Fiksasi/ Pengawetan untuk Pemeriksaan Histologi

Mengapa fiksasi?

Fiksasi atau pengawetan merupakan proses atau tahapan paling kritis dalam pemeriksaan histologi.
Tujuan utama fiksasi adalah untuk mempertahankan struktur sel seperti aslinya. Proses fiksasi ini harus
segera dilakukan setelah jaringan di ambil atau setelah hewan mati. Fiksas akan mematikan sel secara
cepat, menghentikan proses degenerasi pasca kematian dan mengawetkan integritas struktur komponen
seluler jaringan. Larutan fiksatif bekerja dengan mencegah autolysis dengan menginaktivasi enzim
lisosom sehingga struktur baik luar atau dalam sel tetap terjaga. Makromolekul tidak akan mudah larut
oleh air atau caitan lain. Fiksatif juga mencegah pertumbuhan bakteri dan jamur. Beberapa lemak,
protein, karbohidrat, dan mineral akan terekstraksi dan larut oleh larutan fiksatif. Proses fiksasi akan
mengubah profil antigenic dan kimia protein.

Syarat larutan fiksatif

Larutan fiksatif sebaiknya memiliki kemampuan untuk menginkativasi enzim. Tidak menyebabkan
jaringan membengkak atau mengerut, dan tidak melarutkan bagian dari jaringan.

Larutan fiksatif juga diharapkan mampu memodifikasi jaringan sehingga mampu mempertahankan
jaringan dan menyediakan kondisi dapat dilakukan dehidrasi, clearing dan embedding. Tak kalah penting,
larutan fiksatif juga mampu membunuh bakteri, jamur, dan virus.

Tidak ada larutan fiksatif yang sempurna, meskipun formaldehyde paling mendekati yang terbaik

Secara umum, larutan buffer formalin 10% berfungsi sebagai pengawet jaringan. Namun, untuk jaringan
tertentu seperti kelenjar adrenal, otak, mata, dan struktur khusus, disarankan menggunakan larutan
Bouin’s atau Karnovsky’s. Berdasarkan mekanisme aksinya, ada 5 kelompok larutan fiksatif, aldehida,
merkuri, alcohol, agen oksidasi, pikrat.

· Aldehida, Formaldehyde (formalin) dan glutaraldehyde termasuk dalam kelompok ini. Jaringan
akan diawetkan melalui ikatan silang yang terbentuk dalam protein. Ikatan ini tidak merusak struktur
protein. Buffer digunakan pada larutan ini dengan tujuan mencegah keasaman memicu autolysis dan
menyebabkan presipitasi pigmen formolheme dalam jaringan. Glutaraldehyde membentuk struktur alfa
helix dan memfiksasi secara cepat sehingga cocok digunakan untuk mikroskop electron, meskipun
penetrasinya sangat buruk.

· Merkuri. Proses pengawetan jaringannya tidak diketahui. Larutan ini cukup buruk dan
menyebabkan jaringan mengeras. Hanya baik digunakan untuk jaringan hematopoietic dan
reticuloendothelial.
· Alkohol. Yang termasuk adalah metil alcohol (methanol) dan etil alcohol (etanol). Larutan ini akan
mendenaturasi protein dan tidak direkomendasikan.

· Agen oksidatif . Contohnya adalah permanganate, dikromat, osmium teroxide. Larutan ini mengikat
protein namun menyebabkan denaturasi. Sangat jarang digunakan

· Picrat. Fiksatif yang termasuk kelompok ini adalah asam pikrat seperti larutan Bouin’s.
Mekanismenya kurang diketahui. Hampir sebaik merkuri, membuat nukleus detil dan jaringan terlalu
keras. Larutan ini membuat semua benda menjadi kuning.

Faktor yang mempengaruhi proses fiksasi

Pada proses fiksasi terdapat beberapa hal yang harus diperhatikan, antara lain:

Buffering. Fiksasi paling baik dilakukan pada larutan ber pH netral (6-8). pH akan menyebabkan jaringan
mengalami hypoxia. Oleh karenanya harus ada penyangga untuk mencegah keasaman. Keasaman akan
menyebabkan terbentuknya pigmen formalin-heme yang berwarna hitam, polar, dan terdeposit di
jaringan. Buffer yang sering digunakan adalah phospat, bikarbonat, cacodylate, dan veronal.

Penetrasi. Penetrasi larutan dalam jaringan bergantung pada kemampuan berdifusi tiap larutan fiksatif.
Formalin dan alcohol dapat berpenetrasi dengan baik, sedangkan yang terburuk adalah glutaraldehyde.
Merkuri berada di tengah. Cara untuk mengatasi permasalah ini adalah dengan memotong sampel
menjadi bagian kecil (ketebalan 2-3mm) agar larutan mudah masuk.

Volume. Perbandingan yang umum digunakan untuk fiksasi jaringan adalah 1:10.

Suhu. Peningkatan suhu seiring reaksi kimia akan mempercepat proses fiksasi. Formalin panas akan
memfiksasi lebih cepat.

Konsentrasi. Konsentrasi fiksatif harus diturunkan hingga kadar terendah agar lebih ekonomis. Formalin
umum digunakan 10%, glutaraldehyde dibuat 0,25-4%. Terlalu tinggi konsentrasi akan berdampak pada
jaringan dan membentuk artefak.

Interval waktu. Hal ini berperan penting , makin cepat sampel diambil diawetkan, makin baik. Artefak
akan terbentuk bila kering. Oleh karenanya jaringan jangan dibiarkan kering, tetap disimpan dalam
saline. Makin lama jaringan tidak difiksasi organel sel akan hilang dan nukleus mengerut serta akan ada
artefak yang terbentuk.

Larutan fiksatif yang umum digunakan pada histologi

· Formalin paling sering digunakan pada bedah patologi, otopsi, produksi preparat histologi. Formalin
dapat digunakan untuk memfiksasi berbagai jaringan termasuk bila kondisi tidak memungkinkan. Satu-
satunya kekurangan dari formaldehyde adalah baunya yang menyengat dan dapat menyebabkan irirtasi
pada saluran pernafasan dan mata. Pada kulit, larutan ini juga dapat menyebabkan dermatitis. Pada
penggunaan formalin, perbandingan 1:20 dan ketebalan 3-4mm disarankan agar penetrasi lebih baik.
Disarankan juga menggunakan penyangga dengan pH 7,2-7,4 untuk mencegah sel membengkak atau
menyusut.

· Fiksatif Zenker’s direkomendasikan untuk jaringan reticuloendothelial seperti nodus limfaticus, limpa,
timus, sum-sum tulang. Larutan ini memfiksasi dengan baik namun deposit mercuri harus dihilangkan
sebelum diwarnai.

· Bouin’s terkadang direkomendasikan untuk testis, saluran cerna, dan jaringan endokrin.LArutan ini
juga menggunakan penyangga 1.5-2,0. Fiksasi dilakukan selama 24 jam, bila lebih akan menyebabkan
hidrolisis dan kehilangan kestabilan DNA dan RNA.

· Glutaraldehyde kebanyakan digunakan untuk fiksasi jaringan pada mikroskop electron. Larutan ini
harus dingin dan terbuffer serta tidak lebih dari 3 bulan. Pada penggunaan glutaraldehyde, larutan harus
segar dan ketebalan tidak lebih dari 1mm untuk memaksimalkan proses fiksasi.

