MAKALAH BIOTEKNOLOGI

NORTHERN BLOT

Disusun oleh:

Ghaasiyah larasat (132210101021)

Istiyam (132210101051)
Sulfiati (132210101053)
Intan nur s (132210101065)
Syafi Mirza (132210101084)
Friska wira (132210101095)
Laili Nurul Didik Saputri (132210101103)
Irine Aulia (132210101105)
Desi Wulandari (142210101092)
Vivi Dwi Rahayu (142210101112)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2016

Page | 1
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan hidayah-Nya yang
telah diberikan kepada penulis, sehingga dapat menyelesaikan makalah yang berjudul
Northern Blot ini sesuai dengan yang direncanakan.
Penyusunan makalah ini digunakan untuk melengkapi tugas mata kuliah
Bioteknologi. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan
makalah ini. Oleh karena itu, semua bentuk saran dan kritik yang membangun
senantiasa penulis harapkan.
Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada bu Endah Pupitasari, S.Farm.,
M.Sc., Apt. dan pihak-pihak yang memberikan bantuan baik secara langsung mapun
tidak langsung selama proses penyusunan makalah ini.
Akhirnya, penulis berharap semoga penyusunan makalah ini banyak membawa
manfaat bagi pihak-pihak yang terkait.

Jember, 14 Maret 2016

Penulis

Page | 2
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ..................................................................................................................i

KATA PENGANTAR ..............................................................................................................ii

DAFTAR ISI ............................................................................................................................iii

BAB I. PENDAHULUAN ...........................................................................................................1

1.1 Latar Belakang ......................................................................................................................1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................................................2

1.3 Tujuan ..................................................................................................................................2

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................................3

2.1 Deskripsi Bltting .................................................................................................................. 3

2.1.1Macam-macam Blotting...................................................................................................... 3

2.2 Perbedaan Masing-Masing Blotting ................................................................................... 6

BAB III. PEMBAHASAN ........................................................................................................ 8

3.1Deskripsi Northern Blot..........................................................................................................8

3.2Prinsip dan Tujuan Teknik Northern Blot............................................................................... 9

3.3Tata laksana Teknik Northern Blot....................................................................................... 10

BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................................ 16

4.1Kesimpulan.......................................................................................................................... 16

4.2 Saran.......................................................................................................................... 16

DAFTAR PUSTAKA................................................................................................................xvi

Page | 3
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Protein merupakan suatu zat yang terdapat di dalam makanan yang sangat
penting bagi tubuh,karena berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Juga
sebagai sumber asam amino yang mengandung unsur C,H,O dan N yang tidak
dimiliki oleh lemak maupun karbohidrat. Protein memiliki rantai panjang dan dapat
mengalami cross linking. Sehingga protein juga berperan dalam biokatalis suatu
reaksi-reaksi kimia dalam makluk hidup. Berhubungan dengan hal tersebut, jika
terjadi suatu kelainan dalam biokatalis suatu makhluk hidup maka akan terlihat
dengan jelas dengan kelainan proteinnya. Sehingga diperlukan beberapa uji yang
dibutuhkan untuk mengetahuinya. Salah satunya adalah dengan uji Western
Blotting untuk mengetahui jenis dan berat molekul suatu protein. Namun sebelum
dilakukan uji diatas harus diterapkan isolasi protein terhadap sampel yang diambil.
Agar protein murni dari sampel bisa didapat sehingga uji tersebut bisa dilakukan
dengan baik dan benar.
Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk
hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup
(enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa.
Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata,
tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer,
biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya.
Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai
cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa.
Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA,
atau protein ke lembaran tipis atau matriks membran sehingga DNA, RNA, atau
protein tersebut dapat dipisahkan. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan
elektroforesis gel. Blotting terdiri atas berbagai macam diantaranya western blot,
northern blot, dan southern blot. Northern Blot digunakan untuk mempelajari pola
ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara set
sampel yang berbeda dari RNA. Perkembangan bioteknologi ini semakin pesat dan

Page | 4
 semakin cangkih sehingga perlu dipelajari lebih lanjut mengenai bioteknologi,
khususnya dalam bidang kesehatan. Oleh karena itu, metode dan berbagai cara
analisis asam nukleat dan protein dipelajari dan perlu pembahasan lebih lanjut.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan beberapa masalah sebagai
berikut :
1.2.1 Bagaimana pengertian dari analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan
metode Northern Blot?
1.2.2 Bagaimana prinsip dasar analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan
metode Northern Blot?
1.2.3 Bagaimana tata laksana kerja dari metode Northern Blot?
1.2.4 Bagaimana perbedaan metode Northern Blot dengan metode analisis berbasis
asam nukleat dan protein yang lain?
1.3 Tujuan
Berdasarkan rumusan masalah tersebut, dapat dirumuskan beberapa tujuan
sebagai berikut:
1.3.1 Mengetahui pengertian dari analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan
metode Northern Blot.
1.3.2 Mengetahui prinsip dasar analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan
metode Northern Blot.
1.3.3 Mengetahui tata laksana kerja dari metode Northern Blot.
1.3.4 Mengetahui perbedaan metode Northern Blot dengan metode analisis berbasis
asam nukleat dan protein yang lain.

