NAMA :

 NADA SITI NABILAH ( 061711075 )

 LENI HAYATI ( 061711062 )
KELAS : 17’A2
MATKUL : MIKOLOGI

DIAGNOSA LABORATORIUM MIKOSIS

1) Pewarnaan Histopatologi
Metode : Periodic acid-Schiff (PAS)
 Definisi : pengecetan khusus yang digunakan untuk mendeteksi
keberadaan musin, polisakarida, glikogen, glikoprotein dan glikolipid dalam
jaringan.
 Prinsip Kerja : periodic acid akan mengoksidasi residu glukosa dan
menghasilkan menghasilkan aldehida yang selanjutnya bereaksi dengan
reagen Schiff dan menimbulkan warna magenta-purple
 Prosedur Kerja:
I PERSIAPAN DARAH, SUMSUM TULANG, JARINGAN
Prosedur Standar
1. Tempatkan film darah udara kering selama 1 menit pada suhu kamar di
Formalin-Etanol Solusi Fiksatif
2. Bilas slide selama 1 menit dalam air ledding yang mengalir
3. Benamkan slide dalam larutan asam periodik selama menit pada suhu
kamar
4. Bilas slide dalam beberapa perubahan air suling
5. Benamkan slide dalam Reagen Schiff selama 15 menit pada suhu kamar
6. Cuci slide dalam air leding mengalir selama 5 menit
7. Counterstain dalam Hematoxylin Solution selama 90 detik
8. Bilas slide dalam air leding selama 15-30 detik, keringkan diudara dan
periksa secara mikroskopis dibawah mikroskop dengan minyak imersi
(900x)
9. Slide dapat dipasang di toulene atau media pemasangan berbasis
xylene
Prosedure Mikrowave
1. Pasang film kering udara pada suhu kamar selama 1 menit dalam
Formalin-Ethanol Fixative Solution.
2. Bilas slide selama 1 menit dalam air leding yang mengalir perlahan.
3. Tempatkan slide dalam 40 ml larutan asam periodik yang terkandung
dalam botol plastik Coplin.
4. Microwave pada 800 watt selama 10 detik.
5. Bilas dengan baik dalam beberapa perubahan air deionisasi.
6. Tempatkan slide dalam 40 ml Reagen Schiff yang terkandung dalam
botol plastik Coplin.
 7. Microwave pada 800 watt selama 15 detik. Campurkan larutan dengan
pipet dan biarkan diinkubasi selama 1 menit.
8. Bilas dengan air hangat yang mengalir dengan lembut selama 5 menit.
9. Tempatkan slide dalam 40 ml Hematoxylin Solution Gill No. 3 yang
terkandung dalam plastic Tabung coplin.
10. Microwave pada 800 watt selama 10 detik.
11. Bilas dengan air keran yang mengalir selama 1-2 menit, lalu biru di
Working Scott’s Tap Water pada suhu kamar.
12. Bilas dengan air leding. Biarkan mengering
13. Slide dapat dipasang di media pemasangan berbasis toluena atau
xilena.
II BAGIAN JARINGAN
Prosedur Standar
1. Deparaffinize dan hidrasi bagian ke air deionisasi.
2. Celupkan slide dalam larutan Asam Periodik selama 5 menit pada suhu
kamar (18–26 ° C).
3. Bilas slide dalam beberapa perubahan air suling.
4. Benamkan slide dalam Reagen Schiff selama 15 menit pada suhu kamar
(18–26 ° C).
5. Cuci slide dalam air leding mengalir selama 5 menit.
6. Counterstain slide dalam Hematoxylin Solution, Gill No. 3, selama 90
detik.
7. Bilas slide dalam air leding yang mengalir.
8. Dehidrasi, bersihkan dan pasang bagian dalam media pemasangan
berbasis toluena atau xilena.
Prosedur Microwave
1. Deparaffinize dan hidrat menjadi air deionisasi.
2. Tempatkan slide dalam 40 ml larutan asam periodik yang terkandung
dalam botol plastik Coplin.
3. Tutup wadah dengan tutup longgar, atau gunakan tutup dengan lubang
yang dibor ke dalamnya.
4. Microwave pada 800 watt selama 10 detik.
5. Bilas dengan baik dalam beberapa perubahan air deionisasi.
6. Tempatkan slide dalam 40 ml Reagen Schiff yang terkandung dalam
botol plastik Coplin.
7. Microwave pada 800 watt selama 15 detik. Campurkan larutan dengan
pipet tetap dan biarkan diinkubasi selama 1 menit.
8. Bilas dengan air hangat yang mengalir dengan lembut selama 5 menit.
9. Tempatkan slide di Hematoxylin, Gill No. 3, yang terkandung dalam
botol plastik Coplin.
10. Microwave pada 800 watt selama 10 detik.
11. Bilas dengan air leding mengalir selama 1-2 menit, lalu warnai dengan
Blue's Tap Water Substitute pada suhu kamar. Bilas dengan air leding.
Dehidrasi, bersihkan dan pasang.
 Prosedur Microwave untuk Pencernaan Diastase (a-Amylase)
1. Gunakan slide tes rangkap. Beri label satu untuk pencernaan dengan
diastase dan satu untuk PAS pewarnaan saja.
2. Deparaffinize dan hidrat slide ke air deionisasi.
3. Siapkan Diastase (α-amylase) Solusi Kerja dengan melarutkan 0,2 g α-
Amylase.
4. Microwave pada 600 watt selama 25 detik.
5. Lepaskan slide dari tabung Coplin dan bilas slide yang telah dicerna
dengan air ledeng 5 menit.
6. Dengan menggunakan slide yang dicerna dan yang belum dicerna,
lanjutkan dengan Microwave Prosedur untuk Jaringan, langkah 2.
 Kelebihan :
1. Stabilitas berkepanjang disuhu ruang
2. Hasil cepat dan akurat
3. Gambar yang jelas dan mudah dikenali
 Kekurangan :
1. Reagen dapat menyebabkan iritasi
2. Pewarnaan membutuhkan pelatihan khusus dalam pemilihan yang
sesuai reagen, pemilihan jaringan, fiksasi, pemrosesan, persiapan
slide, dan interpretasi hasil pewarnaan

