Mekanisme Kerja Western Blot

1. Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T atau fibroblas ataupun
sel darah tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin.
2. Menyiapkan buffer agar pH dapat berada pada jangkauan yang stabil.
3. Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai pelacak
Monoklonal antibodi maupun poliklonal antibodi dapat digunakan
a. Antibodi monoklonal adalah yang lebih baik digunakan, karena :
Sinyal yang lebih baik
Spesifisitas yang lebih tinggi
Hasil yang lebih jernih pada proses pembuatan film western blot
b. Antibodi Poliklonal
- Mengenali lebih banyak epitop
4. Melisis Sel
Kita perlu melisis sel untuk mengeluarkan protein yang diinginkan dari sel. Untuk
melisis sel dapat digunakan detergen SDS dan RIPA. Bila yang diinginkan adalah
sebuah protein yang terfosforilasi, maka perlu ditambahkan inhibitor fosfatase agar
gugus fosfat pada protein tersebut tidak dibuang. Cara melisis : sentrifuge dan ambil
pellet yang terbentuk. Jaga agar tetap dingin dengan menggunakan kotak es.
Tambahkan buffer lisis, lalu kumpulkan dalam tabung eppendorf, jaga agar tetap
dingin.
5. Gel Elektroforesis
Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide
gel electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dengan adanya
arus listrik. Akrilamid 10% juga ditambahkan. Kerja SDS-PAGE ini adalah dengan
mendenaturasi polipeptida setelah terlebih dahulu polipeptida tersebut dibuang
struktur sekunder dan tersiernya. Sampel terlebih dahulu dimasukkan ke dalam sumur
gel. Satu jalur biasanya untuk satumarker. Protein sampel akan memiliki muatan yang
sama dengan SDS yang negatif sehingga bergerak menuju elektroda positif melalui
jaring-jaring akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat melewati
jaring-jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan pergerakan ini akan terlihat pada pitapita yang tergambar pada tiap jalur.
6. Transfer Gel
Agar protein tersebut dapat diakses oleh antibodi, maka protein tersebut harus
dipindahkan dari gel ke sebuah kertas membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF.
Membran ini diletakkan di atas gel, dan tumpukan kertas penyerap diletakkan di
atasnya. Larutan buffer kemudian akan merambat ke atas melalui reaksi kapiler
dengan membawa protein-proteinnya.
Cara lain untuk mentransfer protein adalah dengan menggunakan teknik
elektroblotting. Teknik ini menggunakan arus listrik untuk menarik protein dari gel ke
membran.
Selain itu, diperlukan pula sebuah prosedur untuk mencegah terjadinya interaksi
antara molekul-molekul yang tidak diinginkan agar hasil yang diperlukan lebih jernih
(to reduce noise). Caranya adalah dengan menempatkan membran pada BSA
(Bovine serum albumin) atau non-fat dry milk dengan sedikit detergen tween 20