Page | 5
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Blotting

Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, atau
protein ke lembaran tipis atau matriks membran sehingga DNA, RNA, atau protein
tersebut dapat dipisahkan. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis
gel.
Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga
memiliki kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat
hilang selama pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi
kekurangannya yaitu kertas diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula kertas lain, yaitu
iazophenylthioeter (DPT).
Keuntungan teknik blot:
- Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan
lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau
matriks.
- Reagen yang dibutuhkan lebih sedikit.
- Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat
lebih singkat.
- Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum
dianalisis.
- Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode
analisis yang dipakai.
2.2 Macam-macam Teknik Blotting dan Penjelasannya
Southern Blot
Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Teknik ini
mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut.
Caranya yaitu dengan menempatkan gel elektroforesis ke kertas matriks yang
direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi
dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula
beberapa kertas peresap di atasnya. Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan
ke membran, demikian pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas
membran, sementara gelnya diserap oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang

Page | 6
 spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan
DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida.
Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan
ukuran dari fragmen DNA tersebut.

Northern Blot
Northern Blot merupakan teknik yang sama dengan Southern Blot,
namun menggunakan kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA. Dalam proses
ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran
yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan.
Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang
digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili
ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan
jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya
digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang
terjadi dengan mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang
berbeda. Ini adalah salah satu alat yang paling dasar untuk menentukan pada
waktu apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang dinyatakan dalam
jaringan hidup.

Page | 7
 Eastern Blot
Eastern Blot merupakan teknik yang ditemukan oleh Reinhard dan
Malamud (1982), adalah proses transfer bidirectional dengan menggunakan
aliran pelarut protein dari gel ke NC berdasarkan titik isoelektrik. Teknik Timur
blotting adalah untuk mendeteksi modifikasi pasca-translasi protein. Protein
dihapuskan ke PVDF atau membran nitroselulosa yang diperiksa untuk
modifikasi menggunakan substrat tertentu.
Western Blot
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai Western blot
untuk mengikuti teknik Southern blot yang pertama kali ditemukan. Western
blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran.
Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein
yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun
fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip
imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah
pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian
kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara
antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens
yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar
gelap.

2.3 Perbedaan Teknik blothing berdasarkan DNA, RNA, dan Protein

a. Blotting berbasis DNA

Page | 8
 Teknik blotting berbasis DNA menggunakan tenik Southern Blot.Keuntungan
teknik ini adalah selain dapat menunjukkan integrasi gen juga dapat mengetahui
jumlah salinan DNA yang terintegrasi. Analisa Southern Blot dapat digunakan
untuk mengetahui sejumlah salinan gen dan kejadian transformasi yang berbeda
serta membedakan integrasi ekstra kromosomal dan kromosomal. Kelemahan
metode ini adalah membutuhkan DNA dalam jumlah banyak dengan kemurnian
tinggi serta waktu yang lama.
b. Blotting berbasis RNA
Hibridasi Northern merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk identifikasi
dan transkrip RNA. RNA tidak dapat berikatan secara efisien pada membrane,
sehingga pada analisis northern digunakan suatu membrane spesifik dimana RNA
dapat berikatan secara kovalen. Dalam analisis northern , sekuen RNA spesifik
dideteksi menggunakan teknik bloting yaitu RNA ditransfer dari agarose ke
membrane. Hasil bloting dianalisis melalui proses hibridisasi dengan probe RNA.
RNA mempunyai bentuk utas tunggal, sehingga dapat membentuk struktur
sekunder melalui pasangan basa intramolekul, sehingga harus dielektroforasi di
bawah kondisi denaturasi.Denaturasi dilakukan dengan penambahan formaldehid
ke gel maupun loading buffer, atau perlakuan glyoxal dan dimethyl sulfoxide
(DMSO) pada loading buffer.
c. Bloting berbasis protein
Dalam blotting berbasis protein teknik analysis yang digunakan adalah western
blot yang merupakan metode untuk mendeteksi DNA-binding protein. Dalam
metode ini protein dipisahkan dengan elektroforesis dan ditransfer ke suatu
membrane sehingga protein akan terikat secara kovalen. Perinsip dasar western
blot adalah identifikasi pemisahan protein tidak berlabel dengan SDS gel
elektroforesis polyacrylamide (PAGE) yang didasarkan pada
immunoradioaktivitasnya dengan menggunakan antibody monoclonal. Kemudian
protein ditransferke membaran dan diberi perlakuan awal untuk mereduksi ikatan
non spesifik dari antiserum ke membrane. Inkubasi membrane dilakukan denagn
antiserum spesifik, kemudian diinkubasi dengan antibody yang berkonjugasi
dengan reagen pendeteksi dan berikatan pada antiserum primer. Setelah itu

Page | 9
 diikuti deteksi dari immunoreaksi diantara antiserum primer dan target protein
spesifik.

