LAPORAN PRAKTIKUM

BIOINFORMATIKA

ACARA 3
DESAIN PRIMER SECARA ONLINE

Disusun oleh:
Nama : Septiani Nurcahyanti
NIM : 24020221140090
Kelas : Bioteknologi B
Kelompok :2
Nama asisten : M. Alif Rifqi Alamsyah

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2023
I. Tujuan
I.1 Mahasiswa mampu mendesain primer secara in silico menggunakan database
NCBI dan Primer3Plus

II. Tinjauan Pustaka

II.1Pengertian Primer
Primer merupakan suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25
basa,nukleotida) yang berfungsi untuk mengawali sintesis rantai DNA dalam
reaksi berantai polimerase. Keberhasilan suatu proses PCR sangat ditentukan oleh
komposisi primer. Untuk mendapatkan primer dapat dilakukan dengan cara
melakukan desain primer. Desain primer dapat diperoleh dengan menggunakan
bantuan software bioinformatik. Software akan secara otomatis menentukan
primer yang layak pada suatu sekuens. Namun tidak semua hasil pemilihan primer
secara otomatis sesuai dengan harapan, sehingga diperlukan campur tangan secara
manual. Dalam mendesain suatu primer perlu diperhatikan beberapa hal,
diantaranya adalah spesifisitas, panjang primer 18-30 bp, kadungan GC masing-
masing primer harus berada dalam kisaran 40-60%. suhu leleh (Tm) optimal
berkisar 52-58°C, peniadaan basa Timin (T) pada 3’-end. Selanjutnya perlu
diketahui apakah primer tidak tumpang tidih dengan primer lainnya dalam
campuran reaksi, karena ini akan mendorong pembentukan primer dimer. Untuk
memudahkan proses optimasi perlu digunakan perangkat lunak khusus (Putri,
2019).
II.2Fungsi Primer
Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang
digunakan. Di dalam proses PCR. Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen
DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-
OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Primer juga
berfungsi untuk menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang
diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Primer yang merupakan nukleotida
pendek berukuran 19-21 basa yang diperlukan sebagai titik pelekatan enzim
polymerase DNA pada proses pembentukan atau pemanjangan DNA suatu gen
spesifik secara in vitro melalui teknik PCR. Perancangan primer dapat dilakukan
berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang
dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank.
Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka
perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan
DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang
terdekat (Putri, 2019).