Metode : Mayer Mucicarmine

 Definisi : pewarnaan empiris, ini digunakan untuk mendeteksi lendir
epitel dan lendir yang mensekresi adendokarsinoma juga digunakan untuk
menunjukan kapsul Crytococcus neoformans dan jamur lainnya. Ketika
diterapkan untuk pewarnaan jamur, itu mewarnai spora dan hifa berwarna
pucat hingga merah terang.
 Prinsip Kerja : alumunium diyakini membentuk kompleks chelation dengan
timin, mengubah molekul menjadi muatan positif yang memungkinkan
mengikat substrat asam dengan kepadatan rendah seperti musin, kebanyakn
musin mengandung glikoprotein dan karenanya dapat dideteksi dengan
pewarnaan untuk karbohidrat.
 Prosedur Kerja:
1. Deparasi bagian jika perlu dan hidrasi ke air suling.
2. Jika bagian telah diperbaiki Zenker, gunakan kristal merkuri klorida
yodium dan jernih dengan natrium tiosulfat. Bilas dengan air leding.
3. Luncuran slide dalam Hematoxylin selama 2-3 menit.
4. Bilas selama 2 menit dalam air leding yang mengalir.
5. Genangi Bluing Reagent selama 10-15 detik.
6. Bilas slide dalam air suling.
7. Siapkan Solusi Mucicarmine yang berfungsi dengan mencampurkan 1
bagian
Mucicarmine dengan 2 bagian air suling. Solusi campuran mungkin
 digunakan selama 30 hari jika disimpan pada suhu 2-8 ° C. Gunakan
solusi kerja sekali dan dibuang.
8. Stain slide dalam larutan Mucicarmine yang berfungsi selama 30-60
menit.
9. Bilas dengan cepat dalam air keran diikuti dengan bilas cepat dalam air
suling.
10. Warnai slide dalam Tartrazine Solution selama 1 menit.
11. Bilas dengan cepat dalam air keran diikuti dengan bilas cepat dalam air
suling.
12. Dehidrasi melalui alkohol bertingkat.
13. Bersihkan, dan pasang resin sintetis.
 Kelebihan :
1. Prosedurnya cepat
2. Mengahsilkan pewarnaan dengan kontras yang baik
 Kekurangan :
1. Reagen dapat menyebabkan iritasi