· Etanol kebanyakan digunakan pada fiksasi sitologi. Etanol 95% termasuk murah dan cepat. Pada
fiksasi irisan beku (Frozen section) methanol atau etanol dapat digunakan. Saat ini telah banyak larutan
yang menggunakan campuran antara akohol, formalin, dan asam asetat serta 10-70% air atau AFA.Dalam
AFA, formaldehyde akan bereaksi terhadap protein dan tidak mengganggu karena pH nya yang stabil.
Alkohol yang mengandung asam asetat akan menyebabkan pola kromatin nukleus terkoagulasi sehingga
membantu mengenali tipe sel.

Freeze Drying termasuk metode fiksasi?

Freeze drying kerap disebut sebagai salah satu metode fiksasi. Padahal, hal ini tidaklah tepat. Freeze
drying merupakan metode untuk mengawetkan jaringan dengan sedikit perubahan kimia atau struktur
sel dimana pada metode prosedur standar dihilangkan yakni dehidrasi dan clearing. Tehnik freeze drying
terdiri dari dua tahapan yaitu quenching dan drying.

Untuk dibaca

Anil, S. dan Rajendran. 2012. Appendix III: Routine Histotechniques, Staining and Notes on
Immunohistochemistry dalam Shafer’s Textbook of Oral Pathology. Elsevier.

Aughey, E. dan Frye, F.L. 2001. Comparative Veterinary Histology with Clinical Correlation. Manson
Publishing:UK

Nowacek, J. M. 2010. Chapter 16: Fixation and Tissue Processing dalam Education Guide Special Stains
and H & E Second Edition. Dako North America, Carpinteria, California
Roberts, R.J (eds). 2012. Fish Pathology. Blackwell Publishing

Ulmer, D. Fixation : The Key to Good Tissue Preservation

FIKSASI JARINGAN
BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Patologi anatomi adalah spesialisasi medis yang berurusan dengan diagnosis penyakit berdasarkan pada
pemeriksaan kasar, mikroskopik, dan molekuler atas organ, jaringan, dan sel dengan pengecatan khusus
dan imunohistokimia yang dimanfaatkan untuk memvisualisasikan protein khusus dan zat lain pada dan
disekeliling sel. Histopatologi adalah cabang biologi yang mempelajari kondisi dan fungsi jaringan dalam
hubungannya dengan penyakit dan merupakan salah satu pertimbangan dalam penegakan diagnosis
adalah melalui hasil pengamatan terhadap jaringan yang diduga terganggu (Hastuti, 2011).

Histopatologi dapat dilakukan dengan mengambil sampel jaringan (misalnya seperti dalam penentuan
kanker payudara) atau dengan mengamati jaringan setelah kematian terjadi. Dengan membandingkan
kondisi jaringan sehat terhadap jaringan sampel dapat diketahui apakah suatu penyakit yang diduga
benar-benar menyerang atau tidak. Ilmu ini dipelajari dalam semua bidang patologi, baik manusia,
hewan maupun tumbuhan (Key, 2006).

Pembuatan sajian histologi yang bersifat massal dan banyak biasanya dilakukan oleh teknisi laboratorium
tetapi harus dikontrol oleh staf pengajar sehingga kualitas sajian histologi yang dihasilkan akan dapat
senantiasa dikontrol.

Setelah jaringan atau organ tubuh yang akan dibuat sajian histologi diisolasi dari sumbernya, jaringan
tubuh tersebut kemudian diproses hingga menjadi sajian histologi (Hastuti, 2011).

Pengawetan atau fiksasi adalah stabilisasi unsur penting pada jaringan sehingga unsur tersebut tidak
terlarut, berpindah, atau terdistorsi selama prosedur selanjutnya. Fiksasi yang benar adalah dasar dari
semua sajian histologi yang baik. Dalam makalah ini saya akan membahas tentang macam-macam zat
yang sering digunakan untuk fiksasi beserta kelebihan dan kekurangan masing-masing zat tersebut.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas, rumusan masalah yang saya ambil yaitu:

a. Apakah pengertian dari fiksasi jaringan ?

b. Apakah manfaat dan tujuan fiksasi terhadap jaringan ?

c. Bagaimaa efek fiksasi terhadap jaringan ?

d. Apa saja macam-macam fiksasi.

e. Apa saja jenis larutan fiksasi ?

f. Apakah pengaruh fiksasi terhadap pewarnaan ?

1.3 Tujuan Makalah

Tujuan pembuatan makalah ini adalah sebagai berikut :

a. Menjelaskan pengertian dari fiksasi jaringan.

b. Mengetahui manfaat dan tujuan fiksasi terhadap jaringan.

c. Mengetahui efek fiksasi terhadap jaringan.

d. Mengetahui macam-macam fiksasi.

e. Mengetahui jenis larutan fiksasi.

f. Mengetahui pengaruh fiksasi terhadap pewarnaan..

1.4 Manfaat Makalah

a. Bagi Peneliti

Menambah wawasan dan pengetahuan tentang pemeriksaan fiksasi jaringan dalam pembuatan preparat
histologi.

b. Bagi Akademik

Menambah kepustakaan bagi akademik dan diharapkan menjadi referensi untuk tugas selanjutnya.

c. Bagi Masyarakat

Menambah pengetahuan bagi masyarakat khususnya tentang pembuatan preparat histologi.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Histologi

Histologi adalah bidang biologi yang mempelajari tentang struktur jaringan secara detail menggunakan
mikroskop pada sediaan jaringan yang dipotong tipis. Histologi dapat juga disebut sebagai ilmu anatomi
mikroskopis. Bidang biologi ini amat berguna dalam keakuratan diagnosis tumor dan berbagai penyakit
lain yang sampelnya memerlukan pemeriksaan histologis (Hastuti, 2011).

2.2 Definisi Histoteknik

Histoteknik adalah metoda atau cara atau proses untuk membuat sajian histologi dari spesimen tertentu
melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk diamati atau dianalisa (Hastuti,
2011).

2.3 Proses Pembuatan Sajian Histologi

Rangkaian proses pembuatan sajian histologi terdiri atas (Key, 2006).:

a. Fiksasi (Fixation)

b. Dehidrasi (Dehydration)

c. Pembeningan (Clearing)

d. Pembenaman (Impregnasi/Embedding)

e. Pengecoran (Blocking)

f. Pemotongan jaringan (Sectioning)

g. Pewarnaan (Staining)

h. Perekatan (Mounting)

i. Pelabelan (Labelling)
BAB III

PEMBAHASAN

3.1 Definisi Fiksasi

Fiksasi jaringan adalah proses mengawetkan jaringan agar awet dan kondisinya sama seperti hidup.
Dilakukan dengan merendam jaringan ke lartutan fiksasi (volume min 10x besar jar) selama 24 jam
(Mikel, 2004).

Pengawetan (fiksasi) adalah stabilitasi unsur penting pada jarimgan sehingga unsur tersebut tidak
terlarut, berpindah, atau terdistorsi selama prosedur selanjutnya. Fiksasi yang benar adalah dasar dari
semua preparat yang baik. Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah menghambat proses
pembusukan dan autolysis, pengawetan jaringan, pengerasan jaringan, pemadatan koloid, diferesiansi
optic, dan berpengaruh terhadap pewarnaan. Sejumlah factor akan mempengaruhi proses pengawetan
yaitu dapar, penetrasi, volume pengawet, konsentrasi, interval waktu, suhu, dan jenis larutan pengawet
(Sipahutar, 2009).