II.3Peran Primer dalam PCR

 PCR adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro
yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) serta terjadi duplikasi
jumlah target DNA untai ganda pada setiap siklusnya. Prinsip dari teknik PCR
adalah memperbanyak bagian spesifik dengan enzim DNA polimerase yang
diinisiasi oleh pelekatan primer dengan menghubungkan deoksiribonukleotida
trifosfat (dNTP) dalam reaksi termal. Komponen- komponen yang diperlukan
pada proses PCR adalah template DNA; sepasang primer, yaitu suatu
oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer
dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide trifosfat);
buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA. Primer
mempengaruhi spesifitas dan sensitivitas reaksi PCR. Rancangan suatu primer
merupakan salah satu parameter penentu keberhasilan suatu proses PCR. Primer
berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi
sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan
untuk proses eksistensi DNA. Rancangan primer yang kurang baik menyebabkan
reaksi PCR tidak bekerja dengan baik sehingga menyebabkan produk PCR yang
tidak spesifik dan atau terbentuknya primer dimer. Perancangan primer dapat
dilakukan dengan membuat desain menggunakan software “primer3”
(Yustinadewi, 2018).
II.4Ciri-ciri primer yang ideal
Secara umum, primer yang ideal memiliki panjang antara 18 sampai 30
oligonukleotida. Panjang ini diharapkan cukup untuk dapat mengikat template
pada suhu annealing dan mendapatkan sekuen yang spesifik. Jika primer terlalu
pendek maka dapat mengurangi spesifisitas primer sehingga mudah menempel
pada template dengan suhu annealing yang tidak diinginkan. Sedangkan jika
primer terlalu panjang tidak mempengaruhi spesifisitas secara bermakna. Primer
yang baik merupakan primer yang memenuhi kriteria parameter primer.
Parameter tersebut antara lain: melting temperature (Tm), persentase jumlah G
dan C (%GC), 3′dimer, stabilitas, repeats, dan hairpins (Wirajana, 2013).
Primer yang baik adalah primer yang memenuhi kriteria parameter primer.
Parameter primer tersebut meliputi panjang primer, temperature melting (Tm),
ikatan di ujung 3’, dan kandungan GC, dengan memperhatikan hal-hal tersebut
maka bisa didapatkan primer yang ideal. Primer yang ideal adalah primer yang
panjang basanya berkisar antara 18-30 pasang basa. Primer yang baik adalah
primer yang memiliki selisih Tm sekitar 5⁰C. Hal tersebut bertujuan agar tidak
terjadinya penurunan pada proses amplifikasi. Persentase antara basa G dan C
juga harus diperhatikan, karena kandungan jumlah basa GC dapat mempengaruhi
Tm yang dimiliki oleh suatu primer. Primer yang ideal adalah primer yang
memiliki persentase GC sekitar 40-60% (Wahyuni, 2019).
III. Metode
III.1 Alat
1. Alat tulis
2. Buku catatan
3. Buku penuntun praktikum
4. Pc dengan akses internet
3.2 Bahan
1. NCBI
2. Template sequence
3. Primer3Plus
4. SnapGene
3.3 Cara Kerja
3.3.1. Desain Primer Menggunakan Database NCB
1. 1. Buka web NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
2. Ubah pencarian hanya fokus pada database nukleotida
3. Tulis nama sekuen yang ingin dicari (contoh: S aureus 18S rRNA/Apium
graveolens Interntal Transcribed Spacer (ITS)/B subtilis cellulase gene)
4. Pilih sekuen yang akan digunakan
5. Pilih fitur “Pick primer” 6. Beberapa pengaturan yang dapat dilakukan
yaitu ukuran primer, ukuran produk, dan Tm
7. Ubah pengaturan Database dan Organism pada bagian Primer Specificity
Cheking Parameter dengan pilihan RefSeq RNA (refseq_rna) dan
masukan famili organisme yang dipilih dalam pilihan organism
8. Dapatlan primer dengan menekan Get Primer
9. Pilih Primer yang akan digunakan dengan menganalisisnya sesuai dengan
kriteria primer yang idea
3.3.2 Desain Primer Menggunakan Database Primer3Plus
1. Buka web NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
2. Ubah pencarian hanya fokus pada database nukleotida
3. Tulis nama sekuen yang ingin dicari (contoh: S aureus 18S rRNA/Apium
graveolens Interntal Transcribed Spacer (ITS)/B subtilis cellulase gene)
4. Pilih sekuen yang akan digunakan
5. Unduh sekuen menggunakan format FASTA (Fast Alignment)
6. Buka web Primer3Plus (https://www.primer3plus.com/)
7. Masukan sekuen nukleotida dengan cara paste atau upload file
8. Pengaturan untuk mendapatkan primer yang ideal dapat d pada menu
general settings (Ukuran primer, %GC, dan Tm)
9. Tekan pick primer untuk mendapatkan opsi primer 10. Pilih Primer yang
akan digunakan dengan menganalisisnya sesuai dengan kriteria primer yang
ide.
IV. Hasil Pengamatan
 Nama
Jumlah Primer
No. Template Screenshot Hasil
Pair yang didapat
Sequence
1. 10 primer pair
Salmonella typhi 
DNA
gyrase A subunit 
(gyrA) gene,
partial cds

(Dok. Pribadi, 2023)

