ISOLASI DNA : Konsep, Prinsip dan Penerapan

Isvana Dalaila
(0402518014)

Jurusan Pendidikan IPA Konsentrasi Biologi

Pascasarjana UNNES

Abstrak

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diiosolasi untuk berbagai
macam keperluan DNA rekombinan atau rekayasa genetika. Isolasi DNA merupakan
proses memperoleh DNA yang diinginkan dalam suatu sel. Prinsip dasar dalam
melakukan isolasi yaitu memecahkan dinding sel, dan memisahkan DNA dari kompenen
yang tidak diinginkan. Proses isolasi DNA membutuhkan preparasi sampel untuk
mendapatkan DNA dengan kualitas yang baik, hal ini dikarenakan hasil isolasi DNA
digunakan untuk berbagai analisis molekuler maupun genetik. Kemurnian dan kualitan
DNA yang tinggi sangat penting untuk analisis lanjutan. Ulasan dalam artikel ini
membahas konsep, prinsip dan penerapan dalam teknik isolasi DNA.

Keyword: isolasi DNA, lisis, pemisahan DNA, modifikasi teknik dan bahan

Pendahuluan

Penemuan struktur DNA yang diperkasai oleh James D.watson dan Francis H. Crik
pada tahun 1953 membuka jalan perkembangan ilmu dalam bidang molekuler.
Perkembangan ilmu biologi molekuler sangat pesat seiring dengan perkembangan
teknologi. Cabang ilmu biologi molekuler berkaitan dengan cabang ilmu lain seperti
evolusi, genetika, biologi sel, biokimia, mikrobiologi dan bioteknologi. Seperti proses
evolusi yang terjadi tidak sepenuhnya karena seleksi alam akibat perubahan lingkungan
namun dipengaruhi juga oleh perubahan di tingkat seluler maupun molekuler dalam
penentuan filogenetis suatu populasi organisme (Fatchiyah, 2011). Biologi molekuler
merupakan cabang ilmu yang mempelajari Biologi pada tingkat molekul, khususnya
mengenai asam nukleat serta hal-hal lainnya yang berkaitan dalam peranannya sebagai
pembawa informasi hereditas (Anggraito, 2019). Asam nukleat terdiri dari dua macam
yaitu DNA (deoxyribonucleic acid), dan RNA (ribonucleic acid). DNA adalah polimer
yang sangat panjang yang terdiri dari jutaan nukleotida (Simion, 2018). DNA tersusun

1
dari gugus basa nitrogen, gula deoksiribosa dan fosfat (Anggraito, 2019). Basa nitrogen
terdiri dari dua pasangan basa yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas
adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin
terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin tunggal. Nukleotida
akan membentuk ikatan fosfodiester, dan menjadi fosfofat deoksiribosa (Simion, 2018).

DNA yang terdapat pada nukleus disebut dengan DNA kromosomal, sedangkan
DNA lain yang terdapat di dalam sel dan diluar nukleus berupa mitokondria, kloroplas
dan plasmid disebut DNA ekstrakromosomal yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas
dan DNA plasmid (Fatchiyah, 2011). Dalam bidang kedokteran, teknologi kloning
bakteri yang dapat menghasilkan hormon insulin dan vaksin merupakan hasil dari
rekayasa genetika. Teknologi rekayasa genetika atau teknologi DNA rekombinan
didefinisikan sebagai pembentukan gen baru melalui proses penyisipan gen asing dengan
teknik laboratorium (Anggraito, 2019). Dalam rekayasa genetika memiliki komponen-
komponen yang diperlukan yaitu : (a) molekul DNA target yang akan disisipkan, (b)
vektor yang akan membawa gen atau DNA target masuk ke dalam sel inang, (c) enzim
restriksi yang`berfungsi memotong DNA, (d) enzim ligase untuk menyambung DNA
asing dengan DNA sel host atau sel inang. Tahapan awal dalam rekayasa genetika yang
pertama yaitu mengisolasi gen target. Isolasi gen target bertujuan untuk mempeoleh gen
yang menyandi produk yang dinginkan. Dalam mengisolasi gen target memiliki tingkat
kerumitan dikarenakan harus dapat mendeteksi gen yang diinginkan dari sekian banyak
gen yang terdapat pada kromosom. Gen dapat diperoleh dari DNA genom ataupun dari
cDNA (DNA complementary). cDNA merupakan DNA yang dicetak dari mRNA pada
proses transkripsi balik dengan memanfaatkan enzim transkriptase balik yaitu enzim yang
mengkatalis reaksi transkripsi balik RNA utas tunggal menjadi DNA komplemennya,
atau DNA yang dibuat in vitro (Anggraito, 2019). Teknologi analisis DNA dapat
digunakan untuk mendeteksi berbagai penyakit genetik yang disebabkan oleh mutasi
DNA, delesi DNA dan penyakit ganas (Naroen, 2009).

Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA
seperti teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika. DNA dapat diisolasi langsung
dari berbagai macam sel, diantaranya yaitu kultur sel, sel, hewan, sel tumbuhan,

2
mikroorganisme (bakteri, yeast), jaringan tubuh sepeti darah, akar rambut, tulang,
sperma, kayu serta daun pada tumbuhan. Pada organisme tingkat tinggi seperti manusia,
DNA dapat ditemukan pada inti sel juga pada organel mitokondria dan kloroplas. Prinsip
dasar dalam isolasi DNA yaitu menghancurkan dinding sel dan memisahkan DNA dari
komponen-komponen sel yang lain (Anggraito, 2019).

Tahapan menghancurkan dinding sel

Dalam tahapan penghancuran dinding sel, pada sel tanaman memiliki

membran sel dan dinding sel. Membran sel terdiri dari ikatan antara protein dan
lemak, sedangkan dinding sel tersusun atas polisakarida. Dinding sel harus dipecah
untuk mengeluarkan DNA dari dalam sel. Penghancuran sel dapat dilakukan
dengan cara mekanik, kimiawi dan enzimatik (Ferniah, 2013). Proses isolasi DNA
membutuhkan preparasi sampel untuk mendapatkan DNA dengan kualitas yang
baik, hal ini dikarenakan hasil isolasi DNA digunakan untuk berbagai analisis
molekuler maupun genetik.

Gambar 1. Proses ekstraksi DNA

Proses pengeluaran DNA yang diisolasi dari DNA kromosomal atau DNA
ekstrakromosomal dengan cara ekstraksi dilakukan homogenasi menggunakan
penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak
(Rachmayanti, 2008). Secara kimiawi buffer dapat berupa Ethylene Diamine
Tetraacetic (EDTA) yang memiliki fungsi sebagai perusak sel dengan cara
mengikat ion magnesium, dan Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) merupakan detergen
yang berfungsi merusak membran sel. Protein yang terdapat pada sel dan

3
bercambur dengan DNA dapat dihancurkan dan dipisahkan dengan menggunakan
proteinase K dan fenol. Kemungkinan jika terdapat polisakarida dapat dibersihkan
dengan menggunakan senyawa kloroform (Anggraito, 2019).

Tahapan pemisahan DNA

Tahapan selanjutnya dalam isolasi DNA yaitu pemisahan DNA dari

komponen-komponen sel yang lain atau kontaminan yang tidak diinginkan.
Pemisahan tersebut dapat berupa debris dilakukan dengan cara sentrifugasi, yatu
pemisahan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal. Kontaminan yang sering ditemukan yaitu polisakarida yang dapat
mengganggu proses lanjutan seperti PCR. Kontaminan lainnya dapat berupa
polifenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA secara kovalen.
Setelah tahapan ekstraksi, tahap selanjutnya dengan presipitasi DNA menggunakan
etanol absolut atau isopropanol, semua bahan akan larut dalam etanol dingin. Maka
saat dilakukan sentrifugasi DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa-
senyawa atau bahan lain. Misalnya pada sampel darah, presipitasi dilakukan dengan
salting-out yaitu supernatan dipisahkan dari protein debris sel dengan pemberian
larutan garam berkonsentrasi tinggi. Biasanya akan diperoleh supernatan DNA
yang kental pada saat dimasukkan ke etanol absolut. Bila hal ini terjadi, siapkan
tabung yang berisi 70%-etanol, kemudian ambil DNA dengan mikropipet 1000 µL,
dan pindahkan ke tabung yang berisi 70%-etanol (Fatchiyah, 2011).