3.2 Manfaat dan Tujuan Fiksasi

Fiksasi terhadap jaringan harus dilakukan secepat mungkin, segera setelah jaringan hewan atau manusia
diambil dari tubuhnya dengan tujuan (Mikel, 2004) :

a. Mencegah terjadinya proses autolisis yaitu larutnya sel yang diakibatkan oleh proses – proses yang
dipengaruhi enzim dari dalam sel itu sendiri.

b. Mencegah proses pembusukan yaitu proses penghancuran jaringan yang diakibatkan oleh aktifitas
bakteri dan biasanya disertai dengan pembentukan gas.

c. Memadatkan dan mengeraskan agar mudah untuk dipotong. Untuk jaringan yang lunak seperti
jaringan otak akan sulit dipotong jika tanpa dilakukan oleh cairan fiksasi.

d. Memadatkan cairan koloid, mengubah konsistensi dari bahan seperti cairan yang terdapat didalam
jaringan menjadi konsistensi lebih padat.

e. Mencegah keruskan struktur jaringan. Dengan proses masuknya cairan fiksasi kedalam sel lewat
membran sel yang bersifat semipermeabel secara osmosis atau penyerapan.

3.3 Efek Fiksasi Pada Jaringan

Beberapa efek fiksasi pada sampel yang berupa jaringan, yaitu (Mikel, 2004) :

a. Menghambat proses pembusukan dan autolysis

Fiksasi akan menghambat terjadinya pembusukan yang disebabkan oleh kuman pembusuk dari dalam
atau luar tubuh. Waktu pembusukan untuk setiap jaringan/organ adalah berbeda tergantung pada
konsistensi dan kandungan unsur penyusun jaringan. Usus dan otak sangat rentan terhadap proses
pembusukan dibandingkan dengan jaringan tubuh lainnya. Pembusukan sering disertai oleh
pembentukan gas yang berbau.

Autolisis adalah proses kerusakan jaringan tubuh yang disebabkan enzim-enzim proteolitik yang terdapat
pada sel/jaringan tersebut. Proses proteolitik ini akan lebih cepat terjadi pada suhu tropik (24 – 36°C).
Proses proteolitik juga lebih mudah terjadi di negeri tropis dibanding dengan negeri iklim sub tropik.
Untuk menghindari proses pembusukan dan autolisis, jaringan harus segera dimasukkan ke dalam cairan
fiksasi segera setelah kematian atau diambil dari tubuh. Bila keadaan ini tidak memungkinkan, jaringan
dapat disimpan sementara dengan dibekukan dalam ruang bertemperatur dingin (freezer, -20°C) atau
dengan nitrogen cair (-70°C)

b. Pengawetan jaringan

c. Pengerasan jaringan

d. Pemadatan koloid

e. Fiksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair (sol) menjadi lebih padat (gel).

f. Diferensiasi optic

Fiksasi akan mengubah indeks refraksi berbagai unsur sel dan jaringan. Sebelum diwarnai, struktur
jaringan yang telah difiksasi akan lebih mudah dilihat dibandingkan dengan struktur jaringan yang belum
difiksasi.

3.4 Macam Cara Pengawetan Jaringan

Cara melakukan pengawetan jaringan ada 3 macam, yaitu (Sipahutar, 2009) :

a. Supravital/intravital;

Teknik ini memungkinkan fiksatif mencapai seluruh jaringan dengan lebih cepat karena fiksatif dialirkan
ke seluruh tubuh melalui perfusi dengan mesin perfusi. Alat yang digunakan adalah mesin perfusi, wing
needle, selang infus. Bahan yang digunakan adalah NaCl fisiologis dan larutan pengawet.

Cara mengerjakannya adalah sebagai berikut : wing needle ditusuk ke ventrikel kiri. Alirkan NaCl fisiologis
secukupnya. Buat guntingan/lubang pada atrium kanan. NaCl fisiologis dialirkan secukupnya lalu diganti
dengan fiksatif yang sesuai. Mesin perfusi akan mengambil alih fungsi jantung untuk mengalirkan fiksatif
melalui pembuluh darah. Fiksasi dilakukan hingga hewan menjadi kaku. Pada tikus (rat), hal tersebut
ditandai dengan kakunya ekor tikus. Selanjutnya jaringan yang diinginkan diambil dan difiksasi rendam.
Jika anda tidak memiliki mesin perfusi, gunakan tekanan hidrostatik dengan meninggikan botol berisi
larutan fiksasi dalam posisi cukup tinggi seperti melakukan infuse.

b. Merendam dalam larutan fiksatif.

Gambar 1. Merendam jaringan dalam larutan pengawet

(Sipahutar, 2009).

c. Fiksasi kering

Sewaktu secret masih segar semprotkan segera hairspray atau alcohol 95% spray pada obyekglass yang
mengandung apusan secret dengan jarak 10-15 cm sebanyak 2-4x semprot keringkan di udara terbuka
5-10 menit.

3.5 Jenis-Jenis Larutan Fiksasi

Macam-macam larutan fiksasi dibedakan menjadi dua yaitu larutan fiksatif sederhana dan larutan
fiksatif majemuk atau campuran (Morgan et al., 2010) :

3.5.1 Larutan Fiksatif Sederhana

Hanya mengandung satu macam zat saja. Contohnya, yaitu :

a. Etanol 70-100 %.

Fiksasi ini biasanya digunakan untuk sajian apusan dan tidak digunakan untuk fiksasi jaringan, sebab
larutan fiksatif ini mempunyai daya penetrasi yang lambat ke dalam jaringan dan cenderung
mengeraskan jaringan bila jaringan direndam terlalu lama di dalam larutan fiksasi ini. Larutan ini
memfiksasi jaringan dengan cara mendenaturasi protein dan mempresipitasi glikogen. Apabila fiksatif ini
dicampur dengan reagen lainnya seperti larutan Carnoy, fiksasi berlangsung cepat. Untuk keperluan
imunositokimia, larutan metanol absolut dan aseton absolute dengan perbandingan sama dalam suhu
-20° C sering digunakan.

b. Formaldehyde 4-10%

Larutan formalin merupakan cairan fiksasi yang paling umum digunakan. Larutan formalin yang
digunakan adalah formalin 10%. Formula yang digunakan adalah :

Formalin (Formaldehida 40%)..................................................... 10 ml

Air .............................................................................................. 90 ml
Formaldehida 40% adalah gas yang larut dalam air dengan volume 40% dari total berat larutan. Larutan
jenuh ini secara komersial diperdagangkan sebagai formalin atau formaldehyde 40%. Telah disepakati
bahwa yang dimaksud dengan formaldehyde 40% sama dengan larutan jenuh gas formaldehida dalam
akuades.

Formalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari formaldehida. Bentuk ini tak dapat digunakan
untuk fiksasi; yang dapat digunakan adalah bentuk monomernya. Untuk menghasilkan formalin dalam
bentuk monomer diperlukan waktu, kecuali bila pH larutan dibuat netral atau sedikit alkalis, karena
kecepatan depolarisasi tergantung pada pH. Jadi jangan sekalikali menggunakan formalin 10% yang baru
dibuat karena jaringan akan membusuk sebelum terfiksasi dengan baik. Selain itu formalin bersifat asam
karena mengandung asam formiat akibat oksidasi formaldehida. Oleh sebab itu larutan formalin 10%
harus dibuat netral atau sedikit alkalis dengan menggunakan larutan dapar fosfat dengan pH 7,2 sebagai
pelarut, atau dengan menambahkan kalsium asetat. Larutan yang paling mudah dan murah adalah
larutan formalsaline dengan formula :

Formalin (40% formaldehyde) ................................................. 100 ml

Natrium klorida (NaCl).............................................................. 9 gram

Aquades.................................................................................... 900 ml

Larutan dapar formalin 10% yang sering digunakan adalah :

Formal Calcium

Formalin (40% formaldehyde) ...................................................... 10 ml

Kalsium asetat .................................................................................. 2 gr

Aquades ................................................................................... ad 100ml

Formal Calcium

Formalin (40% formaldehyde)....................................................... 10 ml

Kalsium klorida ........'....................................................................... 2 gr

Aquades ...................................................................................ad 100 ml

Neutral Buffered Formalin

Formalin ........................................................................................ 10 ml
Acid sodium phosphate monohydrate ......................................... 0,40 gr

Anhydrous disodium phosphate .................................................. 0,65 gr

Aquades ...................................................................................ad 100 ml

Buffered Formalin Sucrose

Formalin ........................................................................................ 10 ml

Sukrosa.......................................................................................... 7,5 gr

Phosphate buffer saline (pH 7,4).............................................ad 100 ml

Cairan formalin akan mengawetkan struktur halus (fine structure) dengan sangat baik, fosfolipida, dan
beberapa enzim. Cairan ini sangat dianjurkan untuk dipakai pada penelitian gabungan sitokimia dan
mikroskopi elektron. Untuk mendapatkan hasil terbaik, jaringan harus didinginkan dalam refrigerator (4°
C).

1. Kelebihan larutan fiksatif formalin

a. Merupakan cairan pengawet umum ;

b. pH mendekati netral;

c. Pigmen formalin (acid formaldehyde haematin) tidak terbentuk.

Pembentukan pigmen formalin akan terjadi bila terdapat interaksi antara larutan formalin ber-pH asam
dengan hemoglobin atau produknya. Pigmen formalin sering dijumpai pada organ yang mengandung
banyak darah seperti hati, limpa, dan sumsum tulang. Pigmen formalin dapat dihilangkan dengan
perlakuan asam pikrat-alkohol atau larutan alkohol 1% dalam natrium hidroksida (NaOH) saat rehidrasi
irisan jaringan. Larutan Asam Pikrat-Alkohol (rendam selama ½ - 2 jam)

Larutan asam pikrat jenuh dalam alkohol 70%...................85 ml

Alkohol 70%.......................................................................15 ml

d. Potongan jaringan dapat ditinggalkan di dalam cairan formal-saline untuk jangka waktu lama (dapat
sampai 1 tahun) tanpa ada perubahan yang berarti ;

e. Bila diperlukan, jaringan yang direndam dalam cairan fiksatif ini dapat diambil dan dimasukkan ke
dalam cairan fiksatif lain.

2. Kekurangan larutan fiksatif formalin adalah:

a. Jaringan yang difiksasi dengan cara rendam memerlukan waktu sedikitnya 24 jam baru dapat
diproses.

b. Terjadi pengerutan pada jaringan. Pengerutan ini tidak disebabkan fiksatif formalin (yang
menimbulkan sedikit pembengkakan) namun oleh alkohol dalam proses dehidrasi.

c. Formaline-saline menjadi asam saat disimpan lama karena formaldehida teroksidasi menjadi asam
format. Jaringan yang disimpan beberapa bulan sering gagal menghasilkan pewarnaan yang baik.

c. Asam asetat 0,3-5% ; Asam pikrat ; asam Chromiat 0,5-1 %.

Fiksasi ini digunakan untuk mendemonstrasikan glikogen. Larutan ini akan mencegah karbohidrat
menjadi larut sebelum unsur protein selesai difiksasi. Karena formalin dan alkohol merupakan zat
dengan penetrasi cepat, larutan ini merupakan fiksatif yang kerjanya cepat. Jaringan dengan ketebalan 5
mm selesai difiksasi dalam 4 jam. Asam asetat tidak pernah digunakan sendiri karena efek
pembengkakan pada serat kolagen, tetapi ia digunakan untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan
oleh reagen lainnya. Asam asetat dapat memresipitasi nukleoprotein namun asam asetat juga mampu
merusak/menghancurkan mitokondria dan aparatus Golgi.

Formula larutan fiksatif ini adalah:

Formalin .......................................................................................... 5 ml

Asam asetat glasial .......................................................................... 5 ml

Alkohol 70% ................................................................................. 90 ml

3.5.2 Larutan Fiksatif Majemuk atau campuran.

Mengandung lebih dari satu macam zat. Contohnya yaitu :

a. Larutan Bouin (asam pikrat, formalin dan asam asetat glasial).

Cairan fiksasi ini mengandung larutan asam pikrat jenuh. Asam pikrat merupakan zat

Berbentuk serbuk bewarna kuning seperti kunyit. Asam pikrat mudah meledak dalam keadaan kering
sehingga harus disimpan dalam keadaan lembab. Asam pikrat jenuh dibuat dengan cara melarutkan
serbuk asam pikrat dalam air hingga jenuh (terdapat endapan serbuk pikrat di dasar larutan). Asam
pikrat mempresipitasikan protein dengan membentuk ikatan pikrat-protein. Asam pikrat menyebabkan
rusaknya eritrosit, karena menghilangkan fe3+ terutama bila fe3+ berada dalam jumlah sedikit, namun
dapat melindungi rna dari proses perusakan oleh enzim ribonuklease.

1. Kelebihan dari larutan Bouin adalah:

a. Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata, tetapi dapat menyebabkan terjadinya sedikit
pengerutan. Untuk mengatasi hal ini, ke dalam larutan Bouin biasanya ditambahkan asam asetat glasial
sesaat sebelum dipakai. Waktu fiksasi cepat yaitu 24 jam, tetapi potongan kecil dengan ketebalan kurang
dari 2-3 mm dapat selesai difiksasi dalam 2-3 jam. Jika jaringan difiksasi lebih lama dari 24 jam, jaringan
akan menjadi rapuh dan sulit diiris. Penyimpanan yang lama dalam etanol 70% dapat mengakibatkan
pengerutan jaringan. Asam asetat glasial sendiri mempunyai kemampuan untuk fiksasi meskipun rendah.
Asam asetat glasial biasanya digunakan bersama-sama dengan larutan fiksatif lain dan berfungsi untuk
meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh larutan lainnya. Nukleoprotein dipresipitasi oleh asam
asetat dan sering ditambahkan pada zat warna hematoksilin agar nukleus tampak jelas dan tajam.
Jaringan yang telah difiksasi sebaiknya dipindahkan ke etanol 70%. Penyimpanan yang lama dalam etanol
70% dapat mengakibatkan pengerutan jaringan.

b. Memberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan metoda trichrome.

c. Sangat baik untuk memperlihatkan nukleus dan kromosom seperti pada sel benih testis dan ovum,
embrio, dan kulit.

d. Warna kuning membuat jaringan mudah dilihat saat perendaman dan pengirisan jaringan.

2. Kekurangan dari larutan Bouin adalah:

a. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Bouin harus segera dilakukan proses dehidrasi setelah 24 jam.
Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga
tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom secara baik.

Warna kuning pada jaringan akibat kelebihan pikrat. Untuk menghilangkan warna kuning, jaringan harus
dicelup dalam alkohol atau dengan mencucinya dalam air kran semalam. Oleh karena terbentuk
beberapa ikatan pikrat yang larut dalam air, jaringan harus segera dipindahkan ke dalam alkohol.