2. 10 primer pair
Salmonella typhi 
DNA
gyrase A subunit 
(gyrA) gene,
partial cds

(Dok. Pribadi, 2023)

V. Pembahasan
Praktikum Bioinformatika dengan judul praktikum acara III Desain Primer Online
yang dilaksanakan secara luring atau offline pada hari Kamis, 16 Maret 2023 pada
pukul 10.00 WIB sampai selesai di Laboratorium Komputer Fakultas Sains dan
Matematika, Universitas Diponegoro. Praktikum ini bertujuan mahasiswa mampu
mendesain primer secara in silico menggunakan database NCBI dan Primer3Plus.
Alat yang digunakan dalam acara ini praktikum ini adalah Pc dengan akses internet,
alat tulis kerja (atk), buku penuntun praktikum. Kemudian bahan yang digunakan
adalah NCBI, Template sequence, Primer3Plus, dan SnapGene. Dan tujuan praktikum
adalah ahasiswa mampu mendesain primer secara in silico menggunakan database
NCBI dan Primer3Plus
V.1Definisi primer
Primer DNA adalah sekuens DNA yang komplemen terhadap sekuens
yang akan diamplifikasi, terutama dalam reaksi berantai polimerase (PCR)
Batasannya, primer ini akan menempel pada kedua ujung sekuens DNA yang
ingin diamplifikasi dengan arah yang berkebalikan (utas sense dan antisense).
Dalam suatu reaksi berantai polimerase digunakan dua primer, yaitu primer maju
dan primer mundur. Kedua primer ini harus ada dalam reaksi polimerasi agar
amplifikasi DNA terjadi. Molekul primer dapat berupa molekul DNA, RNA, atau
bahkan protein spesifik. Biasanya, primer yang digunakan pada PCR adalah
molekul DNA. Pada akhir proses PCR akan terdapat sejumlah besar fragmen-
fragmen pendek DNA hasil amplifikasi. Setelah dilakukan amplifikasi, terdapat
berbagai cara untuk melihat hasilnya. Salah satu diantaranya adalah elektroforesis
gel. Hal ini selaras dengan pendapat Riupassa (2019) bahwa Primer merupakan
nukleotida pendek berukuran 12-20 basa yang diperlukan sebagai titik pelekatan
enzim polimerase DNA pada proses pembentukan atau pemanjangan DNA suatu
gen spesifik secara in vitro melalui teknik reaksi rantai polimerisasi (polymerase
chain reaction, PCR). Teknik PCR ditemukan secara tidak sengaja oleh Kary
Mullis pada tahun 1989. Sebelum penemuan tersebut, para ahli telah mengetahui
bahwa penggandaan materi genetik dapat terjadi di dalam tubuh (in-vivo) dan
merupakan mekanisme yang umum. Namun, penemuan tersebut membuktikan
bahwa reaksi polimerisasi DNA dapat juga terjadi di dalam tabung (in-vitro).
Implementasi teknik PCR pada polimerisasi gen sukrosa sintase membutuhkan
teknik perancangan primer yang tepat sehingga menghasilkan primer spesifik
untuk deteksi gen.
V.2Penjelasan desain primer
Primer Design atau Desain Primer adalah
Perusahaan Bioteknologi Berbasis Di Inggris Yang Merancang Dan Menjual
Produk Untuk Reaksi Berantai Polimerase Real-Time Kuantitatif (Qpcr). Primer
Design Didirikan Pada Tahun 2005 Oleh Dr Jim Wicks, Dr Rob Powell
Dan Profesor Tom Brown Di University Of Southampton Untuk Fokus Pada
Kimia PCR Dan DNA .  Hal ini selaras dengan pernyataan Pani (2022) bahwa
desain primer merupakan tahap awal untuk amplifikasi DNA, sehingga dapat
digunakan untuk menganalisis sampel menggunakan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR). Desain primer yang baik dilakukan secara in silico, yaitu dengan
