat pula diakses melalui www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus.cgi.

Selanjutnya akan muncul kotak dialog seperti pada kotak dialog berikut. -

Untuk memulai mendesain primer dengan Primer3Plus ini, dapat dilakukan dengan cara mengcopy format FASTA sekuens nukleotida dari spesies yang diinginkan (dalam hal ini digunakan sekuens nukleotida S. purpuratus late histone H1-

beta gene, complete cds) ke dalam paste source sequence below, seperti yang terlihat pada kotak dialog berikut.

Dicopy

Sekuens dalam format FASTA yang telah dicopy dari genebank NCBI, kemudian dipaste pada kolom yang telah tersedia pada Primer3Plus. Selanjutnya, ditentukan beberapa parameter yang dibutuhkan terutama daerah target yang ingin diamplifikasi, dimana primer (forward maupun reverse) harus mengapit daerah ini; excluded region yang merupakan daerah dimana primer tidak boleh menempel; serta included region yagmana kedua primer harus berada di dalam daerah ini. Langkah-langkah ini dapat dilihat pada kotak dialog berikut.

Dapat juga mengupload sekuens menggunakan ini

Ditentukan target yang diinginkan

Dipaste sekuens FASTA dari NCBI Pengaturan daerah penempelan primer

Agar diperoleh primer yang memenuhi kriteria yang baik dan benar dan dapat digunakan dalam PCR, maka perlu dilakukan pengaturan terhadap primer yag ingin dihasilkan yaitu dengan mengklik General Setting, selanjutnya dilakukan pengaturan yang meliputi ukuran primer, Tm, %GC, dll, seperti yang tampak pada kotak dialog berikut.

3.2.2 -

Design Pick Primer Menggunakan PrimerQuest

Design primer untuk PCR juga dapat dilakukan menggunakan PrimerQuest. Langkahlangkah membut design pick primer menggunakan PrimerQuest, yaitu diketikan keyword primerquest pada jendela browsing Google>search, atau dapat pula diakses melalui eu.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/default.aspx, maka selanjutnya akan muncul kotak dialog seperti berikut. Pada halama tersebut dimasukkan kode pada NCBI ID dari sekuens yang ingin didesign primernya, selanjutnya diklik Get Sequence.

Setelah sekuens nukleotid dimasukkan ke dalam kolom yang sudah disediakan pada PrimerQuest, maka selanjutnya ditentukan design primer sesuai dengan kebutuhan pada Design for dan Use Parameter Set > diklik calculate, seperti yang terihat pada kotak dialog berikut.

Dipilih sesuai dengan dengan design yang diinginkan

Hasil yang muncul setelah dilakukan beberapa langkah dalam prosedur yang telah dijelaskan diatas, maka pada jendela PrimerQuest akan muncul hasil dari design primer dari sekuens yang ingin dibuat design primernya (dalam hal ini digunakan sekuens nukleotida dari S. purpuratus late histone H1-beta gene, complete cds. Pada

pasangan-pasangan primer yang telah diperoleh dari pengaturan awal yang dilakukan, selanjutnya diklik Set Detail untuk mengetahui letak forward primer maupun reverse primer pada sekuens nukleotida spesies yang digunakan. Selain dapat diketahui secara detail mengenai letak forward maupun reverse primer, dapat pula diketahui terjadinya hairpin pada pasangan primer tersebut dengan cara diklik Hairpin, baik pada forward primer maupun reverse primer. Langkah-langkah dalam melaksanakan prosedur ini dapat dilihat pada kotak dialog berikut.

Pasangan primer 1

Pasangan primer 2

Pasangan primer 3

Pasangan primer 4

Pasangan primer 5

Melalui PrimerQuest dalam membuat design primer, dapat pula dilihat BLAST dari sekuens referensi yag dipilih (dalam hal ini S. purpuratus late histone H1-

beta gene, complete cds.). Secara otomatis, PrimerQuest dapat tesambung dengan genebank NCBI untuk menampilkan BLAST dari sekuens referensi tersebut.

3.2.3

Design Pick Primer Menggunakan Perl Primer Langkah-

- Design primer untuk PCR juga dapat dilakukan menggunakan PerlPrimer.

langkah membut design pick primer menggunakan Perl Primer, yaitu dibuka software PerlPrimer, maka selanjutnya akan muncul kotak dialog seperti berikut. Pada halaman

tersebut dimasukkan format FASTA dari sekuens referensi dalam hal ini digunakan (S. purpuratus late histone H1-beta gene, complete cds). Selanjutnya, dilakukan pengaturan primer yang ingin dibuat, meliputi Primer Tm, Primer Lenght, dst., seperti yang terlihat pada kotak dialog berikut.

