Pemeriksaan Anti HCV dengan Teknik ELISA

A. Tujuan Praktikum :
Untuk mendeteksi adanya antibodi terhadap Hepatitis C pada serum dan
plasma manusia.

B. Metode Pemeriksaan : Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

C. Dasar Teori

- ELISA adalah suatu singkatan bahasa Inggris yang disebut dengan : (Enzyme-
linked immunosorbent assay) atau penetapan kadar immunosorben taut-
enzim yang merupakan suatu uji serologis. Menggunakan teknik ELISA dalam
bidang imunologi untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di
dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan
menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/signal.
Selanjutnya digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan
suatu antibodi/antigen dengan menggunakan antibodi/antigen spesifik.
- Teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur
kadar antibodi/antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu berupa
spektrofotometer dan dengan cara menentukan jumlah penambahan kadar
antibodi/antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standard antara kadar
antibody atau antigen yang dapat dihitung berdasarkan absorbansinya. ELISA
dianggap pemeriksaan yang memiliki spesifitas dan sensitifitas yang tinggi
yang mampu menunjang diagnosa klinis HCV.
- ELISA ( EIA ) dibagi menjadi dua macam yaitu homogenous EIA dan
heterogenous EIA. Homogenous EIA berguna untuk pemeriksaan bahan obat-
obatan, hormon dan lain-lain. Sedangkan heterogenous EIA berguna untuk
pemeriksaan bahan yang memiliki berat molekul besar misalnya antigen dan
antibodi. Pemeriksaan parameter petanda serologis HCV termasuk dalam
kelompok kedua yaitu heterogenous EIA.
- Ada tiga tahapan penting dalam uji ELISA yaitu :
1. Pelapisan (coating) dengan antigen atau antibodi pada plate (fase padat).
Pelapisan dengan dengan antigen untuk penentuan antibodi untuk
penentuan antigen.
2. Penambahan bahan yang ditentukan (diperiksa), misalnya serum, plasma,
saliva dan cairan tubuh yang lain.
3. Penambahan detektor yang berfungsi untuk mendeteksi ikatan Ag – Ab
yang terjadi.
Ada dua detektor yang digunakan yaitu :
a. Penambahan konjugat yaitu antigen atau antibodi yang berlabel enzim,
misalnya Horse Radish Peroxidase (HRPO). Alkaline Phosphatase, Urease,
Glukose-Oxidase (GOP) dan lain-lain.
b. Penambahan substrat yang berfungsi memberi perubahan warna pada
reaksi. Misalnya TMB (Tetra Methyl Benzidine, O- Toluidine, OPD, ABTS dan
lain-lain.
ELISA sendiri terdiri dari beberapa macam metode diantaranya ELISA kompetitif,
ELISA double sandwich antigen atau antibodi dan indirect ELISA yang ketiganya
memiliki prinsip dasar reaksi yang sama yaitu reaksi Ag – Ab.

E. Alat dan Bahan :

Alat :
 Strip Mikrotiter
 Mikropipet
 Yellow tip
 Inkubator
 ELISA Reader
 Wadah Subsrat
 Wadah Larutan Pencuci

Bahan :
 Kontrol positif dan negatif
 Konjugat
  Subsrat A dan Subsrat B
 Larutan Pencuci
 Larutan Penghenti (STOP)
 Aquadest
 Serum

F. Prosedur :

a.Siapkan conjugate, substrat dan wash solution.

b.Pilihlah sumur yang sesuai dengan jumlah pemeriksaan yang akan dilakukan.
c.Tambahkan 180 µL sample diluent kedalam seluruh sumur.
d.Kemudian tambahkan 20 µL sample ke dalam seluruh sumur, kecuali sumur Al
sampai dengan Cl.
e.Pada sumur A l dan Bl ditambahkan dengan 20 µL control negative,
f. sedangkan pada sumur Cl ditambahkan dengan 20 µL control positif.
g. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit.
h.Setelah dicuci sebanyak 5 kali dengan 500 µL wash fluid untuk setiap sumur
i.kemudian tambahkan 100 µL conjugate ke dalam seluruh sumur dan diinkubasi
kembali pada suhu 37°C selama 30 menit.
j. Selanjutnya dicuci sebanyak 5 kali dengan menggunakan 500 µL wash fluid untuk
setiap sumur.
k.Kemudian tambahkan 100 µL substrate ke dalam seluruh sumur dan diinkubasi
kembali pada suhu 37°C selama 30 menit.
l.Untuk mengakhiri proses reaksi tambahkan 50 µL asam sulfat 0,5 - 2 M ke dalam
seluruh sumur dan
m.kemudian baca hasilnya pada 450 nm, ref 690 nm.

7. Pembacaan Absorbans
a. Absorbansi diukur pada 450 nm sesegera mungkin atau dalam 30 menit
setelah penghentian reaksi, dengan menggunakan panjang gelombang acuan
620-690 nm (jika ada).
b. Hasil absorban dicatat dan dihitung untuk menentukan MNC, MPC dan
COV.
 Validasi Hasil :
a. Nilai rata-rata kontrol negatif MNC < 0,100 Tidak termasuk apapun
nilai [NC], jika melebihi 0.100 atau dua kali melebihi dari MNC.
menghitung ulang MNC dari nilai [NC] yang tersisa.
b. Nilai kontrol positif MPC > 0,600

Perhitungan :
Ada atau tidak adanya Anti HCV ditentukan dengan membandingkan nilai
absorbansi spesimen dengan nilai cut-off.
Nilai cut-off dihitung dari kontrol negatif.
Nilai value (COV) = MNC + 0,1

G. Interpretasi Hasil :

HASIL INTERPRETASI
A450 (spesimen) ≤ COV Anti-HCV nonreaktif
A450 (spesimen) ≥ COV Anti-HCV reaktif