LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA KLINIS

“Isolasi DNA”
Laporan ini disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Praktikum Biokimia Klinis

Disusun oleh : Kelompok III B

Messy Hernila (11151020000072)

Fathimah N. M. (11151020000073)

Nadiyah Hilmi (11151020000074)

Nada Aprilia (11151020000075)

Tiara Mahkotawati (11151020000076)

Nailul Muna (11151020000077)

Maghfira Deswita (11151020000078)

Dhimaz Aryo P. (11151020000085)

Nia Fachrunnisa (11151020000086)

Syarif Pujiantoro (11151020000102)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2017
 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI .................................................................................................... I

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1

A. Latar Belakang .............................................................................. 1

B. Rumusan Masalah ........................................................................ 1
C. Tujuan Praktikum .......................................................................... 1

BAB II TINJAUAN PUSTAKA...................................................................... 2

BAB II METODOLOGI PRAKTIKUM ......................................................... 5

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 7

A. Hasil Pengamatan .......................................................................... 7

B. Pembahasan ................................................................................... 8

BAB V PENUTUP ........................................................................................... 11

A. Kesimpulan.................................................................................... 11
B. Saran .............................................................................................. 11

DAFTAR PUSTAKA

I
 BAB I
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada
akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. DNA adalah
asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler (Jusuf 2001).

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.

Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung
dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Teknik melakukan Isolasi DNA Sebenarnya sangat spesifik, terdapat

berbagai macam metode dan protocol yang berbeda. Sampel yang digunakan juga
bervariasi, sehingga diperlukan protocol yang spesifik untuk mengisolasi
DNAnya.Masing masing mempunyai prosedural yang berbeda walaupun
sebenarnya konsep yang dipakai adalah sama, pada praktikum kali ini dilakukan
Isolasi DNA dari sampel darah Manusia .

B. RUMUSAN MASALAH
Dari Latar belakang diatas dapat dikemukakan Rumusan masalah sebagai
berikut:
1. Bagaimana Konsep Teknik isolasi DNA manusia melalui sampel Darah?

C. TUJUAN PRAKTIKUM
Mengetahui Konsep dasar teknik Isolasi DNA manusia melalui sampel
darah.

1
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Didalam inti sel suatu organisme, terdapat materi genetik. Materi genetik
ini harus mempunyai kemampuan untuk mengkode suatu informasi secara spesifik
dan menggandakan suatu informasi secara tepat. Contoh dari materi genetik adalah
DNA/RNA, gen dan kromosom. DNA dan RNA dimiliki oleh organisme
prokariotik, sedangkan eukariotik hanya memiliki RNA. DNA/RNA adalah
informasi genetik yang dibentuk oleh asam deoksiribonukleat untuk DNA atau
Ribosanukleat untuk RNA (Solomon dkk 2005: 38).
Sel prokariotik memiliki DNA yang tersebar di dalam sel dan DNA yang
tidak berasosiasi dengan protein histon sehingga DNA terburai didalam sitoplasma.
DNA pada sel prokariotik berbentuk rantai single helix. Beberapa DNA tambahan
pada bakteri dapat ditemukan diorganel bernama plasmid. Sel eukariotik memiliki
DNA yang berasosiasi dengan protein bernama histon lalu membentuk kuparan
padat yang disebut kromosom. DNA pada sel eukariotik terdapat didalam nukleus.
Sebagian besar DNA pada sel hewan terdapat didalam inti sel dan sebagian kecil
ada di dalam mitokondria. Sedangkan DNA pada sel tumbuhan terdapat pada
nukleus, mitokondria juga kloroplas (Pierce 2005: 17)
Menurut Watson dan Crick, DNA disusun oleh basa purin yaitu adenin dan
guanin, dan basa pirimidin yaitu timin dan sitosin. DNA juga mengandung gula
deoksiribosa, gugus fosfat, dan basa nitrogen yang semuanya dinamakan susunan
nukleotida (Suryo 2008: 68). Susunan basa kimia ini akan mengandung informasi
untuk komposisi penyusun suatu organisme tertentu. DNA dapat menggandakan
dirinya dan nantinya berperan dalam proses pembelahan sel. Basa-basa nitrogen
pada rantai yang satu dengan rantai lainnya saling berpasangan dengan ikatan
hidrogen. Basa jenis purin selalu berpasangan dengan basa jenis pirimidin. Adenin
akan berpasangan dengan timin dengan dua ikatan hidrogen. Guanin akan
berpasangan dengan sitosin dengan tiga ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen berfungsi
menstabilkan struktur DNA tersebut dan mempermudah penguraian DNA saat