Formula larutan fiksatif Bouin adalah:

Larutan asam pikrat jenuh ............................................................. 75 ml

Formalin (40% formaldehida)........................................................ 25 ml

Bila akan digunakan, tambahkan " asam asetat glasial" ................. 5 ml

b. Larutan Zenker (merkuri chlorida, potassium dichromate, aquadest).

Larutan fiksatif Zenker mengandung merkuri klorida yang berfungsi untuk mempresipitasi protein.
Merkuri klorida akan mengikat gugus asam protein dan gugus asam fosfat nukleoprotein, dan juga
bereaksi secara khusus dengan gugus tiol (−SH).

1. Kelebihan dari larutan fiksatif Zenker adalah:

a. Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh
beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnya
cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di bagian pinggir sementara di bagian tengah menjadi
lunak karena underfixed. Untuk mengatasi hal tersebut larutan fiksatif ini biasanya dikombinasi dengan
asam asetat, formalin, kalium dikromat, dan sebagainya. Waktu fiksasi umunya 6-24 jam.

b. Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa serta organ lain yang banyak
mengandung darah seperti jantung dan otot

c. Warna sitoplasma jaringan yang difiksasi dengan larutan fiksatif ini akan lebih cemerlang.

2. Kekurangan dari larutan fiksatif Zenker adalah:

a. Pemaparan jaringan di dalam larutan fiksatif ini yang melebihi waktu yang ditentukan akan
mengakibatkan jaringan menjadi rapuh (keras), overfixed di bagian perifer dan underfixed di tengahnya.
Jaringan seperti ini tidak dapat dipotong dengan mikrotom.

Formula larutan Zenker adalah sebagai berikut :

Merkuri klorida.................................................................................. 5 gr

Kalium dikromat……..................................................................... 2,5 gr

Natrium sulfat..................................................................................... 1 gr

Akuades.................................................................................... ad 100 ml

Tambahkan formalin segera sebelum pemakaian.............................. 5 ml

3.6 Pengaruh Fiksasi Terhadap Pewarnaan

Cairan fiksasi dapat mempengaruhi reaksi histokimia karena mengikat bagian reaktif jaringan. Ada
sejumlah faktor yang akan mempengaruhi proses pengawetan (Schichnes et al., 2007) :

a. Dapar

Pengawetan sebaiknya dikerjakan pada pH yang mendekati netral, 6 – 8. Jaringan hipoksia menurunkan
pH, sehingga harus terdapat kapasitas dapar pada pengawet untuk mencegah keasaman yang
berlebihan. Keasaman memudahkan terbentuknya pigmen heme-formalin yang akan muncul sebagai
deposit hitam yang dapat terpolarisasi di jaringan. Dapar umum terdiri atas fosfat, bikarbonat, kakodilat,
dan veronal.

b. Penetrasi

Penetrasi jaringan bergantung pada kemampuan difusi masing-masing fiksatif. Formalin dan alkohol
adalah yang terbaik sementara glutaraldehida adalah terjelek. Merkuri dan yang lainnya berada di
antaranya. Untuk mengatasi ini, jaringan diiris dengan ketipisan 3–5 mm. Jaringan yang tipis akan lebih
mudah dipenetrasi daripada jaringan tebal. Untuk pekerjaan rutin, jaringan dapat dibuat dengan
ketebalan hingga 1 cm. Dengan ketebalan ini, diharapkan cairan fiksasi dapat dengan cepat memfiksasi
seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu tebal, maka permukaan luarnya saja yang berhasil difiksasi
sedangkan bagian tengahnya dapat membusuk sebelum cairan fiksasi sempat merembes/menginfiltrasi
ke sana. Untuk mikroskopi elektron, ketebalan irisan jaringan adalah 1 mm.

c. Volume Pengawet

Volume pengawet adalah penting. Sebaiknya, volume pengawet adalah 10 x volume jaringan yang
difiksasi. Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi yang diperlukan sedangkan tebalnya
jaringan menentukan lamanya fiksasi. Panjang dan lebar jaringan umumnya ditentukan oleh jenis
mikrotom yang digunakan.

d. Konsentrasi

Konsentrasi pengawet sebaiknya diatur ke kadar terendah yang mungkin, karena pertimbangan
ekonomis. Konsentrasi formalin terbaik adalah 10%, sedangkan glutaraldehida pada 0,25% - 4%.
Konsentrasi yang terlalu tinggi dapat menimbulkan artefak yang sama dengan panas yang berlebihan.

e. Interval Waktu

Jaringan yang didapat harus segera diawetkan. Artefak akan timbul bila jaringan mengering, sehingga
bila belum mendapat pengawet, rendamlah dalam larutan garam fisiologis. Semakin lama jaringan
menunggu untuk diawetkan, semakin banyak kehilangan organel sel dan pengerutan nukleus sehingga
banyak artefak terbentuk.

f. Suhu

Peningkatan suhu, seperti reaksi kimia lainnya, akan meningkatkan laju pengawetan. Ini tidak berarti
bahwa anda dibenarkan untuk merebus jaringan dalam bahan pengawet. Formalin yang panas akan
mengawetkan lebih cepat.

g. Jenis Larutan Pengawet

Jenis larutan fiksasi yang akan digunakan bergantung pada jenis unsur jaringan yang ingin
didemonstrasikan dan pewarnaan yang akan dilakukan.

BAB IV

PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Fiksasi jaringan adalah proses mengawetkan jaringan agar awet dan kondisinya sama seperti hidup.
Pengawetan (fiksasi) adalah stabilitasi unsur penting pada jarimgan sehingga unsur tersebut tidak
terlarut, berpindah, atau terdistorsi selama prosedur selanjutnya. Fiksasi yang benar adalah dasar dari
semua preparat yang baik. Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah menghambat proses
pembusukan dan autolysis, pengawetan jaringan, pengerasan jaringan, pemadatan koloid, diferesiansi
optic, dan berpengaruh terhadap pewarnaan. Sejumlah faktor akan mempengaruhi proses pengawetan
yaitu dapar, penetrasi, volume pengawet, konsentrasi, interval waktu, suhu, dan jenis larutan pengawet.

4.2 Saran

Dalam melakukan fiksasi hendaknya memperhatikan volume larutan fiksatif, disarankan volume
cairan fiksatif 10x volume jaringan agar hasil dapat optimal. Hasil dari proses fiksasi ini nantinya akan
mempengaruhi hasi preparat histology yang dibuat.

DAFTAR PUSTAKA

Morgan,J,P. Y. K. Liu, and J. A. Smith. 2010. Semi-Microtechnique for the Biochemical Characterization of
Anaerobic Bacteria. University of Toronto, Canada.315-318

Schichnes, Denis, Nemson, Jeffrey A, and Ruzin, Teven A. 2007. Microwave protocols for plant and
animal paraffin microteqnique. The University Of California at Barkeley, CNR Biologycal Imaging Facility,
51-53
Sipahutar, H. 2009. Dasar-dasar teori mikroteknik teknik pembuatan sediaan histology. Medan : FMIPA
UNIMED

Hastuti, N. 2011. Manfaat Pemeriksaan Imunohisto(sito)kimia. Fakultas Kedokteran Universitas Jambi,

Jambi.

Mikel UV. 2004. Advanced laboratory methods in histologi and pathology. Washington, DC: Armed Forces
Institute of Pathology American Registry of Pathology. Chapter 1,Immunohistochemistry; p 1-40.

Key M. 2006. Immunohistochemical staining methods. 4th ed, California, Carpinteria Dako.

