LAPORAN PRAKTIKUM DOT BLOT

Tugas Individu Mata Kuliah Metodelogi Riset II

Dosen Pengampu: Prof. Dr. Dra. Sri Winarsih, M.Si., Apt

Oleh :

RASYIDAH
196070400111016

PROGRAM STUDI MAGISTER KEBIDANAN

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
TAHUN 2020
A. Dasar Teori
Immunoblotting merupakan suatu tehnik untuk memindahkan atau tranfer
protein dari gel poliakrilamid ke permukaan membran. Umumnya membran yang
di gunakan adalah membran nitroselulosa atau polyvinylidene diffluride (PVDF).
Imunoblotting merupakan tehnik analisis protein yang memanfaatkan reaksi
antibodi dan antigen sebagai pendeteksi protein target. Protein di deteksi dengan
cara penambahan antibodi spesifik yang di sebut sebagai sebagai antibodi primer.
Antibodi primer ini mempunyai sifat antigenesitas yang dapat berikatan dengan
protein dengan protein spesifik pada permukaan membran. Setelah itu di
tambahkan antibodi sekundar konjugat yang akan berikatan dengan antibodi
protein membentuk kompleks. Penambahan substrat akan bereaksi dengan
konjugat sehingga menimbulkan pita protein yang dapat terlihat pada permukaan
membran. Visualisasi pita protein target dapat menggunakan substrat alkaline
phosphate, peroksidase, substrat kromogenik, atau X-Ray (Kurien 2011)
Dot Blot adalah sebuah tehnik untuk mendeteksi, menganalisis dan
mengidentifikasi protein. Tehnik ini menyerupai tehnik western Blot namun
perbedaannya adalah protein sampel tidak di pisahkan melalui elektroforesis akan
tetapi di tandai dengan templete sirkuler secara langsung pada substrat kertas.
Konsentrasi protein dalam preparasi mentah atau kasar (misal kultur supernatan)
dapat di perkirakan secara semikuantitatif dengan menggunakan tehnik ini jika
dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut
Dot blot dapat di gunakan untuk perhitungan kualitatif pada raid screaning
dari jumlah sampel yang besar atau sebagai tehnik kuantitatif dan terutama
berguna untuk menguji kesesuaian parameter desain experimental (Smith J, Et al,
2012)
Tehnik dot blot memiliki efisiensi waktu yang signifikan dimana prosedur
blotting yang kompleks untuk tranfer gel tidak di perlukan namun kekeurangan
metode blot adalah tidak dapat digunakan untuk mengetahui ukuran molekul
target selain itu jika dua molekul yang berbeda ukuran terdeteksi mereka akan
tetap muncul sebagai satu titik. Oleh karena itu dot blot hanya dapat di gunakan
untuk mengkonfirmasi ada atau tidak adanya molekul (yang dapat di deteksi oleh
probe DNA atau antibodi) hasil positif apabila terbentuk dot-dot pada membran
nitroselulose kualitas hasil di lihat berdasarkan gradasi warna.
B. Tujuan
Penulisan Laporan Praktikum ini diharapkan dapat membantu praktikum
lebih memahami dan mengetahui prinsip kerja dan Prosedur kerja dot blot
C. Waktu Pelaksanaan Kegiatan Praktikum
Praktikum dilaksanakan secara daring melalu aplikasi zoom pada hari Jumat
Tgl 8 Mei 2020 Jam: 08.00-11.00 WIB
D. Alat dan Bahan
Alat : Dot Blotter, Apparatus (Bio rad), Vacum pamp, refrigerator,
mikropipet, yellow tip, white tip, shaker skener, dan komputer
Bahan : membran niroselulose, pili protein H2O, TBS Skin Milk 5%, TBS
Tween 0,05%, antibodi primer,, TBS Tween 0,05%, bsa 0,02%, antibodi
secunder MMP (M17): sc-6841 (poliklonal anti mouse), enzim AP,
BCIP/NBT Phosphat substrate, aquadest
E. Prosedur Kerja
1. Siapkan alat Dot Blot, rangkai dengan benar (karet Dot Blot harus pas
dengan lubang), posisi knop/kran pada Selang harus tertutup.
2. Potong Nitro Cellulose Membran dengan ukuran sesuai dengan jumlah
sampel
3. Rendam larutan TBS dengan aquadest sampai terbasahi sempurna kurang
lebih 30 menit
4. Pasang pada alat Dot Blot, basahi dengan larutan TBS.
5. Coating sampel yang sudah dilarutkan dalam larutan TBS dengan
kosentrasi tertentu sebanyak 50 l untuk setiap sumuran. Diinkubasi
selama overnight 40.
6. Hindari coating dengan menggunakan degas karena sampel tidak akan
sama terserap merata pada berbagai bagian dot blot apparatus
 AG AG AG AG AG AG AG AG AG AG AG
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/102
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40
AB
1/100
AB
1/200
AB
1/400
AB
1/800
AB
1/1600
AB
1/3200
AB
1/6400
AB
1/1280
0