2
melakukan replikasi dan transkripsi. Struktur DNA adalah double helix atau pilinan
berganda (Campbell dkk. 2008: 305-306).
Berdasarkan letak ditemukannya di dalam sel, DNA eukariotik
dikategorikan menjadi dua yaitu, DNA kromosomal dan DNA sitoplasma. DNA
kromosomal merupakan DNA yang ditemukan di kromosom atau didalam nucleus,
sedangkan DNA sitoplasma merupakan DNA yang ditemukan di sitoplasma
khususnya mitokondria dan kloroplas. Nuclear DNA atau DNA inti merupakan
DNA yang berbentuk linier dan berasosiasi dengan protein histon berada di dalam
kromosom. DNA inti mengandung lebih banyak informasi genetik dibandingkan
DNA lain. DNA inti mengandung 30.000-40.000 gen, sedangkan DNA
mitokondria hanya mengandung 37 gen (University of North Texas 2007: 1).
DNA mitokondria terletak di bagian matriks mitokondria, berbentuk
sirkular, dan memiliki beberapa gen yang memproduksi protein metabolisme
esensial. Dari 37 gen yang ada pada mitokondria, 13 gen memproduksi enzim yang
terlibat dalam fosforilasi oksidatif, atau pembentukan energi utama dari sel. 24 gen
lainnya menyediakan informasi untuk pembuatan tRNA dan rRNA. DNA
mitokondria hanya diwariskan dari ibu, karena saat proses fertilisasi, mitokondria
pada sel sperma tidak ikut masuk ke dalam sel telur. Hal ini menyebabkan DNA
mitokondria dapat digunakan untuk melacak garis keturunan keluarga dan untuk
identifikasi forensik. DNA mitokondria juga dapat mempelajari hubungan antar
kelompok populasi manusia di dunia (University of North Texas 2007: 1).
Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi DNA dari suatu sel sebagai tahap
awal suatu analisis genetik. Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari
pengambilan sampel sel, pelisisan membran dan/atau dinding sel, ekstraksi DNA,
presipitasi DNA, pemurnian DNA, dan pengawetan DNA. DNA manusia dan
hewan biasanya diperoleh dari darah dan jaringan dalam. Namun DNA juga dapat
diektraksi dari semen, saliva, akar rambut, urine, dan gigi. Isolasi DNA juga
berfungsi sebagai media pembelajaran genetik, dapat mengetahui kelainan genetik
yang diderita. Aplikasi dari isolasi DNA adalah untuk identifikasi forensik,
beberapa gen tertentu dapat diproduksi secara massal untuk mengobati penyakit
tertentu, dan teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untuk rekayasa genetika
(University of Utah 2015: 1).

3
 Sel hewan dapat diisolasi lewat darah, sedangkan pada sel tumbuhan
umumnya diisolasi dari organ daun. Metode tradisional untuk mengisolasi DNA
tumbuhan dengan menggunakan teknik CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide). Hal penting yang harus diperhatikan pada teknik CTAB yaitu pelisisan
dinding sel agar DNA dapat diamatai. Pada saat pemurnian DNA, partikel lain akan
dipisahkan lewat sentrifugasi dengan kloroform. Reagen yang digunakan antara
lain CTAB buffer, etanol 70%, amonium asetat, kloroform, tris-EDTA, RNAse, dan
isopropanol. Teknik CTAB melibatkan proses cukup rumit karena tumbuhan harus
digerus yang selanjutnya di inkubasi pada waterbath, dan terakhir di sentrifugasi
(University of Queensland 2003: 1-3).
Isolasi DNA tumbuhan juga dapat dilakukan dengan teknik yang lebih
modern, atau disebut dengan teknik KIT (QuickExtract Plant DNA Extraction).
Kelebihan dari metode KIT ini adalah prosedur kerja yang simpel, proses
pengerjaan yang cepat, dan tidak menggunakan bahan kimia berbahaya seperti
kloroform dan memerlukan penanganan yang mudah. Metode KIT tersebut hanya
memerlukan satu jenis reagen dan dua kali inkubasi tanpa proses penggerusan dan
sentrifugasi (University of Queensland 2003: 4).
Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 µg DNA per mL
darah. Dari 150 µL sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 2,5 sampai
7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel darah putih dalam
sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih dalam sampel bervariasi,
tapi rata-rata terdapat 7 × 106 / mL darah. Setiap sel rata-rata mengandung 6
pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih rendah, bila sampel darah
dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel
disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan dalam prosedur isolasi DNA ini.
Pengukuran serapan DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm (A 260).
Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50 mg/mL. Konsentrasi DNA (mg/mL) =
A260 × 50 mg/m; Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks kemurnian. DNA
dikatakan murni bila memiliki indeks kemurnian > 1,75. Indeks Kemurnian = A260
/ A280.