Metode : Alcian Blue

 Definisi : metode yang digunakan untuk mendiagnosa sel manusia
untuk medis dan melayani pemeriksaan secara histologis dengan bahan
sampel yang berasal dari jaringan tubuh manusia, digunakan untuk mewarnai
polisakarida asam seperti glikosaminoglikan dalam tulang rawan dan struktur
tubuh lainnya. Beberapa jenis mucopolysaccgarides, glikokaliks sialilasi sel dll.
Penggunaan dalam biru alcian secara histologis telah menjadi metode
pewarnaa yang populer dalam histologis terutama untuk mikroskopo cahaya
pada bagian yang ditempelkan parafin.
 Prinsip Kerja : zat warna tembaga phthalcyanin dan mengandung gugus
positif yang dapat mendeteksi hubungan garam dengan polianion. Polyanion
terdiri dari sulfat dan radikal karbosil oleh asam mucin. Kisaran ph larutan
alcian blue berdasarkan jenis asam musin yang ada.
 Prosedur Kerja:
1. Deparasi bagian jika perlu dan hidrasi ke air suling.
2. Inkubasi slide dalam larutan Asam Asetat selama 3 menit.
3. Tetaskan slide dalam larutan Alcian Blue (pH 2.5) selama 30 menit suhu
kamar atau 15 menit pada 37 ° C.
4. Jika diinginkan, bilas slide sebentar dalam larutan Asam Asetat untuk
menghilangkan kelebihan Alcian Blue.
5. Bilas selama 2 menit dalam air leding yang mengalir diikuti dengan 2
perubahan air sulingan.
6. Stain slide dalam Safranin O Solution selama 5 menit.
7. Bilas selama 2 menit dalam air leding yang mengalir diikuti dengan 2
perubahan air sulingan.
8. Dehidrasi melalui alkohol bertingkat.
9. Bersihkan, dan pasang resin sintetis
 Kelebihan :
1. Pengerjaannya mudah
 Kekurangan :
1. Reagen dapat menyebabkan iritasi

Metode : Papanicolaou Stain

 Definisi : Metode pewarnaan yang paling penting digunakan dalam
praktikum sitopatologi, ,etode ini polikromatik yang mengandung banyak
pewarna utnuk komponen sel yang berbeda secara stainvarious.
 Prinsip Kerja : Metode papanicolaou termasuk pewarnaan asam dan absa.
Pewarnaan asam mewarnai komponen dasar sel dan pewarnaan dasar
mewarnai komponen asam sel. PAP polikromatik melibatkan lima pewarnaan
dalam tiga larutan.
 Prosedur Kerja:
1. Tempatkan slide dalam alkohol 95% selama 5 menit.
2. Tempatkan slide dalam alkohol 70% selama 5 menit.
3. Tempatkan slide di air suling selama 2 menit.
4. Terapkan Hematoxylin Mayer Modifikasi yang memadai untuk
sepenuhnya mencakup apusan sel dan inkubasi selama 5 menit.
5. Bilas slide 1 kali dalam air suling untuk menghilangkan noda berlebih.
6. Bilas slide dalam air keran selama 2 menit.
7. Bilas slide dalam 2 perubahan air suling.
8. Celupkan slide beberapa kali dalam alkohol 95% dan hilangkan
kelebihan.
9. Gunakan OG ‐ 6 Stain Solution secukupnya untuk menutupi apusan sel
sepenuhnya berlebih dan inkubasi selama 2 menit.
10. Bilas slide dengan lembut menggunakan alkohol absolut.
11. Oleskan EA ‐ 50 Stain Solution yang memadai untuk menutupi apusan
sel sepenuhnya berlebih dan inkubasi selama 3 menit.
12. Bilas slide dengan lembut menggunakan alkohol absolut.
13. Geser dehidrasi dengan cepat dalam 3 perubahan alkohol absolut.
14. Bersihkan slide dan pasang resin sintetis.
 Kelebihan :
1. Jumlah spesimen mewakili sel-sel dari penyakit yang bersangkutan
 Kekurangan :
1. Reagen dapat menyebabkan iritasi
2. Harus cepat difiksasi karena dapat terjadi artefak akibat pengeringan
udara