METODE PEMBUATAN SEDIAAN, FIKSASI, DEHIDRASI & PENJERNIHAN

METODE PEMBUATAN SEDIAAN, FIKSASI,

DEHIDRASI & PENJERNIHAN

A. METODE PEMBUATAN SEDIAAN

1. Metode Oles (Smear Methods)

Adalah suatu pembuatan sediaan dengan jalan mengoles / membuat selaput (film) dari substansi yang
berupa cairan atau bukan cairan diatas gelas benda yg bersih dan bebas lemak, untuk selanjutnya kmd
difiksasi, diwarnai dan ditutup dengan gelas penutup.

Bahan yang sering dibuat sediaan oles : darah, nanah / jaringan-jaringan tertentu. Cara ini sangat baik
untuk mempelajari : sitologi darah, sumsum tulang merah, eksudat dari bermacam-macam jaringan yg
meradang.

Contoh pembuatan sediaan oles :

- Pembuatan sediaan darah tipis

- Pembuatan sediaan oles dari jaringan

- Pembuatan sediaan darah tebal

- Pembuatan sediaan nanah yang tebal (nanah diencerkan dahulu dgn serum / cairan lain, bila keruh,
disentrifugasi, endapan diencerkan lagi, siap dioleskan)

Beberapa pewarnaan sediaan oles : Pewarnaan Giemsa, Pewarnaan May Grunwald (larutan eosin-
methylen blue dlm methyl alkohol), Pewarnaan Pappenheim, Pewarnaan Wright.

2. Metode Rentang (Spread)

Adalah suatu metode pembuatan sediaan dengan cara merentangkan suatu jaringan pada permukaan
gelas benda sehingga dapat diamati dengan mikroskop.

Bahan yang dibuat jaringan yang tipis, misal : pleura, mesenterium, peritoneum, pericardium, dsb. Dapat
diamati tanpa pewarnaan / dengan pewarnaan Mallory-Acid Fuchsin : Hematoksilin ; Azure II-Eosin.

3. Metode Pencet (Squash)

Adalah metode untuk mendapatkan suatu sediaan dengan cara memencet suatu potongan jaringan atau
suatu organisme secara keseluruhan sehingga didapatkan suatu sediaan yang tipis yang dapat diamati
dengan mikroskop.

Digunakan untuk jaringan yang sel-selnya mudah lepas, misal : lien, sumsum tulang, tumor seluler dll.
Diambil ± 1 mm. Pewarnaan yang digunakan : Larutan Carmine.

4. Metode Supravital

Adalah metode untuk mendapatkan sediaan dari sel / jaringan yang hidup.
Zat warna : Janus Green, Neutral Red, Methylen Blue dengan konsentrasi tertentu. Bahan : darah,
epithelium mukosa mulut.

5. Metode Irisan

Suatu metode pembuatan sediaan dengan jalan membuat suatu irisan dengan tebal tertentu sehingga
dapat diamati dengan mikroskop.

Ada 2 macam metode irisan :

- Metode irisan dengan tangan

- Metode irisan dengan mikrotom

 Metode Irisan dengan Mikrotom

Keuntungan : tebal irisan dapat diatur menurut tujuan dan kehendak pemeriksa.

 Macam-macam Mikrotom

1. Mikrotom geser (Sliding Microtome)

Disini jaringan tetap pada tempatnya sedangkan pisaunya yang bergerak. Jaringan yang akan dipotong
adalah jaringan yang tanpa penanaman (embedding) terlebih dahulu. Irisan dikumpulkan pada wadah
berisi air, disini pisau dan kuas harus basah.

2. Mikrotom beku (Freezing Microtome)

Alat dihubungkan dengan tabung yg berisi CO2 dingin melalui suatu pipa karet. Disini jaringan tetap
berada pada tempatnya, sedang pisau yang bergerak ke muka dan ke belakang. Digunakan dalam
sediaan irisan dengan metode beku.

3. Mikrotom putar (Rotary Microtome)

Disini pisau tetap pada tempatnya sedangkan jaringan yang bergerak keatas dan kebawah. Digunakan
untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode paraffin.

Cara ini banyak digunakan karena irisan yang diperoleh lebih tipis dibanding metode lain dan hampir
semua jaringan dapat diiris dengan mikrotom ini.

Disini irisan jaringan yang terjadi satu sama lain saling bergandengan sehingga terbentuk pita yang
panjang.
B. FIKSASI

Suatu usaha untuk mempertahankan elemen-elemen sel / jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak
mengalami perubahan bentuk dan ukuran. Zat yang digunakan : fiksatif.

Fiksatif :

- Mempunyai kemampuan mengubah indeks bias bagian sel sehingga mudah dilihat dengan mikroskop.

- Membuat jaringan mudah menyerap zat warna.

Lama fiksatif tergantung :

- Macam jaringan

- Tebal tipisnya jaringan

- Macam fiksatif yang dipergunakan.

Macam-macam fiksatif

a. Larutan fiksatif sederhana

Hanya mengandung satu macam zat saja. Misal : etanol 70-100% ; Formaldehyde 4-10% ; Asam asetat
0,3-5% ; Asam pikrat ; asam Chromiat 0,5-1 % dll.

b. Larutan Fiksatif Majemuk / campuran

Mengandung lebih dari satu macam zat. Misal : larutan Bouin (asam pikrat, formalin dan asam asetat
glasial) ; Larutan Zenker (merkuri chlorida, potassium dichromate, aquadest) dll.

Larutan Zenker : Nuklei dan jaringan pengikat sangat terpulas baik terutama jaringan tumor.

C. DEHIDRASI

Adalah penarikan molekul air dari dalam jaringan. Dilakukan setelah proses fiksasi, kegagalan /
ketidaksempurnaan pada proses ini menyebabkan kegagalan pada langkah selanjutnya.

Sel pada jaringan hidup mengandung air ± 85% , air tidak tercampur dengan paraffin / seloidin sehingga
perlu dehidrasi. Kemikalia yang digunakan : ethanol, Dioxane, Acetone dsb. Dehidrasi menggunakan
alkohol bertingkat mulai konsentrasi rendah sampai absolut.

D. PENJERNIHAN
- Kemikalia berfungsi membuat jaringan menjadi jernih dan transparan.

- Merupakan perantara antara proses dehidrasi dengan proses penanaman.

- Bila memakai alkohol pada dehidrasi perlu dilakukan dealkoholisasi.

- Waktu yang dipergunakan tergantung dari : tebal jaringan, zat penjernih yang dipergunakan.

- Macam-macam zat penjernih :

- Xylol / Xylene

Kebaikan : prosesnya cepat, mudah didapat. Kejelekan : jaringan dapat dipindahkan ke kemikalia ini
hanya dari alkohol absolut.

- Toluol / Toluene

Kebaikan : harga murah, mudah didapat, prosesnya cepat dan jaringan menjadi jernih. Kejelekan : Bila
terlalu lama dalam toluen jaringan menjadi keras dan sukar diiris, jaringan dapat dipindahkan kesini dari
alkohol absolut.

- Minyak Cedar

Kebaikan : hanya sedikit mengerutkan jaringan. Kejelekan : prosesnya lambat.

- Chloroform

Kebaikan : hanya sedikit pengerutan, dapat digunakan untuk jaringan-jaringan yang besar. Kejelekan :
mahal dan sukar dipindahkan ke paraffin

- Minyak Cengkeh

Kebaikan : proses cepat, jaringan dapat dipindahkan langsung dari alkohol 95 % , hanya sedikit
pengerutan. Kejelekan : mahal harganya, sukar untuk memindahkan jaringan ke paraffin.