4
 BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

A. ALAT DAN BAHAN

Alat :
 Sentrifugator
 Inkubator
 Vortex
 Mikrotube
 Rak Mikrotube
 Mikropipet & tipps

Bahan:

 Darah
 Larutan pelisis sel
 Larutan pelisis sel darah merah
 Larutan RNAse
 Larutan pengendap protein
 Larutan penghidrasi DNA
 Isopropanol 100%
 Alkohol

Prosedur Kerja:

1. Masukan 900 ul cell lysis solution ke dalam microfuge steril.

2. Tambahkan 300 ul darah dan tabung diputar bolak balik 5-6 kali untuk
homogenasi.
3. Inkubasi campuran tersebut selama 10 menit dalam suhu ruang (bolak-balik
2-3 kali selama inkubasi)
4. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 1 menit.
5. Buang supernatan tanpa mengganggu pellet
6. Tambahkan pellet dengan 600 ul cell lysis solution dan vortex sebentar.

5
7. Ulangi tahap 4 dan 5 sampai pellet terlihat putih.
8. Tambahkan pellet dengan 300 ul nuclel lysis solution. Pipet larutan 5-6 kali
untuk melisiskan sel darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi
kental. Jika masih terlihat butir-butiran kecil setelah pencampuran, inkubasi
campuran tersebut pada suhu 37𝑜 C sampai butiran tersebut hilang.
9. Optional. Tambahkan 1,5 ul RNAse solution dan campurkan dengan cara
membolak-balikan tabung.
10. Inkubasi campuran pada suhu 37𝑜 C selama 15 menit, lalu dinginkan pada
suhu ruang.
11. Tambahkan 100 ul protein precipitation solution ke dalam lysate dan vortex
selama 20 detik. Setelah divortex akan terlihat butiran-butiran protein halus.
12. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu ruang.
Akan terlihat pellet dengan warna coklat terang. Bila supernatan masih
berwarna coklat. Ambil supernatan tersebut, pindahkan ke tabung
mikrosentrifuse bersih. Ulangi langkah 11 dan 12.
13. Pindahkan supernatan ke dalam tabung mikrosentrifuse bersih yang sudah
berisi 1 ml isopropanol.
14. Bolak balik tabung secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih
halus (DNA).
15. Untuk optimalisasi, simpan tabung pada suhu −20𝑜 C selama 1 jam
16. Sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit
akan terlihat pellet putih.
17. Buang supernatan, cuci dengan 1000 ul alkohol dingin.
18. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang. Sampai DNA
berubah menjadi transparan.

6
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL PENGAMATAN

No. Gambar Keterangan

1 Larutan Buffer

Campuran darah dan

2
larutan Buffer

Campuran pellet dan

3
CLS

7
 Nuclear Localization
Sequence (NLS) dan
4 pellet

5 Penambahan etanol

B. PEMBAHASAN
Pada praktikum percobaan DNA kali ini, tahap pertama dalam proses isolasi
DNA ini adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel.
Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan
untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998).

Tahap penghancuran sel atau jaringan dilakukan dengan cara memasukkan 900
uL cell lysis solution kedalam tabung mikrofuge steril. Fungsi cell lysis solution
ini adalah untuk melisiskan sel dengan cara melarutkan membran sel (oleh SDS),
dan mendenaturasi DNA kromosol namun tidak mendenaturasi DNA plasmid.
DNA plasmid tidak terdenaturasi karena sifatnya yang covalently closed circular
DNA (cccDNA). Kemudian ditambahkan 300 uL darah dan tabung diputar bolak-

8
balik 5-6 (10 menit) untuk homogenisasi. Inkubasi cairan tersebut selama 10 menit
dalam suhu ruang (bolak- balik 2-3 kali selama inkubasi). Kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 1 menit. Sentrifugasi
dilakukan untuk memisahkan supernatant dengan pellet. Pellet (endapan) yang
dihasilkan adalah protein sedangkan supernatan yang dihasilkan mengandung
DNA (Promega, 2012).

Lalu didapatkan pellet dan supernatan pada tabung mikrofuge tersebut. Pada
mikrofuge tersebut hendaklah di buang supernatannya tetapi jangan mengganggu
pellet pada dasar tabung mikrofuge tersebut. Lalu tambahkan 600 uL cell lysis
solution dan vortex sebentar. Kemudian dapat diulang tahap 4 dan 5 sampai pellet
terlihat warna putih. Lalu tambahkan pellet dengan nuclei lysis solution. Pipet
larutan 5-6 kali untuk melisiskan darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-
benar jadi kenta. Jika masih terlihat butiran-butiran kecil selama pencampuran,
inkubasi campuran tersebut pada suhu 37 sampai butiran tersebut hilang. Inkubasi
tersebut dilakukan agar NLS dapat bereaksi secara optimal. (Fatchiyah, 2011)

Lalu, setelah ditambahkan larutan RNAse, mikrotube berisi sampel diinkubasi

dalam inkubator pada suhu 37˚C selama 15 menit. Fungsi dari penginkubasian ini
adalah untuk mengoptimalkan kinerja dari RNAse. Kemudian ditambahkan larutan
presipitasi protein. Larutan presipitasi protein (HAc) mengendapkan protein yang
berasosiasi dengan DNA. Larutan presipitasi protein tersusun atas garam
penyangga (salt buffer). Larutan ini dapat menurunkan kelarutan protein sehingga
protein dapat mengendap (Sanchez, 2001).