4
 Gambar 2. Proses isolasi DNA dari sampel darah

Isolasi DNA dalam pengerjaannya harus dilakukan dengan hati-hati, karena

DNA sangat mudah rusak oleh enzim DNAse yang terdapat pada kulit, saliva
maupun air mata pemeriksa. Maka selama pengerjaannya harus mengenakan
standar pengamanan laboratorium (Faatih, 2009). Ada beberapa hal yang dapat
terjadi pada proses ekstraksi DNA yaitu DNA patah selama proses isolasi, DNA
terdegradasi oleh enzim nuklease, terjadi kontaminasi oleh polisakarida dan
metabolit sekunder ikut terisolasi. Untuk menghindari terjadinya hal-hal tersebut
maka jaringan yang digunakan dijaga tetap dingin sebelum dan selama proses
ekstraksi. DNA sebagai bahan dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP,
kloning atau sekuensing, pemilihan DNA target yang digunakan harus memiliki
kemurnian tinggi dan memiliki berat molekul yang tinggi pula (Fatchiyah, 2011).

Prosedur isolasi DNA

Berdasarkan prinsip-prinsip dasar dalam isolasi DNA, telah berkembang berbagai

macam prosedur isolasi DNA yang disesuaikan dengan tekhnik dan bahan yang
digunakan. Secara umum teknik preparasi untuk memperoleh isolat DNA dari sampel,
langkah yang dilakukan yaitu (Fatchiyah, 2011):

1. Penghancuran dinding sel atau jaringan yang akan diisolasi DNA nya, seperti sel
darah, kultur sel bakteri, jaringan hewan maupun tumbuhan. Sel-sel dari kultur
sel atau bakteri disentrifugasi pada kecepatan 8000-10.000 rpm selama 10 menit.
Pemecahan dinding bakteri dapat dilakukan secara kimiawi dengan senyawa
seperti EDTA, detergen SDS.
2. Debris sel dipisahkan dari larutan DNA
3. Presipitasi RNA dan protein agar diperoleh DNA yang murni
4. Presipitasi DNA dengan etanol dingin
5. Pemurnian DNA dari ekstrak sel dengan menggunakan salah satu kemikalia
berupa fenol. Permurnnian DNA dari kontaminan protein dapat digunakan
proteinase-K, dan kontaminan RNA dengan menggunakan RNAse
6. Presipitasi DNA akhir dapat dilakukan dengan menggunakan etanol dingin di
bawah kondisi ionik yang kuat, kemudian dilanjutkan dengan pencucian
menggunakan etanol 70%.

5
 7. Langkah selanjutnya yaitu larutankan pelet DNA dengan bufer TE (Tris-HCL
dengan EDTA) atau aquabides steril.
Teknik ekstraksi DNA telah mengalami perkembangan modifikasi yang
disesuaikan dengan teknik dan bahan. Pada dasarnya metode ekstraksi DNA
bertujuan untuk inaktivasi enzim nuklease dan penghampusan kontaminan
sehingga dihasilkan DNA yang murni. Modifikasi teknik yang disesuaikan dengan
bahan biasanya dalam penggunaan larutan buffer atau pelarut organik (Chacon,
2014), seperti pada tabel dibawah ini:

Gambar. 3. Metode ekstraksi DNA

Penerapan modifikasi teknik dan bahan dalam isolasi DNA

Penggunaan metode isolasi memiliki berapa hal yang harus diperhatikan, salah
satunya yaitu berdasarkan jenis dan kondisi spesimen dan jaringan yang akan diisolasi
DNA. Berikut beberapa penerapan metode-metode dalam isolasi DNA.

Isolasi DNA dengan partikel magnetik

Isolasi magnetik adalah aplikasi menggunakan manik-manik magnetik atau

partikel yang secara biologis atau kimiawi dimodifikasi untuk berinteraksi dengan
target spesifik. Prinsip kerjanya yaitu pencampuran partikel magnetik dan larutan
yang mengandung target. Partikel magnet akan mengikt DNA sehingga terpisah
dengan larutannya. Partikel magnet yang digunakan dari golongan mikro magnetik
dan nano partikel dan berjenis monodispersed dan polycharged dalam bentuk

6
produk silika, PVP, TPP dan fosfat. Partikel tersebut dikembangkan dengan sifat
fisiokimia yang disesuaikan dengan media bio-relevannya meliputi ukuran,
morfologi, muatan permukaan dan ketebalan (Haddad, 2016).