- Minyak Anilin

Kebaikan : proses cepat, dapat dipindahkan langsung dari alkohol 70 % dan hanya sedikit mengerutkan
jaringan. Kejelekan : sukar dipindahkan ke parafin.

- n – Butyl Alkohol

Kebaikan : sangat baik untuk objek-objek yang keras dan padat. Kejelekan : memerlukan waktu lama.

METODE PARAFIN

 Kebaikan metode ini :

1. Irisan dapat jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku / seloidin (tebal irisan > 10 µ)
dengan metode parafin tebal irisan 6 µ.

2. Irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah

3. Prosesnya jauh lebih cepat.

 Kejelekan :

1. Jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah.

2. jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan

3. Sebagian besar enzim akan larut

 Urutan kerja pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin :

Fiksasi ; pencucian (washing) ; dehidrasi ; penjernihan ; infiltrasi parafin ; penanaman (embedding) ;

penyayatan (section) ; penempelan (affiksing) ; deparafinasi ; pewarnaan (staining) ; penutupan
(mounting) ; labelling.

METODE PARAFIN

Fiksasi

Organ yang diambil segera difiksasi, kalau diperlukan sebelum difiksasi dicuci dulu dengan larutan garam
difisiologis.

Pencucian

Untuk menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan dilakukan beberapa kali dengan cermat dan teliti.

Dehidrasi

Untuk menarik air yang terdapat didalam jaringan agar nantinya seluruh ruang antar sel dalam jaringan
dapat diisi oelh molekul-molekul parafin.

Dehidran yang paling banyak digunakan : alkohol (dari prosentasi rendah sampai yang absolut) setingkat
demi setingkat karena untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan yang tiba-tiba terhadap sel jaringan
sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin.

Penjernihan

ntuk menarik alkohol/ dehidran lain dalam jaringan agar nantinya dapat digantikan molekul parafin.
Infiltrasi Parafin

Dipilih parafin yang titik cairnya 50-56OC. Sebaiknya jaringan jangan dimasukkan langsung dari zat
penjernih ke parafin murni tetapi kedalam campuran zat penjernih-parafin murni untuk menghindari
perubahan lingkungan yang sangat mendadak terhadap jaringan sehingga jaringan dapat mengerut.dll.

Dalam campuran : selama 10 – 30 menit

Parafin murni I : 30 – 60 menit \

Parafin murni II : 30 – 60 menit } Tujuan : Agar jaringan mendapatkan

Parafin murni III : 30 – 60 menit / parafin yang betul murni.

Juga untuk mencegah tertahannya sejumlah besar zat penjernih didalam jaringan yang akan melunakkan
jaringan dan membuat jaringan sukar diiris.

Penanaman Dalam Jaringan

Parafin yang digunakan mempeunyai titik cair yang sama dengan parafin untuk infiltrasi. Setelah jaringan
dianggap cukup waktunya dalam parafin III tuangkan parafin murni kedalam kotak karton hingga penuh.

Ambil jaringan dengan cepat dari parafin III masukkan kotak yang berisi parafin cair dan usahakan tidak
terjadi gelembung udara didalam blok, gelembung udara terjadi karena kecepatan pembekuan parafin
yang tidak sama didalam kotok karton.

Penyayatan

Bila akan menempelkan irisan jaringan pada gelas benda, maka disiapkan dahulu alat / bahan sebagai
berikut :

1. Gelas benda

2. Albumin Mayer untuk merekatkan jaringan pada gelas benda

3. Meja pemanas (hot Plate) : tempat pemanasan yang berfungsi untuk merentangkan irisan jaringan
dan merekatkan jaringan pada gelas benda.

4. Pipet tetes

5. Aquadest

6. Sonde

Cara penempelan :
Teteskan setetes albumin Mayer pada gelas benda dan diratakan seluruh permukaan. Tetesilah aquadest
(agar irisan jaringan yang akan diletakkan terentangm tidak melipat), lalu jaringan diletakkan dan angkat
gelas benda letakkan pada meja pemanas. Atur letak irisan dengan 2 sonde. Dalam satu gelas benda
dapat ditempel 1-2 irisan tergantung besar kecilnya jaringan. Setelah kering, siap untuk diwarnai tetapi
dapat juga disimpan untuk beberapa hari.

Pewarnaan

Deparafinasi : menghilangkan parafin yang terdapat didalam jaringan. Caranya : merendam gelas benda
yang berisi irisan jaringan kedalam Xylene ± 15 menit.

Berikutnya : Masukkan kedalam alkohol 96 %, 80 %, 70 %, dst sampai aquadest dengan waktu beberapa
detik / 3-4 kali celupan. Masukkan kedalam larutan zat warna aquosa.

Pewarnaan Hematoxylin-Eosin

- Deparafinasi dengan xylene

- Kelebihan xylene diisap dengan kertas filter melalui tepi gelas benda.

- Celup sebentar dalam alkohol 96%, kemudian 80%, 70%, 50%, 30%, aquadest.

- Masukkan kedalam larutan Hematoxylin dengan waktu tertentu : 3-7 detik.

- Air mengalir : 10 menit. Cuci aquadest sebentar.

- Masukkan sebentar saja berturut-turut mulai dari alkohol 30%, 50%, 70%.

- Kemudian kedalam larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) 1-3 menit.

- Pewarnaan selesai, tetapi jaringan tidak dapat ditutup langsung dengan Canada balsam, karena Canada
balsam dilarutkan dalam xylene, sedangkan jaringan masih berada dalam media alkohol 70% sehingga
jaringan harus dibawa ke media xylene dulu.

- Dari larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) selanjutnya berturut-turut masukkan ke alkohol 70%, 80%,
96%, alkohol absolut, masing-masing sebentar saja.

- Masukkan xylene ± 10 menit (xylene berfungsi untukl mengantar ke canada balsam juga berfungsi
untuk menjernihkan jaringan yang sudah terpulas).

- Jrigan ditutup dengan gelas penutup setelah ditetesi dengan Canada balsam terlebih dahulu.

Pelabelan

Label dituliskan : nama spesies, nama organ / jaringan, potongan melintang / membujur, pewarnaan
yang digunakan, tanggal pembuatan.
Metode Pewarnaan

Metode Hasil

Hematoxylin-Eosin Biru (hematoxylin)

Sitoplasma basofilik, nukleus, bakteri, Ca. Merah (eosin)

Sitoplasma, jaringan ikat dan semua jaringan lain.

Van Gieson Kuning (as. pikrat)

Sitoplasma, otot, amiloid, fibrin, fibrinoid. Merah (fuchsin)

Jaringan ikat, hyalin. Hitam (iron hematoxylin)

Nukleus

Elastic Stain Hitam (resorchin-fuchsin)

Serabut elastik

Merah (nuklear fast red)

Nukleus

Elastic-Van Gieson (E.V.G) Kombinasi

Azan Merah (Azocarmine)

Nukleus, eritrosit, fibrin, fibrinoid, sitoplasma acidofilik Biru (Aniline blue, Orange G)

Serabut kolagen, sitoplasma basofilik, mukus.

Silver Stain Hitam (ammoniakal AgNO3)

Serabut retikulum, serabut saraf. Abu-abu

Serabut kolagen

Fat stain Merah (Sudan III, Scarlet Red)

Lemak netral Biru (Hematoxylin)

Nukleus, sitoplasma

Congo Red Merah (Congo Red)

Amyloid Biru (Hematoxylin)

Nukleus

Weigerts Fibrin Stain Biru (Lugol Solution)

........

