TUGAS KELOMPOK

BIOTEKNOLOGI FARMASI

TUGAS BIOTEKNOLOGI

Dosen Pengampu :

Nur Dina Amalina, M.Sc., Apt.

ROMBEL B

Anggota kelompok 6

1. Ardhia Pramesti Elyan 4313419002

2. Viona Haya Nurikha 4313419032
3. Eka Aprillia Khoirunnisa 4313419034

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2021
A. Isolasi protein dan analisis dengan ELISA untuk TGF-B
Sandwich Indirect ELISA. Prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :
1. Semua reagen, larutan standart disiapkan.
2. Disiapkan pengenceran standart dan wash buffer
a. Pengenceran standart (diencerkan 120 µl Standard Solution kedalam 120 µl Standard
Diluent).

b. Wash Buffer (diencerkan Wash Buffer Concentrate 15 ml kedalam deionized or distilled

water dan di tambahkan 300 ml).
3. Ditambahkan 50 µl standart kemasing-masing well plate.
4. Ditambahkan 40µl sampelke well plate dan10 µl antibody TGF-β, kemudian tambahkan
50 μl streptavidin-HRP ke well plate sampel dan well standart (Not blank control well).
5. Diinkubasi selama semalaman pada suhu 4°C (well ditutup dengan sealer).
6. Sealer dibuka, dan well dicuci sebanyak 3 kali dengan wash buffer.
7. Ditambahkan 50 µl Substrate Solution A kemasing-masing well,kemudian ditambah 50
µl Substrate Solution B
8. Dinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C.
9. Ditambahkan 50µl stop solution kemasing-masing well (warna biru akan berubah
menjadi kuning).
10. Ditentukan Optical Density (OD), dan dibaca dengan Elisa Reader pada panjang
gelombang 450 nm, dalam 30 menit setelah penambahan Stop Solution.
11. Dibuat kurva standart (software MS Excelcurve fitting).
B. Isolasi protein dan analisis dengan Western bloting
Western blot adalah teknik deteksi protein dengan mentransfer protein atau
glikoprotein hasil elektroforesis PAGE ke membran deteksi. Membran ini umumnya
dapat berupa nitrocelulosa dan PVDF (polyvinylidene difluoride), membran yang lain
dapat berupa nylon atau carboxymethyl cellulose.
Langkah-langkah dalam Western Blot :
1) Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T atau fibroblas ataupun
sel darah tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin.
2) Menyiapkan buffer agar pH dapat berada pada jangkauan yang stabil.
3) Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai pelacak
Monoklonal antibodi maupun poliklonal antibodi dapat digunakan
a. Antibodi monoklonal adalah yang lebih baik digunakan, karena :
 Sinyal yang lebih baik
 Spesifisitas yang lebih tinggi
 Hasil yang lebih jernih pada proses pembuatan film western blot
b. Antibodi Poliklonal
 Mengenali lebih banyak epitop

Prosedur kerjanya adalah :

1. Setelah proses SDS-PAGE, rendam gel dalam Towbin buffer selama 20 menit dalam
temperatur ruang.
2. Isislah kurang lebih 2/3 transfer apparatus dengan transfer buffer dan dinginkan pada
suhu 10°C dengan cold-water circulator.
3. Potong membran PVDF sedikit lebih besar dari gel. Rendam membran di dalam 100%
metanol selama beberapa menit (PVDF tidak akan basah langsung di Towbin buffer).
Inkubasi membran dalam transfer buffer selama 10 sampai 15 menit
4. Potong dua lembar kertas Whatman 3mm sedikit lebih besar dari membran dan rendam
dalam transfer buffer. Tinggalkan gel, membran, dan kertas dalam transfer penyangga
sampai sandwich terbentuk
5. Buka kaset yang kosong dan letakan pada nampan. Rakitlah gel- membrane sandwich
seperti nampak dalam gambar. Untuk mempersiapkan sandwich, letakkan spons (sebelum
direndam dalam transfer buffer) di atas salah salah satu penyangga kaset.
6. Tempatkan satu kertas filter di atas spons. Tempatkan gel di atas filter kertas. Sekarang
lapisi dengan hati-hati membran di atas gel, jangan sampai membentuk gelembung gas
(hapus gelembung yang terbentuk). Perhatikan juga jangan sampai kering spons, gel, atau
membran selama perakitan. Isikan beberapa mililiter transfer buffer di dalam nampan.
7. Tempatkan kertas filter kedua di atas membran dan yang terakhir spons kedua di atas
kertas filter. Kuncilah kaset dan tempatkan pada transfer apparatus, dengan sisi membran
ke arah anoda serta sisi gel menghadap katoda. Tambahkan transfer buffer jika
diperlukan. Tutup kembali elektroforesis apparatus dan hubungkan elektroda dengan catu
daya.
8. Running proses transfer pada arus 60 sampai 80 volt atau 0,4 ampere selama 60 samai 99
menit. Secara umum protein-protein di atas 100 kDa dapat ditransfer dengan baik pada
kondisi transfer tersebut.
9. Pada akhir transfer, matikan listrik dan lepaskan kaset dari tranfer apparatus. Pisahkan
membran dari gel dan tandai sisi membran dimana protein bergerak. Membran seakrang
sudah siap untuk immunodetection atau deteksi lainnya.