 basis ilmu bioinformatika. Pada PCR, primer berfungsi untuk berhibridisasi
dengan cetakan DNA serta sebagai pembatas daerah yang akan diamplifikasi.
V.3Cara kerja desain primer online pada NCBI
Cara kerja atau langkah untuk mendesain primer menggunakan website
NCBI dilakukan dengan cara membuka laman NCBI melalui webiste
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Kemudian ganti opsi dari All Database menjadi
In silico. Selanjutnya masukan nama organisme pada kolom pencarian, tekan
search. Pilih sekuens dengan jumlah base pair yang tidak terlalu besar. Klik Pick
Primers. Kemudian pada bagian Primer Pair Specificity Checking Parameters
ubah menu Database yang sebelumnya Refseq mRNA menjadi Refseq RNA
(refseq_rna). Masukan nama famili dari organisme yang dipilih ke kolom
Organism. Klik Get Primers. Pilih primer terbaik dengan mempertimbangkan
syarat-syarat primer ideal. Selanjutnya untuk mendownload urutan sekuens DNA
dalam format FASTA dengan mengklik Send to, pilih jenis destinasi File, ganti
format dari GenBank menjadi FASTA, klik Create File. Hal ini selaras dengan
percobaan Syahputra (2017) bahwa mendesain primer menggunakan situs NCBI
dilakukan dengan mengakses website https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Contohnya
dengan mencari sekuens nukleotida gen tetB Bacillus subtilis yang diidapatkan
dengan cara mencari pada database National Center for Biotechnology
Information (NCBI) pada situs https://www.ncbi.nlm.nih.gov/menggunakan
penelusuran di kotak pencaharian denagn kata kunci yaitu tetB Bacillus subtilis.
V.4Cara kerja desain primer online menggunakan primer3plus
Cara kerja atau langkah untuk mendesain primer menggunakan menggunakan
Primer3Plus dilakukan dengan cara membuka website
https://www.Primer3Plus.com/. Kemudian pilih Choose File, lalu masukkan
urutan sekuens DNA yang di download dari NCBI dalam format FASTA, klik
Pick Primers. Selanjutnya dihitung jumlah primer pair dan pilih primer pair yang
terbaik dengan mengklik opsi Next Primer Pair dan Previous Primer Pair. Hal
tersebut sependapat dengan percobaan Syahputra (2017) dalam merancang desain
primer online menggunakan software Primer3Plus dapat diakses melalui website
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/Primer3Plus/Primer3Plus.cgi/. Langkah-
langkah dengan cara sekuens nukleotida yang telah didapatkan di NCBI, disalin
bagian “FASTA” dan dianalisis pemilihan kandidat primer forward dan reverse
dengan menggunakan situs Primer3Plus, khususnya menggunakan alamat pada
website http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/Primer3Plus/Primer3Plus.cgi/.
Hasil yang akan didapatkan yaitu 5 kandidat primer forward dan reverse dengan
susunan basa nukleotida yang berbeda-beda.
V.5Salmonella typhi
Salmonella typhi adalah biang keladi utama penyakit ini. Bakteri ini
mudah menyebar melalui air dan makanan yang terkontaminasi. Saat bakteri
 mulai menginfeksi tubuh, pengidap mengalami demam tinggi, sakit kepala, sakit
perut, dan kehilangan nafsu makan.  Umumnya, salmonella mudah sekali
menyebar melalui air dan makanan yang terkontaminasi. Hal ini selaras dengan
pernyataan Adhuri (2018) bahwa Salmonella typhi (S. typhi) merupakan kuman