sehingga serum tersebut akan menempel pada pada daerah yang tidak ditempeli
protein sampel. Hal ini bertujuan untuk membuat antibodi hanya akan dapat
menempel pada binding site protein target. Setelah itu, barulah membran dengan
protein sampel tersebut diinkubasi dnegan antibodi.
7. Deteksi
Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah dimodifikasi bersama dengan sebuah
enzim yang disebut reporter enzyme. Proses deteksi biasanya berlangsung dalam dua
tahap, yaitu :
a. Antibodi Primer
Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi yang pertama kali dihasilkan sistem
imun ketika terpajan protein target. Antibodi terlarut kemudian diinkubasi bersama
kertas membran paling sedikit selama 30 menit.
b. Antibodi Sekunder
Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas mebran dibilas terlebih dahulu
barulah diinkubasi dengan antibodi sekunder. Antobodi sekunder adalah antobodi
yang spesifik untuk suatu spesies pada antibodi primer. Misalnya, anti-tikus hanya
akan berikatan pada antibodi primer yang berasal dari tikus. Antibodi sekunder
biasanya berikatan dengan enzim reporter seperti alkaline fosfatase atau horseradish
peroxidase. Antibodi sekunder ini kemudian akan menguatkan sinyal yang dihasilkan
oleh antibodi primer. Sekarang, proses deteksi dapat dilakukan dengan satu langkah
saja, yaitu dengan menggunakan antibodi yang dapat mengenali protein yang
diinginkan sekaligus memiliki label yang mudah dideteksi
8. Analisis
a. Colorimetric detection
Metode ini digunakan bila substrat dapat bereaksi dengan reporter enzyme sehingga
dapat mewarnai membran nitorselulosa
b. Chemiluminescent
Metode ini digunakan bila substrat merupakan molekul yang bila bereaksi dengan
antibodi sekunder atu dengan reporter enzyme akan teriluminasi. Hasilnya kemudian
diukur dengan densitometri untuk mengetahui jumlah protein yang terwarnai. Teknik
terbarunya yang paking canggih disebut Enhanced Cheiluminescent (ECL). Teknik
inilah yang paling banyak digunakan sekarang.
c. Radioactive detection
Metode ini menggunakan X-ray yang bila mengenai label akan menciptakan region
gelap. Namun metode ini sangat maha dan beresiko tinggi terhadap kesehatan.
d. Fluorescent detection
Pelacak yang mmepunyai label yang dapat mengalami fluorosensi lalu kemudian
dideteksi oleh fotosensor seperti kamera CCD yang menangkap image digital dari
western blot. Hasil kemudian dapat dianalisi secara kuantitaif maupun kualitatif
Metode ini juga merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan karena
sangat sensitif.

Sumber : Andrews AT. Electrophoresis Theory, Techniques, Biochemical and Clinical

Application. Clarendon press : Oxford ; 1986.
Langkah - langkah Kerja Western Blot
1. Alat dan Bahan

Ponceau Solution

TBS Skim Milk 5% : TBS100 ml, Nonfat skim milk 5 g

TBS Tween 0.05%

Antibodi primer

Antibodi sekunder

: Biotin conjungate dan SAHRP

Substrat

: TMB

: Ponceau S2%, TCA30%,Aquades100 ml

: TBS100 ml, Tween 2050 l

: Shigella Ab 49 kDa

2. Procedures

Gel SDS PAGE direndam dalam transfer buffer selama 30 menit

Pita pada gel SDS PAGE ditransfer pada membran NC pada arus 0,3 A dan
tegangan 20 V selama 2 jam

Potong protein penanda, staining dengan ponceau 2% untuk memastikan pita protein
telah tertransfer pada NC

Cuci dengan H2O sampai hanya tersisa warna pita

Block dengan TBS skim milk 5% semalam dengan suhu 4oC

Cuci dengan TBS Tween 0.05% selama 210 menit dan goya pelan

Inkubasi dalam antibodi primer selama 1 jam

Cuci dengan TBS Tween 0.05% selama 210 menit dan goya pelan

Inkubasi pada antibodi sekunder (biotin conjungate) selam 2 jam, suhu ruangan, dan
goyang pelan

Cuci dengan TBS Tween 0.05% selama 210 menit dan goya pelan

Inkubasi dalam SHARP selama 1 jam, suhu ruangan, dan goyang pelan

Cuci dengan TBS Tween 0.05% selama 210 menit dan goya pelan

Berikan substrat TMB selama 20 menit dalam ruangan gelap

Stop dengan aquadest dan keringkan

Metode pemberian warna dapat dikatagorikan menjadi dua, yaitu direct dan indirect.
Direct berarti antibodi primer yang diberikan sudah ditempeli dengan substrat yang
mengandung warna. Indirect berarti kita perlu menambahkan antibodi sekunder yang akan
berikatan dengan antigen-antibodi komplek kemudian antibodi sekunder akan berikatan
dengan substrat berwarna.

Result

Intepretasi hasil dari western blot mirip dengan SDS-PAGE elektroforesis. Kita
menggunakan persamaan regresi linier dari marker yang digunakan sebagai standart. Pita
sampel yang berwarna pada NC merupakan protein dengan berat molekul tertentu yang kita
hitung dengan menggunakan persamaan regresi linier.
Sumber : Kumar V, Abbas AK, Fausto N. Pathologic Basis of Disease. 7th Edition. Elsevier
Saunders : China; 2005, p.314-315; 696-697.