Pewarnaan dengan Coomassie Brilliant Blue Bahan :

1. Stanining solustion : 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue dalam 40% metanol /
10% asam asetat
2. Destaining solution: 40% metanol / 10% asam asetat
Cara kerja :
1. Cat membran dengan larutan pewarna (staining solution) selama 1 sampai 5 menit,
sampai nampak protein yang dimaksud.
2. De-stain dengan Destaining solution sampai latar belakang menjadi bersih.
3. Bilas membran dengan air, kemudian periksa hasilnya.
Hasil Diskusi :
1. Isolasi protein dari jaringan dan sel, apakah perbedaanya?
Jawab
Isolat protein adalah produk turunan yang memiliki kandungan protein hingga
90% dalam berat kering. Tahapan dalam isolasi protein biasanya terdiri dari 2 tahap
yaitu penghancuran sel dan pemisahan partikel tertentu dari suspensi melalui
sentrifugasi. Perbedaan isolasi protein dari jaringan dan sel adalah pengisolasian
protein dari sel dengan cara memecah dinding sel dan memperluas permukaan
sampel agar dapat mempermudah proses ekstraksi sehingga Interaksi antara sampel
dan pelarut akan semakin luas. Selain itu, dapat penambahan Larutan Buffer
Penambahan buffer ekstrak selama penggerusan bertujuan untuk mempertahankan
agar kondisi komponen sel tetap optimum seperti keadaan yang sebenarnya dan tidak
mengalami perubahan.  Sedangkan isolasi protein dari jaringan dengan
cara memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri.
2. Prinsip karakterisasi protein dengan metode western bloting?
Western blotting adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke
membran. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga
protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun
fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip
imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian
antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau
secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer
dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan
membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap
Prinsip dari Western blot adalah adanya interaksi yang spesifik antara antibodi dan
antigen (Wadsworth, 2006). Western blot efektif untuk mendeteksi antigen yang
memiliki ukuran kecil di dalam larutan yang banyak mengandung protein (Rantam,
2003).
3. Prinsip karakterisasi protein dengan metode ELISA?
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay) merupakan suatu uji biokimia
yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan antibodi atau antigen dalam suatu
 sampel dengan pelabelan enzim yang biasa disebut enzim immunoassay (Stanley
2002). Prinsip utama teknik ELISA adalah penggunaan indikator enzim untuk reaksi
imunologi. ELISA digunakan untuk mendeteksi IgG yang diproduksi setelah infeksi
(Akonor et al., 2018). IgG terbentuk setelah IgM yang merupakan respon paling awal
dan jumlah terbanyak ketika vaksinasi pertama. IgG  adalah antibodi utama yang
dihasilkan setelah vaksinasi dan imunoglobulin yang dominan dalam serum  darah.
Selain itu, IgG membangun sistem pertahanan terhadap bakteri dan virus.
4. Menurut anda metode ELISA dan Western blot, manakah yang lebih
representatif dalam analisa protein?
Uji identifikasi dengan Western Blot dapat memberikan hasil yang lebih baik dari
ELISA karena pada Western Blot, antigen telah dipisahkan berdasarkan berat
molekulnya sehingga sampel hanya dinyatakan positif bila menunjukan adanya pita
yg spesifik menurut antigennya (Micklos et al. 2003). Teknik ELISA pada dasarnya
merupakan metode yang terbilang sensitif untuk mendeteksi protein tetapi kurang
spesifik sehingga dapat terjadi kemungkinan adanya positif palsu (false positive).
Pengertian dari nilai hasil positif palsu yaitu bahwa sampel uji ELISA yang
memberikan hasil positif, setelah diuji kembali dengan uji peneguhan yang lebih
spesifik akan memberikan hasil yang negatif. Sebaliknya nilai hasil negatif palsu
berarti sampel hasil uji ELISA yang negatif, setelah diuji ulang dengan uji
peneguhan maka akan memberikan hasil yang positif.

Daftar Pustaka :
http://www.elisa-antibody.com/ELISA-Introduction/ELISA-types/sandwich-elisa.html