Sekuens referensi yang ingin dibuat primernya

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Design Pick Primer Menggunakan Primer3Plus Berdasarkan design pick primer menggunakan Primer3Plus, dengan memasukkan

sekuens referensi suatu spesies yang diambil dari NCBI, maka diperoleh beberapa design primer (dalam hal ini diperoleh 5 pasang design primer) yang dapat dilihat pada kotak dialog berikut.

Pasangan primer 1

Forward primer

Reverse primer

Forward primer
Amplikon

Reverse primer

Berdasarkan pada pasangan primer 1 yang ditampilkan dalam kotak dialog pada halaman sebelumnya dapat diketahui bahwa, forward primer dari pasangan primer 1 memiliki panjang nukleotida sebanyak 21 bp, suhu melting Tm 58.70C, %GC 42.9%, ANY 4.0, serta self complementarity 2.0. Forward primer ini kurang memenuhi kriteria sebagai primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, hal ini dapat dilihat dari panjang nukleotida yang berada diantara 18-22 bp, namun memiliki Tm di bawah 60-650C, serta %GC di bawah 45-60%. Reverse primer dari pasangan primer 1 ini memilki panjag nukleotida sebanyak 20bp, Tm 61.40C, %GC 50.0%, ANY 7.0, serta self complementarity 3.0. Reverse primer ini telah memenuhi kriteria sebagai primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, hal ini dapat dilihat dari panjang nukleotida yang berada diantara 18-22 bp, Tm diantara 60-650C, serta %GC diantara 45-60%. Selain informasi mengenai pasangan primer 1 yang dijelaskan secara detail, dapat diketahui pula informasi mengenai pasangan primer lain yang dihasilkan dari design primer yang diperoleh dari sekuens nukleotida yang diinginkan untuk dibuat

primernya. Informasi secara rinci dari pasangan-pasangan primer dapat dilihat pada kotakkotak dialog berikut.
Pasangan primer 2

Pasangan primer 3

Pasangan primer 4

Pasangan primer 5

3.2.1

Design Pick Primer Menggunakan Perl Primer

Primer3Plus memiliki beberapa kelebihan, diantaranya memiliki tampilan yang sangat sederhana, namun kemampuannya sudah teruji dan digunakan oleh banyak peneliti di seluruh dunia (Science Biotech, 2012). Primer3Plus juga memberikan beberapa alternatif pasangan primer yang dapat dipilih (Rybicky, 2001)

4.2

Design Pick Primer Menggunakan PrimerQuest Design primer dengan menggunakan PrimerQuest juga tidak jauh berbeda dengan design

primer yang diperoleh menggunakan Primer3Plus, namun pada PrimerQuest informasi yang disajikan lebih lengkap dibandingkan pada Primer3Plus. PrimerQuest menyajikan informasi mengenai terjadinya Hairpin pada pasangan primer yang diperoleh dari hasil design primer yang telah dilakukan.

Kotak dialog di atas menunjukkan informasi umum mengenai pasangan primer yang dihasilkan. Berdasarkan informasi yang ditampilkan, dapat dilihat kode sekuens pada Sequence Name, yaitu ACC M20314.1; tanggal dilakukan design primer; serta panjang nukleotida dari sekuens yang dijadikan referensi (dalam hal ini digunakan S.

purpuratus late histone H1-beta gene, complete cds.), yaitu sebanyak 1698 bp yang dapat dilihat pula pada grafik yang ditampilkan dibawahnya (ditunjukkan oleh garis tebal berwarna hijau, yang artinya garis hijau tersebut termasuk dalam Included Region).