pathogen penyebab demam tifoid, yaitu suatu penyakit infeksi sistemik dengan
gambaran demam yang berlangsung lama, adanya baktermia disertai inflamasi
yang dapat merusak usus dan organ-organ hati. Morfologi dan struktur
Salmonella typhi merupakan kuman batang gram negatif, yang tidak memiliki
spora,bergerak dengan flagel peritrik, bersifat intraseluler fakultatif dan anerob
fakultatif. Ukurannya berkisar antara 0,7- 1,5X 2-5 pm,memiliki antigen somatik
(O), antigen flagel (H) dengan 2 fase dan antigen kapsul (Vi). S. typhi mampu
bertahan hidup selama beberapa bulan sampai setahun jika melekat dalam, tinja,
mentega, susu, keju dan air beku. S. typhi adalah parasit intraseluler fakultatif,
yang dapat hidup dalam makrofag dan menyebabkan gejala-gejala gastrointestinal
hanya pada akhir perjalanan penyakit, biasanya sesudah demam yang lama,
bakteremia dan akhirnya lokalisasi infeksi dalam jaringan limfoid submukosa
usus kecil.
V.6Primer Pair Salmonella typhi
Berdasarkan percobaan yang sudah dilakukan dalam mendesain primer
pada NCBI, didapatkan 10 primer pair. Dari ke 10 primer pair terdapat primer
yang paling bagus adalah primer ke-6. Hal ini terjadi dikarenakan GC content
pada primer ke-6 didapatkan sebesar 55%, dengan panjang basa 20 bp, nilai Tm
pada primer forward dan reversenya berturut-turut sebesar 60,11 dan 59,82, serta
Self 3’ complementary 0. Kemudian pada desain primer di Primer3Plus terdapat
juga primer yang bagus yang ditemukan pada primer ke-4. Panjang primer yang
didapatkan baik pada primer forward dan reversenya secara berturut-turut yaitu 20
bp dan 21 bp. GC content pada primer tersebut berkisar 50% dan nilai Tmnya
didapatkan sebesar 57,3oC dan 59,5 oC. Hal ini selaras dengan pendapat Sasmito
(2019) bahwa primer yang baik memiliki panjang primer yang baik berkisar 18-
30 bp, dengan GC content yang berkisar antara 40-60%, serta memiliki self
3’complementarity yang rendah. Hal ini mempunyai tujuan agar tidak terjadi
penempelan antar pasangan primer dan membentuk struktur yang disebut hairpin.
V.7Hal-hal yang harus diperhatikan saat pemilihan primer +ref
Dalam pemilihan primer terdapat hal-hal yang perlu diperhatikan. Hal-hal
yang diperhatikan seperti Tm terlalu rendah maupun terlalu tinggi dapat
 menyebabkan terjadinya mispriming yang dikarenakan suhu annealing dengan
Tm dan spesifitas produk menurun. GC(%) menjadi kriteria yang sangat penting
dalam hal yang harus diperhatikan saat Pemilihan primer sehingga dapat
menggunakan persen basa G dan C antara 40% hingga 60%. Hal ini selaras
dengan pendapat Ahda (2021) bahwa hal-hal yang harus diperhatikan dalam
perancangan atau pemilihan primer diantaranya adalah panjang primer,
temperature melting (Tm), kandungan GC dan ikatan di ujung 3’. Primer yang
baik memiliki panjang antara 18-30 nukleotida. Primer dengan panjang yang
kurang dari 18 nukleotida akan membuat penempelan primer menjadi tidak
spesifik. Karakteristik kedua yang perlu diperhatikan dalam pemilihan primer
adalah Tm. Primer yang baik memiliki selisih Tm sekitar 5°C antara primer
forward dan primer reverse. Hal ini dimaksudkan untuk memudahkan penentuan
suhu annealing. Persentase kandungan basa G dan C juga perlu diperhatikan
karena dapat mempengaruhi Tm primer.