Kemudian, setelah disentrifugasi akan terbentuk pellet berwarna cokelat.

Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan supernatant dengan pellet. Pellet
(endapan) yang dihasilkan adalah protein sedangkan supernatan yang dihasilkan
mengandung DNA. Setelah itu, dipisahkan supernatannya dan ditambahkan larutan
isopropanol. Isopropanol berfungsi sebagai medium agregasi plasmid DNA agar
DNA terlihat. Pada tahap ini sudah masuk ke tahap untuk pengisolasian dari DNA.
Isolasi DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Menurut Surzycki
(2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam
nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul

9
DNA di larutan aquoeus. Muatan dipol positif dari air berinteraksi dengan muatan
negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA
dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar
dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar
dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam
nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam
larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol
dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi
DNA.

Pada tahap terakhir dilakukan penambahan etanol setelah campuran DNA-

Isopropanol disentrifugasi dan dipisahkan supernatan dengan pelet berwarna putih
di bagian dasar nya. Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian
kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol
bertujuan untuk menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-
garam yang terlibat dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol
sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi
kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan isopropanol untuk menghilangkan
residu garam (Ausubel et al., 2003).

10
 BAB V
PENUTUP

A. KESIMPULAN
1. Proses isolasi DNA merupakan proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel.
2. Isopropanol berfungsi sebagai medium agregasi plasmid DNA agar DNA
terlihat, karena molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus
polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah
bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan
molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga,
penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air
sehingga memudahkan presipitasi DNA.

3. Tahap terakhir dilakukan penambahan etanol setelah campuran DNA-

Isopropanol disentrifugasi dan dipisahkan supernatannya yang bertujuan untuk
menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa.

B. SARAN
1. Praktikan harus teliti dalam melakukan pengerjaan praktikum dan melihat
hasilnya
2. Praktikan harus lebih teliti dalam mengerjakan praktikum.
3. Waktu yang diperlukan untuk praktikum akan lebih baik jika ada lebih
banyak.

11
 DAFTAR PUSTAKA
Yusuf M. 2001. Genetika I Stuktur dan Ekspresi Gen. Bogor : Sagung
Seto.
Solomon, E. P., D. W. Martin, & L. R. Berg. 2005. Biology. 8th ed. Thomson
Corporation, Belmont, USA: 1379 hlm.
Pierce, B.A. 2005. Genetics: A Conceptual Approach. 2nd ed. W. H. Freeman. New
York: 709 hlm.
Suryo. 2008. Genetika. Gadjah Mada University Press, Yogjakarta: 344 hlm.
Campbell, N.A., J.B. Reece, L.A. Urray, M.L. Cain, P.V. Minorsky, R.B Jackson
& S.A. Wasserman. 2008. Biology. 8th ed. Pearson Education Inc, San
Fransisco: 1465 hlm.
University of North Texas (=NTU). 2007. DNA defined. 1 hlm.
https://www.unthsc.edu/departments/pathology_anatomy/dna/Forensics/Def
ined/Defined.cfm. 20 November 2017
University of Utah (=UU). 2015. Frequently asked question. 1 hlm.
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/faq/. 20
November 2017
University of Queensland (=QU). 2003. Plant genomic DNA extraction. 5 hlm.
http://www.cilr.uq.edu.au/UserImages/File/Plant%20Genomic%20DNA%2
0Extraction%20by%20CTAB%20_2__Fiona.pdf. 20 November 2017
Ausubel, F. M. et al. 2003. Current Protocols in Molecular Biology. USA: John
Wiley & Sons, Inc.

Fatchiyah. Estri Laras Arumingtyas. Sri Widyart. Sri Rahayu. 2011. Biologi
Molekuler Prinsip Dasar dan Analisis. Erlangga: Jakarta

Holme, D. J. & Hazel P. 1998. Analytical biochemistry .England : Pearson

Education Limited

Keller, G. H. & Mark, M. Manak. 1989. DNA Probes. Macmillan. ISBN:

0935859632, 9780935859638.

Promega Corp. 2014. DNA purification. http://worldwide.promega.com/:1hlm. 22

November 2017, pk 15.00 WIB.

12
Sanchez, A. 2001. Isolation of Genomic DNA from Feathers. J. Vet.Diagn. Invest.

Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer- Verlag,

Berlin, Heidelberg, New York.

13