Letak forward dan reverse primer pada sekuens

Pasangan primer 1

Berdasarkan hasil design primer menggunakan PrimerQuest yang ditampilkan pada kotak dialog di atas dapat diketahui bahwa, forward primer pasangan primer 1 memiliki panjang sekuens 24 bp, start kodon terletak pada basa ke-700, Tm sebesar 59.90C, %GC 50.0%, dst. Berdasarkan syarat primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, dapat dilihat bahwa forward primer pasangan primer 1 tersebut kurang memenuhi syarat primer yang benar karena memiliki panjang primer yang lebih dari panjang primer yang baik, yaitu antara 18-22 bp. Selain itu, forward primer tersebut juga memiliki Tm dibawah batas primer yang baik, yaitu antara 60-650C, namun primer tersebut memiliki %GC yang memenuhi syarat pembuatan primer yang baik, yaitu berada diantara 45-60%. Informasi lain yang dapat diperoleh yaitu mengenai reverse primer pasangan primer 1 yang menunjukkan primer ini dimulai dari basa ke1367, memilki panjang primer sebanyak 24 bp, Tm (Melting Temperature) 59.80C, %GC 50.0%, dst. Berdasarkan syarat primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, dapat dilihat bahwa reverse primer pasangan primer 1 tersebut juga kurang memenuhi syarat primer yang benar karena memiliki panjang primer yang lebih dari panjang primer yang baik, yaitu antara 18-22 bp, memiliki Tm dibawah batas primer yang baik, yaitu antara 60-650C, namun primer tersebut memiliki %GC yang memenuhi syarat pembuatan primer yang baik, yaitu berada diantara 45-60%. Selain informasi yang telah dijelaskan di atas dapat diketahui pula informasi mengenai produk hasil PCR yang diperoleh jika menggunkan pasangan primer yang telah diperoleh dari hasil desain, seperti yang terlihat pada kotak dialog di atasmengenai pasangan primer 1 yang menghasilkan produk sebanyak 668 bp. Informasi secara detail dari pasangan-pasangan primer lain yang diperoleh dari penggunaan PrimerQuest dalam mendesain primer dapat dilihat pada kotak-kotak dialog yang ditampilkan berikut.

Letak forward dan reverse primer pada sekuens

Pasangan primer 2

Letak forward dan reverse primer pada sekuens

Pasangan primer 3

Letak forward dan reverse primer pada sekuens

Pasangan primer 4

Letak forward dan reverse primer pada sekuens

Pasangan primer 5

Setelah diklik pada Set Detail pada pasangan primer yang ingin diketahui informasi lebih terperinci baik forward maupun reverse primer, maka akan diperoleh informasi letak baik forward maupun reverse primer pada sekuens referensi yang dirujuk untuk dibuat primernya, hal ini dapat dilihat pada kotak dialog berikut.

Forward primer pasangan primer 1

Amplicon

Reverse primer pasangan primer 1

Selain informasi lebih detail mengenai letak forward maupun reverse primer dari pasangan primer 1 seperti yang telah ditampilakan pada kotak dialog di atas, dapat pula diketahui terjadinya hairpin pada primer yang dihasilkan dari design menggunakan PrimerQuest, hal ini dapat dilihat pada kotak dialog berikut.

Berdasarkan kotak dialog di atas dapat diketahui bahwa, forward primer pasangan primer 1 memiliki dua struktur hairpin yang dapat terjadi pada primer tersebut. Hal ini dapat disebabkan karena primer ini tidak sepenuhnya memenuhi syarat pembuatan design primer yang baik dan benar, sehingga saat menempel pada sekuens template akan mengalami 2 bentuk haipin, seperti yang terlihat pada kotak-kotak dialog di bawah ini.

Struktur hairpin I forward primer 1

Struktur hairpin II forward primer 1

Struktur hairpin reverse primer 1

Menurut Clark (2005) hairpins terbentuk akibat interaksi intramolekuler primer sehingga membentuk semacam lipatan. Biasa nya hairpin ujung 3 dengan G-2 kcal/mol dan hairpin internal dengan G -3 kcal/mol masih dapat ditoleransi.G atau energi bebas Gibbs adalah ukuran jumlah kerja yang dapat diekstrak dari sebuah proses yang terjadi pada tekanan tetap. Ini merupakan ukuran kespontanan reaksi. Stabilitas hairpin biasanya direpresentasikan oleh nilai G-nya, yaitu energi yang diperlukan untuk mengurai struktur sekunder. Semakin negatif nilai G maka semakin stabil ia, tentu tidak kita inginkan. Adanya hairpin pada ujung 3 sangat mempengaruhi reaksi.

4.3

Design Pick Primer Menggunakan Perl Primer Design primer dengan menggunakan Perl Primer juga tidak jauh berbeda dengan design

primer yang diperoleh menggunakan Primer3Plus dan PrimerQuest. Perl Primer menyajikan informasi yang lebih detail dibandingkan pada Primer3Plus, namun PerlPrimer ini masih lebih sulit dalam pengaturan pembuatan design primer yang diinginkan. Pasangan primer yang diperoleh dari design primer menggunakan PerlPrimer ini dapat dilihat pada kotak dialog berikut.

