BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dewasa ini, perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya dalam
bidang bioteknologi dan biologi molekuler berlangsung sangat pesat. Berawal
dari terungkapnya struktur dan fungsi DNA (Deoxyribonucleic acid) oleh
Francis Crick pada tahun 1958, kemudian disusul dengan ditemukannya
enzim restriksi, pembuatan pustaka gen berdasarkan situs restriksi, cloning
sekuen DNA pada organisme prokaryot, penggunaan berbagai macam penanda
DNA (DNA marker) sampai akhirnya sintesis dan penggandaan DNA secara in
vitro serta sekuen genom dan analisisnya.
Pada tahun 1985, Kary Mullis menemukan suatu teknik yang mampu
mensintesis dan menggandakan DNA secara in vitro dalam waktu relatif
singkat dengan bantuan enzim DNA polymerase dan beberapa bahan pokok
lainnya. Teknik ini dinamakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Berkat
karyanya tersebut, Kary Mullis mendapatkan hadiah Nobel dalam bidang Kimia
pada tahun 1993.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian latar belakang di atas, maka permasalahan yang akan
dibahas dalam makalah ini adalah sebagai berikut:
1. Bagaimanakah definisi dan tujuan PCR dan DNA Sequencing?
2. Bagaimana mekanisme kerja PCR ?
3. Bagaimana manfaat PCR dalam Bioteknologi?

1.3 Tujuan
Tujuan yang ingin dicapai dalam pembuatan makalah ini adalah sebagai
berikut:
1. Memahami tentang definisi dan tujuan PCR dan DNA Sequencing
2. Memahami tentang mekanisme kerja PCR dan DNA Sequencing

Bioteknologi Kelompok II (PCR dan Sequencing ) 1

 3. Memahami tentang manfaat PCR dan DNA Sequencing dalam
Bioteknologi

Bioteknologi Kelompok II (PCR dan Sequencing ) 2

 BAB 2
PEMBAHASAN

2.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

a. Definisi

Reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah

suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu
sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro (Yuwono, 2006:1)
Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu
sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu
sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang
diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer , yaitu suatu sekuen
oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA
dalam reaksi berantai polimerase.

b. Prinsip dasar
Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan, yaitu
fragmen DNA yang akan dilipatgndakan; (2) Oligonukleotida primer, yaitu
suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang digunakan
untuk mengawali sintesis rantai DNA; (3) Deoksiribonukleotida trifosfat
(dNTP), yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP dan dTTP; (4) Enzim DNA
polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA,
selain itu komponen lain yang juga penting dalam PCR adalah senyawa buffer.
Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA, dimulai dengan melakukan
denaturasi DNA cetakan (template) sehingga rantai DNA yang berantai ganda
(double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded).
Denaturasi DNA dilakukan dengn menggunakan panas (95°C) selama 1-2
menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55°C sehingga primer akan menempel
(annealing) pada DNA cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal.
Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen

Bioteknologi Kelompok II (PCR dan Sequencing ) 3

yang komplementer dengan sekuen primer. Suhu 55°C yang digunakan untuk
penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih
efisien jika dilakukan pada suhu lebih rendah (37°C), tetapi biasanya akan terjadi
mispriming yaitu penempelan primer pada tempat yang salah. Primer yang
digunakan dalam PCR ada dua, yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen
yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5'-fosfat dan
oligonukleotida yang identik dengan sekuen pada ujung 3'-OH rantai DNA
cetakan yang lain. Proses annealing biasnya dilakukan selama 1-2 menit.
Setelah proses annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan,
suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72°C selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA
polimerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan
informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA
yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai
ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan
dengan rantai DNA baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi degan
menaikkan suhu inkubasi menjadi 95°C. Rantai DNA yang baru tersebut
selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi polimerasi brikutnya.
Reaksi-reaksi yang terjadi diatas, diulangi lagi sampai 25-30 kali
(siklus)sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai
ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak
dibandingkan dengan jumlah cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus
amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target didalam campuran reaks.
Paling tidak diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopi sekuen DNA
target di dalam DNA genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung
misalnya dengan elektroforesis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya
konsentrasi DNA polimerase Taq menjadi terbatas setelah 25-30 siklus amplifikasi
(Sambrook et al., dalam Yuwono, 2006:3)
Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang
baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan
pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR
akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial.

Bioteknologi Kelompok II (PCR dan Sequencing ) 4

 Gambar 1. Proses amplifikasi DNA target (Sumber : Yusuf, 2010:3)

c. Jenis-jenis teknik PCR

1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), metode ini
digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model
derifat dari perbedaan DNA
2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal
yang diketahui. Template didigesti dengan enzim restriksi yang
memotong bagian luar daerah yang akan diamplifikasi, fragmen restriksi
juta copy
yang dihasilkan ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi dengan
menggunakan sekuen primer yang memiliki titik ujung yang memiliki
jarak yang jauh satu sama lain dengan segmen eksternal yang telah
tergabung. Metode ini khusus digunakan untuk mengidentifikasi ”sekuen
antara” dari beragam gen.
3. Nested- PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi
pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan.
Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set kedua

Bioteknologi Kelompok II (PCR dan Sequencing ) 5

 mengamplifikasi target kedua selama proses pertama berlangsung. Sekuens
DNA target dari satu set primer yang disebut primer inner disimpan di antara
sekuens target set kedua dari primer yang disebut sebagai outer primer. Pada
prakteknya, reaksi pertama dari PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi
PCR kedua dilakukan dengan inner primer atau nested primer menggunakan
hasil dari produk reaksi yang pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer
akan menyatu dengan produk PCR yang pertama dan menghasilkan produk
yang lebih pendek daripada produk yang pertama.
4. Quantitative-PCR, digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil
produk PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk
mengukur kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil
dari metode ini juga menampilkan copy dari sampel.

2.2 DNA Sequencing

Bioteknologi Kelompok II (PCR dan Sequencing ) 6

 BAB 3
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
.

3.2. Saran

Teknik PCR dapat diaplikasikan diantaranya untuk: Isolasi dan penggandaan

fragmen DNA dari gen tertentu, penggandaan DNA untuk cloning,
penggandaan cDNA, diagnosa kelainan genetik, infeksi penyakit, jenis
kelamin, penggunaan marker DNA dan merupakan tahapan kerja dalam
sekuensing. Oleh sebab itu, teknik PCR ini dapat dimanfaatkan dalam
bidang-bidang : Biologi Molekuler dan Bioteknologi
, Pertanian, Kehutanan, Peternakan, Perikanan Kelautan, Kedokteran,
Industri dan Lingkungan

Bioteknologi Kelompok II (PCR dan Sequencing ) 7