Page | 10
 BAB III

PEMBAHASAN

3.1 Pengertian Northern Blot

Northern Blot merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui

konstruksi RNA yang mempunyai barat molekul lebih basar. Analisa dilakukan dengan
cara isolasi RNA dari jaringan yang mempunyai ekspresi gen yang paling tinggi. Untuk
mendapatkan RNA dilakukan dengan denaturasi protein oleh guanidinium
isothiocyanat. Elektroforesis RNA dilakukan dengan gel agarose atau ditreatment
dengan Dimethylsulfoxide (DMSO) kemudian ditransfer pada nitroselulosa atau
saringan nilon ,dan selanjutnya sama dengan pengamatan pada Southern Blot Analysis.
Pembanding yang digunakan primer yang mengadung jumlah, struktur dan rataan dari
sintesis RNA S1 nuklease.
Blot utara digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu
molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA.
Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel, dan sebuah
noda. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke
membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan.
Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang
digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA
terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target
dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari
kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak
bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu alat yang paling
dasar untuk menentukan pada waktu apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang
dinyatakan dalam jaringan hidup.

Page | 11
3.2 Prinsip dan Tujuan Teknik Northern Blot

Northern blot adalah suatu teknik untuk mendapatkan informasi mengenai

identitas, ukuran dan kelimpaham RNA. Prinsip Nothern blot adalah memisahkan RNA
berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membrane menggunakan probe hibridisasi
dengan urutan basa komplementer untuk semua atau sebagian dari urutan basa mRNA
target.
Teknik ini pada dasarnya hibridisasi asam nukleat, perbedaannya pada RNA
sebagai target. Probe sama dengan southern blot dengan target adalah mRNA. Didalam
eukariot pemilihan mRNA lebih efisien karena genomic DNA tidak mempunyai intron
yang mungkin interference yang mengikat probe untuk mengoreksi sekuen. Dasarnya,
teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak menggunakan
perlakuan denaturasi dengan asam kuat. Tahapan yang digunakan dalam metode ini
yaitu: pemisahan mRNA dengan elektroforesis, dipindahkan kedalam membrane nylon
dan diinkubasi dengan probe yang utas tunggal. Probe yang sebelumnya dilabel dengan
biotin atau digoxigenin atau radioaktif. Membran kemudian diperlihatkan difilem atau
substrad kromegenic. Variasi dari hibridisasi nortnblot adalah dengan teknik blot titik
dimana sampel tidak diseparasi berdasarkan ukuran. Melalui teknik ini mudah
dilakukan hanya dengan membrane ditetesi dengn mRNA dan probe. Sepertihalnya
sourthern blot DNA harus dibuat utas tunggal sebelum dblot. Sebelum ditetesi dengan
DNA sampel maka probe terlebih dahulu untuk menghibridisasi probe. Kemudian
membrane difisualisasikan di filem. Jika probe dan DNA atau RNA target mirip maka
filem akan berwarna hitam.

Page | 12
3.3 Tata Laksana Northern Blot
1. Menyiapkan sampel RNA
a. Menambahkan 10-20 g RNA dalam tabung eppendorf steril
b. Menambahkan formamida
Tujuannya adalah formamide akan menurunkan suhu pendinginan dari
interaksi probe-RNA, dan mencegah degradasi RNA oleh suhu tinggi.
c. Menambahkan formaldehyde (2.2 M)
Formaldehida digunakan untuk denaturasi agen RNA untuk membatasi
struktur sekunder
d. Menambahkan MOPS
MOPS adalah buffer yang paling umum digunakan untuk gel RNA karena
kapasitas buffernya pada pH 7,0.
e. Menambahkan pemuat dye
f. Memipet larutan
2. Mengisi sampel dalam sumur dan alat dinyalakan pada 100 volt selama 2
jam.
- Sampel RNA yang paling sering dipisahkan pada gel agarosa adalah sampel
yang mengandung formaldehid yang digunakan sebagai agen denaturasi
untuk RNA untuk membatasi struktur sekunder

3. Visualisasi integritas dari RNA

menggunakan UV atau dengan
pewarnaan EtBr
Gel dapat diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr) dan dilihat di bawah sinar
UV untuk mengamati kualitas dan kuantitas RNA sebelum blotting.