Metode Lain : Lactophenol Cotton Blue Stain

 Definisi : Pemasangan media dan pewarnaan digunakan dalam
persiapan slide untuk pemeriksaan mikroskopis jamur. Lactophenol Cotton
Blue Stain diformulasikan dengan lactophenol, yang berfungsi sebagai
 mounting fluid, dan cotton blue. Organisme yang tersuspensi dalam warna
terbunuh karena adanya fenol. Konsentrasi fenol yang tinggi menonaktifkan
enzim sel litik sehingga sel tidak membusuk. Kapas biru adalah pewarna asam
yang mewarnai kitin yang ada di dinding seljamur.
 Prinsip Kerja : The Lactophenol Cotton Blue (LPCB) adalah metode
pewarnaan dan pengamatan jamur yang paling banyak digunakan dan mudah
disiapkan. Sediaan ini memiliki tiga komponen : asam laktat menjaga struktur
jamur dan membersihkan jaringan sementara fenol bertindak sebagai
desinfektan dan cotton blue (kapas biru) memberikan pewarnaan biru pada
spora jamur dan hifa
 Prosedur Kerja:
1. Tambahkan setetes reagen Lactophenol Cotton Blue pada slide yang
bersih dan kering. Pewarnaan akan memberikan warna biru pada hifa.
2. Dengan menggunakan jarum inokulasi, sebarkan kultur jamur dengan
hati-hati ke dalam sediaan tipis
3. Preparat ditutup dengan coverslip. Tunggu sekitar 5 menit.
4. Amati terlebih dahulu di bawah mikroskop dengan daya rendah untuk
screening dalam intensitas rendah.
 Kelebihan :
 Kekurangan :
1. Beberapa spesimen tidak dapat diperiksa langsung menggunakan
pewarnaan ini
2. Untuk melihat karakteristik seperti morfologi koloni dan tes biokimia
harus menggunakan tes tambahan

1) Pemeriksaan Serologi ( Paracoccidioides brasiliensis )

Metode : Immunodiffusion in agar gel (ID)
 Definisi : varian dari reaksi serologis klasik di mana antigen terlarut
dalam medium bening diendapkan dengan penambahan antibodi spesifik.
 Prinsip Kerja : media cairan teknik klasik digantikan oleh gel agar, melalui
mana antigen yang dicurigai dan antibodi yang diketahui berdifusi dari sumur
yang di potong dalam agar agar. Ketika reaktan avid bertemu, reaksi
dimanifestasikan oleh pengembangan garis endapan terlihat di antarmuka.
Spesifisitas reaksi mudah di kontrol dengan menjalankan antigen yang dikenal
secara simultan terhadap antiserum positif yang sama sehingga garis
pengendali hujan terhubung dengan garis uji jika yang terakhir spesifik, yaitu
jika ada garis identitas.
 Prosedur Kerja:
1. Sampel diletakkan diatas objek glass yang ditutup dengan 3 ml gel yang
terdiri dari Agar 1% murni dalam larutan saline (6,9) mengandung
natrium sitrat 0,4% dan glcine 7,5%
2. Tambahkan 12 u antigen yang diletakkan ditengah well dan tambahkan
serum seferensi dan serum pasien sebanyak 12 u disekitar sumur
 3. Slide di inkubasi di ruangan yang lembab pada suhu ruang selama 48
jam
4. Kemudian di cuci dengan saline, dikeringkan dan di warnai dengan
Coomassie brilliant blue R 0,4% dalam campuran ethanol asam asetat
air sebagai pearut
 Kelebihan :
1. Mudah, hanya menggunakan beberapa reagen
2. Spesifik
3. Sensitifitasnya sekitar 95,6%
 Kekurangan :
1. Semi kuantitatif
2. Interpretasi bersifat subjektif