VI. Kesimpulan
 Berdasarkan hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa primer merupakan
nukleotida pendek berukuran 12-20 basa yang diperlukan sebagai titik pelekatan
enzim polimerase DNA pada proses pembentukan atau pemanjangan DNA suatu gen
spesifik secara in vitro melalui teknik reaksi rantai polimerisasi (polymerase chain
reaction, PCR). Primer mempunyai dua fungsi yaitu pertama untuk menentukan batas
sekuen DNA yang akan diamplifikasi dan mengawali sintesis rantai DNA, fungsi
kedua untuk menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk
proses eksistensi DNA. Dalam mendesain primer digunakan dua database berupa
NCBI dan Primer3Plus. Primer terbaik yang didapatkan dari database NCBI adalah
primer ke-6, sementara pada Primer3Plus, yaitu primer ke-4. Parameter dalam
menentukan primer yang ideal meliputi Melting Temperature (Tm), Annealing
Temperature (Ta), GC content, GC clamp, dan selisih melting temperature.

DAFTAR PUSTAKA
Adhuri, I. K., Kristina, T. N., dan Antari, A. L. 2018. Perbedaan Potensi Antibakteri Bawang
Putih Tunggal Dengan Bawang Putih Majemuk Terhadap Salmonella Typhi. Jurnal
Kedokteran Diponegoro, 7(2): 415-423.
Mardini, I., Zahrani, A., Pane, E. R., dan Wijayanti, F. 2022. Desain Primer Gen Cytochrome
Oxidase Subunit I (Cox1) Secara in Silico Untuk Mengidentifikasi Cemaran Daging Babi
(Sus Scrofa). Jurnal Nasional Sains dan Teknologi Terapan 5(1): 364-375.
Pradnyaniti, D. G., Wirajana, I. N., & Yowani, S. C. 2013. Desain primer secara in silico untuk
amplifikasi fragmen gen rpoB Mycobacterium tuberculosis dengan polymerase chain
reaction (PCR). Jurnal Farmasi Udayana, 2(3): 279-788.
Pranata, Ahda. 2021. Desain Primer Untuk Identifikasi Gen Luciferase Pada Kunang-Kunang
Genus Lamprigera (Lampyridae: Coeloptera). Jurnal Biologi, 1(2): 1739-1747.
Putri, D. H., & Wahyuni, W. 2019. Primer Design For Identification Of Beta-Carotene Encoding
Genes In Cassava. Jurnal Serambi Biologi, 4(1): 39-47.
Riupassa, P. A. (2009). Perancangan Primer Oligonukleotida untuk Polimerisasi in Vitro Gen
Sukrosa Sintase. Majalah Ilmiah Biologi (Biosfera): A Scientific Journal, 26(3): 131-137.
Saraswati, H., Seprianto, S., dan Wahyuni, F. D. 2019. Desain Primer Secara In Silico Untuk
Amplifikasi Gen cryiii Dari Bacillus thuringiensis Isolat Lokal. Indonesian Journal of
Biotechnology and Biodiversity, 3(1), 33-38.
Sasmito. 2014. Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing
DNA: Mini Review. Jurnal Informatika Medis, 1(2): 93-102.
Syaputra (2017). Desain Primer Spesifik Gen Tetb (Tetracycline Resistance Protein) Bakteri
Bacillus Subtilis. Jurnal Mahasiswa Farmasi Fakultas Kedokteran Untan, 4(1): 1-11.
Yustinadewi, P. D., Yustiantara, P. S., & Narayani, I. 2018. Teknik Perancangan Primer Untuk
Sekuen Gen Mdr-1 Varian 1199 Pada Sampel Buffy Coat Pasien Anak Dengan Lla Mdr-1
Gene 1199 Variant Primer Design Techniques In Pediatric Patient Buffy Coat Samples With
Lla. Jurnal Metamorfosa 5(1): 105-111.

LEMBAR PENGESAHAN
 Semarang, 03 Mei 2023
Mengetahui,
Asisten Praktikan

Muhammad Alif Rifqi Alamsyah Septiani Nurcahyanti

NIM. 24020220140062 NIM. 24020221140090