Merah (Nuclear Fast Red)

......................

Berlin Blue Reaction Biru (Ca. Ferrocyanid)

Hemosiderin, Fe3+ Merah (Nuclear Fast Red)

Nukleus

Giemsa Biru (metil violet)

Nukleus, semua substansi basofilik. Merah (azur-eosin)

Eosinofil, sitoplasma, granula, serabut kolagen.

Ziehl-Neelsen Merah (carbol Fuchsin)

Basil tbc, Lepra Biru

Hemalum

Nukleus

Periodic Acid Schiff Reaction (PAS) Merah (Schiff Reagent)

Adjacent hydroxyl Groups & amino-alkohol.

PERIODIC ACID SCHIFF (PAS)

Prinsip :

Setelah pengecatan karbohidrat dipecah oleh periodic acid menjadi aldehid dan aldehid bereaksi dengan
reagen Schiff membentuk warna merah.

Reagen :
Asam Periodat 0,5% dan Schiff (100 ml)

Reagen Schiff :

1 gr Basic Fuchsin dilarutkan dalam 200 cc aquades panas, dinginkan 50OC. Tambah bubuk padat sodium
metabisulfid 2 gr, kocok sampai rata. Tambahkan HCl 10 cc, diamkan pada suhu kamar yang gelap 24 jam.
Setelah itu tambah norit 0,5 gr kocok sampai rata (merah jadi hitam), pada pemakaian disaring hingga
jernih.

Prosedur :

- Deparafinisasi, cuci dengan air.

- Tambahkan periodic acid selama 5 menit, tambahkan cat Schiff selama 15 menit. Cuci air 15-20 menit
(sampai jaringan berwarna merah muda)

- Beri reagent Harris Hematoksilin 6 menit, cuci dgn air untuk melarutkan Harris Hematoksilin.

- Beri acid alkohol 3-5 menit

- Cuci dengan air, baru kmd diberi amonium water sampai warna biru hilang.

- Lakukan dehidrasi, clearing, mounting.

Interpretasi :

Sitoplasma merah

KANKER

Kanker adalah suatu pertumbuhan sel-sel abnormal yang cendrung menginvasi jaringan disekitarnya dan
menyebar ke tempat-tempat jauh.

Kategori kanker

- Karsinoma adalah kanker jaringan epitel termasuk sel-sel kulit, testis, ovarium, kelenjar penghasil
mukus, sel penghasil melanin, payudara, serviks, kolon, rektum, lambung, pankreas dan esophagus.

- Limfoma adalah kanker jaringan limfe yang mencakup kapiler limfe, limpa, berbagai kelenjar limfe dan
pembuluh limfe. Timus dan sumsum tulang juga dapat dipengaruhi. Limfoma spesifik antara lain
penyakit Hodgkin (kanker kelenjar limfe dam limpa) dam Limfoma Malignum.

- Sarkoma adalah kanker jaringan ikat, termasuk sel-sel yang ditemukan di otot dan tulang.

- Glioma adalah kanker sel-sel glia (penunjang) di susunan saraf pusat.

- Karsinoma in situ adalah istilah yang digunakan untuk menjelaskan sel epitel abnormal yang masih
terbatas di daerah tertentu sehingga masih dianggap lesi pra invasif.

Patogenesa :

Etiologi tidak jelas, ada beberapa teori :

- Genetik - Hormon

- Lingkungan - Virus

Teori Genetik

Keganasan terjadi akibat dari mutasi gen yang mempengaruhi proses pertumbuhan kemudian
berkembang abnormal (ganas).

Teori Lingkungan

Keadaan lingkungan bisa mendorong/merangsang terjadinya keganasan. Misal : lingk. Pabrik banyak
menghasilkan bahan carcinogenik.

Teori Hormon

Hormon dapat menyebabkan keganasan . misal : estrogen pada pil KB dikombinasi dgn progesteron
sehingga tidak begitu bahaya.

Teori Virus

- Virus dalam tubuh mempunyai efek lisis steady state effect, incorporated.

- Incorporated : terjadi ikatan antara DNA/RNA virus dengan DNA sel sehingga ganas. Sel yang ganas
pada keadaan yang memungkinkan : Inisiator dan Promotor

- Inisiator : bahan /jasad renik yang menyebabkan carcinogenesis

- Promotor : Bahan dari lingkungan / jasad renik / sesuatu yang dapat mendorong terjadinya
carcinogenesis.

- Promotor dan inisiator pada proses carcinogenesis bekerja satu sama lain.

CARCINOGENESIS CERVIC
Cervic merupakan pertemuan antara epitel columnar (dalam uteri) dan Squamosa vagina, seringterjadi
keganasan.

Carsinoma Cervic dapat dideteksi dengan metode PAP Smear. Faktor insidense adalah :

- Sex terlalu muda (<17 tahun)

- Ganti-ganti pasangan.

- Wanita yang banyak melakukan perkawinan

- Tingkat sosial ekonomi yang berhubungan hygiene sanitasi.

Deteksi :

1. PAP Smear

2. Schiller Test

3. Biopsi Kemudian diperiksa secara Patologi Anatomi

Keterangan :

Schiller Test adalah suatu cara dgn pengecatan biasa dgn larutan Iodium dab Potassium Chlor.

Prinsip :

Pada sel yang mengalami keganasan jumlah glikogennya kecil, hasilnya pucat. Pada sel-sel normaljumlah
glikogen banyak (warna coklat : normal, tidak berwarna ganas) tapi ada juga positif palsu yaitu pada
hiperplasia dan displasia. Jumlah glikogen kecil sekali namun juga merupakan gejala dini dari suatu
keganasan.

PEWARNAAN PAPANICOLAOU (GURR, 1960)

Reagen yang diperlukan :

a. Hematoxylin Ehrlich / Harris

b. Orange G

- Phosphotungstic Acid 1 % aquosa 1,5 ml

- Alkohol absolut 95 ml

- Aquadest 3,5 ml

c. Papanicolaou 0,7 gram

Alkohol 95 % 100 ml

Letakkan dalam botol dan sumbatlah botol dengan kain katun kemudian panaskan dalam bak yang berisi
air panas hingga larut. Dinginkan kemudian saring dengan kertas saring.

Prosedur

1. Sediaan apus yang masih basah, difiksasi dalam campuran eter + alkohol absolut (dalam volume yang
sama) selama 5-15 menit.

2. Cuci berturut-turut dalam alkohol 90%, 70% dan 50%.

3. Cuci dalam aquadest

4. Warnai dalam Hematoxylin Ehrlich / Harris selama 5-10 menit.

5. Cuci lagi dalam aquadest

6. Diferensiasi dalam 0,5% HCl, cuci dalam aquadest.

7. Celup dalam aquadest dimana ditambahkan 3 tetes Lithium Carbonat jenuh dalam setiap 100 ml
aquadest.

8. Cuci seluruhnya dalam aquadest

9. Cuci berturut-turut dalam alkohol 50%, 70% dan 90%

10. Warnai selama 1 menit dalam larutan Orange G

11. Cuci seluruhnya dalam alkohol 95% untuk menghilangkan kelebihan zat warna.

12. Warnai selama 2 menit dalam Papanicolaou

13. Cuci selama 5-10 menit dalam setiap Staning Jar yang berisi alkohol 95% (disini ada 3 buah Staining-
Jar yang berisi alkohol 95%.

14. Cuci dalam alkohol absolut

15. Jernihkan dalam xylene dan tutup dalam Dpx atau Crystalite.