Metode : Latex Agutination Test

 Definisi : Suatu uji untuk mengetahui ikatan antigen- antibodi spesifik
melalui sensitisasi partikel lateks.
 Prinsip Kerja : Reaksi Aglutinasi lateks diamati ketika sampel yang
mengandung antigen spesifik (atau antibodi) dicampur dengan antibodi (atau
antigen) yang dilapisi pada permukaan
 Prosedur Kerja:
Pelapisan lateks
1. Siapkan alat dan bahan
2. Tambahkan 40 µl buffer glisin-salin ke 20 µl lateks yang dibuat dalam
botol 1,5 ml.
3. Tambahkan 60 µl antigen ke lateks
4. Biarkan pada suhu 37̊C selama 2 jam
5. Setelah 2 jam, putar pada 5000 rpm selama 10 menit dan aspirasi
supernatan dengan hati-hati
6. Pasang kembali pelet dalam1 ml buffer blocking dan spindown pada
5000 rpm selama 10 menit.
7. Ulangi pencucian sekali lagi
8. Tambahkan 90 µl buffer ke pelet, aduk rata dan inkubasi pada suhu 4̊C,
semalaman
Tes aglutinasi
1. siapkan alat dan bahan
2. encerkan antiserum tes 50 kali dengan glycine-saline buffer yaitu hinga
200 µl dari buffer glicine-saline tambahkan 4 µl oftest antisera. Catatan
: gunakan antiserum encer ini pada hariyang sama
3. tambahkan 50 µl antigen ke 50 µl antiserum encer dalam botol 1,5 ml.
Aduk rata dan inkubasi pada suhu kamar selama 10 menit
4. pipet 10 µl lateks dilapisi ke piring kaca
5. tambahkan 10 µl antiserum uji encer ke lingkaran pertama
6. tambahkan 10 µl antiserum yang di campur dengan antigen ke
lingkaran ke dua
7. tambahkan 10 µl buffer glisin- salin ke lingkaran ketiga
8. campur masing masing dengan tusuk gigi yang terpisah dan dengan
lembut diaduk dengan tangan
9. lalu diamati adanya tanda-tanda aglutinasi.
Aglutinasi diamati dalam 2 menit sebagai penggumpalan partikel lateks
meninggalakna fase cair bening (penggumpalan). Tidak adanya
glutinasi dilihat sebagai suspensi ahomegenous (susu)
 Kelebihan :
1. Biaya murah
2. Memiliki kemampuan untuk mendapatkan hasil semi kuantitatif
3. Waktu relatif singkat
 Kekurangan :
1. Perlu hati-hati dalam menafsirkan hasil
2. Masalah dengan spesifisitas
Metode Lain : Counterimmunoelectrophoresis (CIE)
 Definisi : CIE adalah tes lain yang digunakan untuk memberikan
diagnosis Paracoccidiomycosis. Seperti dalam tes ID, antigen yang digunakan
bervariasi dari laboratorium ke laboratorium dan mereka adalah ekstrak dari
ragi yang disonikasi suspensi sel. Merupakan modifikasi dari
immunoelektrophoresis dimana antigen dan antibodi bermigrasi ke arah yang
berlawanan dan membentuk endapan putih yang terlihat didaerah antara
sumur.
 Prinsip Kerja : Dalam metode ini, imunopresipitasi terjadi ketika antigen di
katoda disebabkan untuk bermigrasi dalam medan listrik melalui media difusi
yang sesuai terhadap aliran antibodi bermigrasi mundur dari anoda karena
alira endosmotik. Ketika arus listrik diterapkan melalui buffer alkali, molekul
antigen bermuatan negatif bermigrasi ke arah elektroda positif dan karenanya
menuju sumur yang diisi dengan antibodi dan antibodi bermuatan positif
bermigrasi ke arah elektroda negatif. Dibeberapa titik antara sumur, zona
kesetaraan terjadi dan kompleks antigen-antibodi mengendap sebagai garis
putih yang terlihat
 Prosedur Kerja:
1. Siapkan 10 ml agarosa 1,5% (seperti yang diberikan dalam instruksi