Page | 13
 4. Transfer menuju membrane nilon
Membrane nilon yang paling efektif untuk digunakan dalam northern blotting
adalah yang bermuatan positif karena memiliki afinitas tinggi.
a. Menyiapkan pemindahan RNA

b. Tempatkan pada kertas saring whattman berukuran 3mm

c. Tambahkan buffer
d. Rendam kertas saring tersebut
e. Tempatkan kembali kertas saring yang telah direndam
f. Hilangkan sisa-sisa gelembung udara yang ada

g. Tempatkan gel

h. Tempatkan membrane nilon pada gel

i. Aliri membrane nilon tersebut dengan larutan buffer
j. Hilangkan gelembung-gelembung yang ada

Page | 14
 k. Tutup dengan menggunakan kertas saring whatman berukuran 3mm
l. Tutup pula dengan plastic wrap
m. Tumpuk kertas tersebut dengan menggunakan handuk diatas gel

n. Tunggu hingga semalam

5. Membongkar sistem transfer
a. Pindahkan handuk dan kertas saring
b. Menyiapkan RNA pada membrane nilon menggunakan crosslinker UV

6. Hibridisasi
a. Prehibridisasi membrane dalam prehibridisasi buffer
b. Inkubasi 2-4 jam

Page | 15
 c. Buang prehibridisasi buffer
d. Tambahkan hibridisasi buffer
7. Penambahan probe
Probe dari northern blot tersusun atas asam nukleat dengan sequence lengkap
untuk semua atau bagian dari RNA tertentu, bisa DNA, RNA atau
oligonukleotida dengan 25 basa lengkap untuk target sekuen.
Perlakuan :
a. Inkubasi semalam dalam hibridisasi chamber
b. Setelah inkubasi, buang larutannya
c. Tambahkan larutan yang bersih
d. Inkubasi pada 52C selama 30 menit dalam hibridisasi chamber

e. Pindahkan membrane

Page | 16
 f. Membrane siap di film

BAB IV
KESIMPULAN

Page | 17
 Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan,
RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein
tersebut mengalami imobilisasi. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan
elektroforesis gel. Blotting terdiri atas berbagai macam diantaranya western blot,
northern blot, dan southern blot. Perbedaan dari masing masing Teknik blothing dilihat
berdasarkan DNA, RNA, dan Protein. Southern blot substansi yang dapat dideteksi
DNA dengan pemeriksaan melibatkan asam nukleat dan aplikasi utamanya denagn
struktur gen, Northern blot pemeriksaannnya sama dengan Southern blot yaitu asam
nuklet ,substansi yang dideteksi RNA denagn aplikasi utamnya ekspresi gen, western
blot substansi yang diamati berupa protein dengan melibatkan antibodi dan aplikasi
utamanya jumlah protein, southwestern blot substansi yang dideteksi protein dengan
bantuan DNA menggunakan aplikasi utama berupa interaksi protein-DNA, sedangkan
Farwestern substansi yang dideteksi berupa protein dan aplikasi utamanya deang
menggunakan protein-protein.
Northern Blot merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui
konstruksi RNA yang mempunyai barat molekul lebih basar. Analisa dilakukan dengan
cara isolasi RNA dari jaringan yang mempunyai ekspresi gen yang paling tinggi.
Dasarnya, teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak
menggunakan perlakuan denaturasi dengan asam kuat. Tata laksana pada metode
Northern Blot dengan Menyiapkan sampel RNA, Mengisi sampel dalam sumur dan alat
dinyalakan pada 100 volt selama 2 jam, Visualisasi integritas dari RNA menggunakan
UV atau dengan pewarnaan EtBr, Transfer menuju membrane nilon, Membongkar
sistem transfer, Hibridisasi, Penambahan probe.
SARAN
Adapun saran dari penulis antara lain:
- Seirin denagn perkembangan zaman yang semakin pesat dan teknologi yang
semakin canggih perlu dipelajari lebih dalam mengenai teknologi di bidang
kesehatan, terutama dalam bidang bioteknologi guna memajukan ilmu
pengetahuan di bidang kesehatan .
- Sebagai mahasiswa kesehatan, sebaiknya kita terus mengikuti perkembangan
dunia kesehantan yang semakin maju terutama dalam pbidang bioteknologi
aanalisis berbasis asam nukleat dan protein.

Page | 18
DAFTAR PUSTAKA

- Bondioli,K.R, Biery, KA., Hill, KG., Jones, KB. and De Mayo, F.G., 1991. Production
of Transgenic Cattle by Pronuklear Injection in "Transgenic Animals. pp. 265 -273.
- Brown, T.A.1993. Recombination. In Genetics molecular approach.
Chapman & Hall. London. :207-212
- https://listonsiburian.wordpress.com/2012/03/28/southern-blotting-dan-northern-
blotting/ (diakses tanggal 03 maret 2016)
- http://www.webgentech.org/wgte/dokuman/enb.pdf (diaksese tanggal 03 maret
2016)

Page | 19