Gambar. 4. Partikel magnetik silika, PVP, TPP dan fosfat

Gambar. 5. Proses isolasi DNA dengan metode partikel magnetik

Isolasi DNA serangga Xylophagous dengan metode CTAB-PVP

Isolasi DNA merupakan proses awal dalam tahapan rekayasa genetika. Maka
dibutuhkan isolasi DNA dengan kualitas tinggi. Umumnya isolasi DNA pada
serangga Xylophagous (serangga pemakan kayu) rumit, hal ini dikarenakan
serangga Xylophagous memiliki jumlah konsentrasi fenolat dan tanin tinggi dalam

7
 saluran pencernaan. Prosedur isolasi DNA yang biasa dilakukan yaitu
menggunakan SDS atau proteinase K, namun dalam penggunaanya belum
menghasilkan isolasi DNA berkualitas tinggi. Metode CTAB-PVP digunakan
untuk menghapus semua fenolat. Metode tersebut memiliki kemurnian dan kualitas
DNA yang tinggi dengan analisis PCR amplifikasi (Cortez, 2010).

Kesimpulan

Asam nukleat terdiri dari dua macam yaitu DNA (deoxyribonucleic acid), dan
RNA (ribonucleic acid). DNA adalah polimer yang sangat panjang yang terdiri dari
jutaan nukleotida. DNA memiliki tiga penyusun penting yaitu fosfat, gula pentosa dan
basa nitrogen. Isolasi DNA adalah proses memperoleh DNA dari produk yang dinginkan.
Isolasi DNA merupakan langkah awal dalam tahapan DNA rekombinan atau rekayasa
genetika. Prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu menghancurkan atau lisis dinging sel,
dan memisahkan DNA dari komponen-komponen lain yang lain. Isolasi DNA dapat
diperoleh dari DNA kromosomal dan DNA ekstrakromosomal. Penghancuran dinding sel
dapat dibantu dengan kimiawi berupa EDTA dan SDS, untuk pemisahan komponen-
komponen lain seperti protein dan fenol dengan bantuan proteinase K, untuk polisakarida
dengan kloroform.

Daftar pustaka

Anggaraito, Yustinus Ulung, dan Tuti Widianti. 2019. Bahan Ajar Biologi Molekuler.
Semarang: UNNES

Chacon, Diego., Cortes Lyn R Griffiths. 2014. Methods for Extracting genomic DNA
from whole Blood Samples: Current Prespectives. Journal of Biorepository
Science for Applied Medicine. 4 (2). 1-9

Cortez, Nancy Calderon., Mauricio Quesada, Horacio Cano-Camacho and Guadalupe

Zavala-Parmo. 2010. A Simple and Rapid Method for DNA Isolation From
Xylophagous Insects. International Journal of Molecular Sciences. 11. 5056-
5064

Faatih, Mukhlissul. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Publikasi Ilmiah UMS.
10 (1)

8
Fatchiyah, Estri Laras Arumingtyas, Sri Widyarti dan Sri Rahayu. 2011. Biologi
Molekuler Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Penerbit Erlangga

Ferniah, Rejeki Siti., dan Sri Pujiyanto. 2013. Optimalisasi Isolasi DNA Cabai (Capsicum
annuum L.) Berdasarkan Perbedaan Kualitas dan Kuantitas Daun Serta Teknik
Penggerusan. BIOMA. 156 (1). 14-19

Haddad, yazan., Kledi Xhaxhiu, Pavel Kopel, David Hynek, Ondrej Zitka, and Vojtech
Adam. 2016. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An
Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. International
Journal of Molecular Sciences. MDPI 17, 550

Nasroen, Saskia L., Ani Melani Maskoen and Agus Nurwaidh. 2009. Optimalization of
DNA Isolation from Oral Epithelial Mucous Cell with Smear Method.
Padjajaran Journal of Dentistry. 21 (3). 160-165

Rachmayanti, Yanti., Ludger Leinemann., Oliver Gailing, and Reiner Finkeldey. 2008.
DNA from Processed and Unprocessed Wood: Factors Influencing the Isolation
Success. J. Forensic Science International ScienceDirect ELSEVIER Genetics.
3. 185-192

Simion, Tariku. 2018. DNA Replication. J. Engineering & Bioscience. Curr Trends
Biomedical Eng & Biosciences. Vol.16 (4)