penting).
2. Tandai ujung slide yang akan menuju elektroda negatif selama
elektroforesis.
3. Dinginkan solusinya hingga 55-60oC dan tuangkan 6 ml / piring ke atas
piring kaca bebas minyak ditempatkan pada horizontal permukaan.
Biarkan gel diatur selama 30 menit.
4. Tempatkan pelat kaca pada templat yang disediakan.
5. Punch wells dengan bantuan gel puncher yang sesuai dengan tanda
pada template. Gunakan isap lembut untuk menghindari pembentukan
sumur kasar.
6. Tambahkan 10 μl sampel antigen ke dalam sumur yang akan
ditempatkan ke arah elektroda negatif dan 10 μl dari sampel antiserum
ke sumur menuju elektroda positif.
7. Tuang 1X TAE ke dalam tangki elektroforesis sehingga hanya menutupi
gel.
8. Electrophorese pada 80-120 volt dan 55-60 mA, sampai garis precipitin
diamati.
9. Tempatkan piring kaca di ruang yang lembab dan inkubasi semalaman
pada suhu 37°C.
 Kelebihan :
1. Sensitifitas dan Spesifisitas
 Kekurangan :
3) Pemeriksaan Genetik ( Paracoccidioides brasiliensis )
Metode : Peptide Nucleic Acid-Fluorescent In Situ Hybridization
 Definisi : FISH adalah teknik sitogenetik untuk mendeteksi dan
melokalisasi ada atau tidaknya urutan DNA spesifik pada kromosom. PNA
(Peptide Nucleic-Acid) Probe adalah alat yang ideal untuk FISH. Manfaatnya
adalah pengikatan target spesifik, hibridasi pendek
 Prinsip Kerja : Menggabungkan pengamatan mikroskopis dan spesifisitas
hibridisasi DNA/rRNA
 Prosedur Kerja:
Hibridasi PNA Probe
I. Pretreatment
1. Siapkan slide sesuai dengan prosedur yang direkomendasikan untuk
fiksasi. Untuk bagian FFPE, deparaffinisasi menggunakan xelene
diperlukan.
2. Cuci dengan PBS dua kali masing-masing selama 2 menit.
3. (pilihan) tambahkan solusi RNAse dan inkubasi selama 20 menit pada
suhu 37°C pastikan slide tidak mengering
4. (pilihan) rendam slide dalam larutan Pepsin selama 5 menit pada suhu
37°𝐶
5. Cuci dengan PBS dua kali masing-masing selama 2 menit
6. Dehidrasi slide dengan menginkubasi masing-masing 2 menit dalam
70%, 85%, dan 100% Etanol dingin
7. Keringkan diudara
II. Hibridasi
1. Panaskan inkubator hingga 85°𝐶
2. Untuk setiap slide, campur 0,2 ul probe PNA dalam buffer hibridisasi
20 ul hingga konsenterasi 500nM
3. Hangatkan slide dalam inkubator selama 5 menit
4. Panaskan buffer hibridisasi yang mengandung probe PNA pada 85°𝐶
selama 5 menit
5. Letakkan slide pada suhu kamar selama 2 jam dalam gelap untuk
hibridisasi. Gunakan handuk basah untuk mencegah pengeringan
 III. Pencucian
1. Rendam slide dalam larutan Wash untuk menghilangkan kaca
penutup.
2. Cuci slide dalam larutan Wash dua kali pada suhu 55-60°C selama 10
menit.
3. Cuci slide dengan larutan Wash pada suhu kamar.
Counter-Staining dengan DAPI
1. Tambahkan solusi DAPI selama 10 menit
2. Cuci slide dengan 2X SSC, 1X SSC, dan dengan air masing-masing
selama 2 menit.
3. Keringkan slide dengan sentrifugasi cepat.
4. Tambahkan setets media pemasangan dan tutup dengan kaca
penutup. Hindari gelembung udara.
5. Amati dengan mikroskop fluoresensi dengan filter yang sesuai.
 Kelebihan :
1. Hasil dapat diperoleh lebih cepat
2. Lebih spesifik dan sensitif
3. Lebih hemat
 Kekurangan :
1. Harus dibaca secara kualitatif oleh dua pengamat