Primer yang diperoleh dari sekuens referensi

Jumlah primer yang dihasilkan

Berdasarkan kotak dialog yang disajikan di atas dapat diketahui primer-primer yang diperoleh dari hasil design primer menggunakan perlprimer. Selain itu, jumlah primer yang diperoleh juga dapat dilihat pada bagian bawah kotak dialog di atas yang ditunjuk oleh tanda panah merah, yaitu sebanyak 208 pasangan primer.

Forward primer

Reverse primer

Dimer pasangan primer 1

Berdasarkan hasil design primer menggunakan PerlPrimer yang ditunjukkan pada kotak dialog sebelumnya dapat dilihat informasi mengenai primer yang diperoleh, baik forward primer

maupun reverse. Pasangan primer yang baik ditunjukkan oleh munculnya tanda None saat diklik dua kali pada pasangan primer. Jika pada kolom Dimer ditunjukkan pasangan primer yang mengalami dimer. PerlPrimer memiliki beberapa kelebihan, yaitu merupakan software yang dapat diguanakn untuk mendesain secara mudah dan otomatis primer untuk standard PCR, bisulphite PCR, real-time PCR (QPCR) dan sekuensing, software yang yang dikembangkan dengan bahasa Perl dan Perl/TK untuk tampilannya sehingga bisa dijalankan di MacOSX, Linux dan Windows, saat ini versi terakhir dari PerlPrimer adalah 1.1.17. Proses insatalasi PerlPrimer ini tergantung sistem operasi yang digunakan, PerlPrimer menyediakan paket instalasi untuk sistem operasi Mac, Linux dan Windows dengan proses intalasi yang tidak rumit, paket instalasi bisa di unduh disini (Science Biotech, 2012). Kelebihan lain yang dimiliki oleh PerlPrimer, yaitu dapat menghitung kemungkinan primer dimmers yang terbentuk, dapat mendownload langsung sekuen genom atau cDNA dari Ensembl, dapat langsung melakukan BLAST ke server NCBI atau server lokal (Mullis, 1993). Hasil dari desain perimer dapat di simpan, atau di eksport ke format tab-delimited sehingga bisa dibuka oleh aplikasi spreadsheet standar (OpenOffice, Microsoft Office) (David, 2005).

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan Setelah dilakukan praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, ketiga jenis media atau software yang digunakan untuk mendesain primer, yaitu Primer3Plus, PrimerQuest maupun perlPrimer memiliki kelebihan dan kelemahan masing-masing. Diantara ketiga jenis software yang digunakan, PrimerQuest merupakan media online yang memiliki kelebihan yang lebih banyak dalam membuat design primer. PrimerQuest menyediakan fitur yang dapat menunjukkan informasi yang lebih banyak mengenai primer yang diperoleh dari hasil design primer (misalnya struktur haipins) dibandingkan dengan kedua software lainnya, yaitu Primer3plus dan PerlPrimer.

5.2 Saran Praktikum telah berjalan dengan lancar, namun sebaiknya saat dilakukan tentoring kelompok, semua anggota kelompok diberi kesempatan untuk melakukan tentoring. Sehingga, semua anggota kelompok memiliki pengalaman yang sama dalam menjelaskan suatu program di depan kelas praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Clark, D. P. 2005. Molecular Biology : Understanding the Genetic Evolution . California: Elsevier Inc. David, N. G. 2005. Molecular Technique Lecture Note 2005. http://www.biotech ubc.ca. Diakses tanggal 1 April 2012 Mullis. 1993. DNA & PCR. http:// www. science-projects.com /onionDNA.htm. Diakses tanggal 27 Maret 2012 Rybicky, E. 2001. PCR Primer Design and Reaction Optimalization.http://www.

meb.vct.ac.2a/ed.htm. Diakses tanggal 1 April 2012 Science Biotech. 2012. Yuk Mendesain Primer Dengan PerlPrimer. http://sciencebiotech.net/ yuk-mendesain-primer-dengan-perlprimer/. Diakses tanggal 1 April 2012 Science Biotech. 2012. Yuk Mendesain Primer Dengan Primer3Plus. http://sciencebiotech.net/ yuk-mendesain-primer-dengan-primer3plus/. Diakses tanggal 1 April 2012