Metode : PCR-Sequencing
 Definisi : Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik sintesis dan
amplifikasi DNA secara in vitro yang digunakan untuk menyalin segmen DNA
hingga jutaan kali dalam waktu yang cukup singkat
 Prinsip Kerja : Dengan memanfaatkan kode genetik dari sebua DNA sampel
yang akan diuji untuk diamplifikadi jumlanya
 Prosedur Kerja:
Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-
40 siklus dan berlangsung dengan cepat :
1. Denaturasi
Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq
polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA
merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai
tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan
bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal.
Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami
renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini
mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang
 terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas
enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5
menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5oC.
2. Annealing (penempelan primer)
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik
adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung
50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama.
Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya
tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan
terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi
efisiensi PCR.
Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik.
Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran
temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36oC sampai
dengan 72oC, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 –
60oC.
3. Pemanjangan Primer (Extention)
Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya
memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan
nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72oC diperkirakan 35 – 100
nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan
molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan
panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk
tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang
digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh
produk PCR diarapkan terbentuk DNA untai ganda.
Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus) sehingga
pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru
yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak
dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus
amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi
 Kelebihan :
1. Spesifisitas, efisiensi, keakuratan sangat tinggi
 2. Dapat diperoleh penggandaan suatu fragmen DNA sebanyak 200.000
kali setela dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit.
3. Menggunakan komponen dalam jumlah sedikit.
 Kekurangan :
1. Sensitive dapat menyebabkan kesalahan yang tinggi
2. Memerlukan waktu yang lama menyebabkan terjadinya kesalahan
interprestasi
Metode : Nested PCR
 Definisi : Nested PCR adalah modifikasi PCR yang dirancang untuk
menigkatkan sensitivitas dan spesifisitas. Nested PCR melibatkan penggunaan
dua set primer dan dua reaksi PCR berturut-turut. Set primer pertama
dirancang untuk anneal ke urutan hulu dari set kedua primer dan digunakan
dalam reaksi PCR awal
 Prinsip Kerja : Teknik yang mengurangi amplifikasi DNA template yang tidak
spesifik. Setelah reaksi pertama, reaksi kedua dilakukan pada produk PCR
pertama dengan primer yang terikat pada urutan target dan berada dalam
urutan yang diperkuat dari PCR pertama.
 Prosedur Kerja:
Mikroorganisme
1. Isolat fungi di tanam pada agar kentang degan suhu 30°C selama 2
minggu
2. Koloni jamur di larutkan dalam air steril, dibekukan, dan disimpan pada
suhu -20℃
3. Setelah pencairan, 2 x 200 µl suspensi digunakan untuk ekstraksi DNA
Sampel jaringan
1. Tikus BALB/c terinfeksi oleh penanaman indranasal 3 x 106 konidia
P.brasiliensis
2. Paru-paru di keluarkan dari tikus dalam kondisi aseptik, ditimbang dan
homogenisasi dalam 2 ml larutan garam
3. Paru-paru jaringan homogenal secara serial diencerkan dan di salin
dalam rangkap 2 pada agar-agar sabouroud
4. Setelah 30 hari inkubasinpada suhu 18˚C, jaringan di hitung
Ektraksi DNA
1. Untuk 200 ml setiap suspensi jamur atau homogenat paru-paru yang di
cairkan, 180 ml buffer ATL dari kit jaringan dan proteinase K ke
konsentrasi akhir 1 mg ditambahkan
2. Setelah inkubasi pada suhu 55˚C selama setidaknya 3 jam atau
semalam sampel di rebus selama 5 menit, kemudian terkena 3 siklus
pembekuan dalam nitrogen cair selama 1 menit dan rebus selama 5
menit.
3. Setelah pendinginan di kamar suhu, proteinase K ditambahkan lagi ke
konsentrasi akhir 1 mg.
 4. Setelah inkubasi pada 55˚C selama 1 jam, DNA diekresi menggunakan
QIAamp kit jaringan
Desain primer
1. Urutan gp43 yang disimpan dalam genbank disaring untuk primer.
2. Primer bagian luar adalah para l , 59-AAC TAG AAT ATC TCA CTC CCA
GTC C-39 dan para II, 59-TGT AGA CGT TCT TGG G-39 , yang melengkapi
posisi 846 hingga 870 dan 1200 hingga 1176 dari urutan GenBank,
masing-masing mendfinisikan 355- amplikon nukleotida.
Uji PCR
1. campuran reaksi PCR pertama terdiri dari 10 ml DNA ekstrak dalam
volume total 50 ml, dengan konsentrasi akhir 10-mM Tris-HCL (PH 8,3),
50-mM KCI, 2,5 mM MgCl2, konsentrasi 1-mM dari setiap primer dan
konsentrasi 100 mM dari masing-masing deoksinlukeotida pospat.
2. PCR dijalankan di a Thermocycler Primus PCR Tc 9600. Itu produk PCR
dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarosa 1,5 %, diwarnai
dengan etidium bromida, dan divisualisasikan pada transilluminator
UV.
 Kelebihan :
1. Afinitas tinggi
2. Spesifisitas
3. Efisien dalam menembus jaringan karena ukurannya yang kecil
 Kekurangan :
1. Rentan terjadinya reaksi silang dengan jamur lain

DAFTAR PUSTAKA
1. Lactophenol Cotton Blue. S2016. HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.
2. Alcian Blue (pH 2.5) Stain Kit. Catalog Number: KT 003. Diagnostic BioSystems.
3. Pires De Camargo, Zoilo, dkk. Production of Paracoccidioides brasiliensis Exoantigens
for Immunodiffusion Tests. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 1988 26 (10).
2147-2151
4. HiPer® Counter Current Immunoelectrophoresis Teaching Kit. HTI007. HiMedia
Laboratories Pvt. Limited
5. PNA FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). PNA Bio
6. Najvar, Laura, dkk. Detection Of Paracoccidiodes brasiliensis in Tissue Samples by a
Nested PCR Assay. Journal Of Clinical Microbiology. 2000.
7. Mucicarmine Stain Kit. Catalog Number: KT 024. Diagnostic BioSystems.
8. Papanicolaou (PAP) Stain Kit. Catalog Number: KT 038. Diagnostic BioSystems.
9. Pires de Camargo, Zoilo. Serology of paracoccidioidomycosis. Mycopathologia (2008)
165:289–302.
10. 61335 Lactophenol Blue Solution (Lactophenol Cotton Blue Solution, Lactophenol
Aniline Blue Solution). 2013 Sigma-Aldrich Co.LLC.
11. Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System. Procedure No, 395. 2014 Sigma-Aldrich Co.
LLC.