7. Bloking dengan larutan TBS-Skim 5% sebanyak 50 l untuk Setiap

sumuran
8. Inkubasi selama 30 menit pada suhu ruang (tutup lubang dengan
alumunium foil).
9. Cuci dengan TBS-tween 0,05 % 3x5 menit, dishaker.
10. Cairan didekantasi/dibuang pada tissue.
11. Inkubasi dengan Antibodi primer dengan kosentrasi / pengenceran tertentu
yang dilarutkan dalam TBS-Skim milk 0,05 % sebanyak 50 l untuk
Setiap sumuran . Inkubasi selama 2 jam jika menggunakan antibody
monoclonal . Jika menggunakan antibody poliklonal maka diinkubasi
overnight 40
12. Cuci dengan TBS-tween 0,05 % 3x5 menit, dishaker.
13. Cairan didekantasi/dibuang pada tissue.
14. Inkubasi dengan Antibodi sekunder-berlabel yang dilarutkan dalam TBS
50 l untuk Setiap lubang selama 1 jam pada suhu ruang.
15. Cuci dengan TBS-tween 0,05 % 3x5 menit, dishaker.
16. Cairan didekantasi/dibuang pada tissue.
 17. Inkubasi dengan SAHRP yang dilarutkan dalam TBS 50 l untuk Setiap
well selama 40 pada suhu ruang (jika antibody sekunder yang digunakan
berkonjugat biotin)
18. Cuci dengan TBS-tween 0,05 % 3x5 menit, dishaker.
19. Cairan didekantasi/dibuang pada tissue.
20. Inkubasi dengan substrat 50 l untuk Setiap lubang selama maksimal 20
menit atau sampai ada perubahan warna pada suhu ruang di ruang gelap.
Jika antibody sekunder yang digunakan berkonjugat -Hrp maka subtran
yang digunakan TMB membrane, namun jika antibody sekunder yang
digunakan berkonjugat -Ap maka subtract yang digunakan BCIPNBT
21. Stop reaksi dengan akuades steril 50 l untuk Setiap lubang.
22. Analisis densitas warna dapat menggunakan program image J
RESEP PEMBUATAN LARUTAN :
Tris Base Solution (TBS) :
o Tris Base 0,606 gram
o NaCl 1,168 gram
o Akuades steril 100 ml, adjust pH 7,4
o Transfer Buffer : - Tris Base 0,303 gram
o Glycine 1,44 gram
o Methanol 20 ml
o Akuades steril sampai dengan 100 ml.

F. Kesimpulan
- Dot blod merupakan uji serologis, yang fungsinya sama dengan western
Blott yaitu untuk mendeteksi kespesifikan reaksi antara antigen dan antibodi
- Hasil positif apabila terbentuk dot-dot pada membran nitroselulose kualitas
hasil dilihat berdasarkan gradasi warna
 LAPORAN PRAKTIKUM WESTERN BLOTTING
Tugas Individu Mata Kuliah Metodelogi Riset II

Dosen Pengampu: Prof. Dr. Dra. Sri Winarsih, M.Si., Apt

Oleh :

RASYIDAH
196070400111016

PROGRAM STUDI MAGISTER KEBIDANAN

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
TAHUN 2020
 PENDAHULUAN

A. Dasar Teori
Western blot adalah tehnik mengidentifikasi antibodi spesifik pada protein
yang telah di pisahkan antara satu dengan yang lain. Menurut ukurannya melalui
elektroforesis gel. Blot merupakan sebuah membran biasanya berbahan dasar
nitroselulose atau PVDF (Polyvilinidine fluoride). Gel di letakkan diatas membran
dan aliran listrik yang menginduksi protein pada gel untuk berpindah pada
membran. Membran tersebut akan menjadi replika dari pola protein pada gel yang
kemudian diwarnai secara esklusial dan antibodi.
Western blot di gunakan secara luas untuk mengidentifikasi dan
mengkuatifikasi protein yang spesifik dalam campuran yang kompleks tehnik ini
memungkinkan deteksi tidak langsung sampel protein yang diimbolisasi pada
membran nitroselulose.
Sampel protein terlebih dahulu di runing dengan SDS PAGE dan secara
elektroforensis di tranfer ke membran setelah langkah bloking, membran di probe
dengan antibodi primer baik monoklonan maupun poliklonan yang jumlahnya
meningkat dibandingkan antigen. Setelah pencucian yang sequesial, membran
kemudian di inkubasi dengan antibodi sekunder yang di kongungasi dengan enzim
yang sifatnya reaktif terhadap antibodi. Pada akhirnya, membran di cuci kembali
dengan substrat dari enzim yang tepat yang akan memproduksi sinyal yang dapat
di rekam (Pierce, 2011)

B. Tujuan kegiatan
Penulisan Laporan Praktikum ini diharapkan dapat membantu praktikum lebih
memahami dan mengetahui prinsip kerja dari western blot dan Prosedur kerja
western blot

C. Pelaksanaan Kegiatan
Praktikum dilaksanakan secara daring melalu aplikasi zoom pada hari
Jumat Tgl 8 Mei 2020 Jam: 08.00-11.00 WIB
D. Alat dan Bahan :
Alat diantaranya : Sentrifus, dry es, inkubator, refrigator, mikropipet, yellow
tip, semy dry transblotter, chamber elektroforesis, plate pembentuk gel and
shaker.bahan yang di gunakan merupakan bahan kimia antara lain gel dari hasil
SDS-PAGE, membran nitroselulosa, H2O, TBS Skin Milk 5%, atibodi primer,
TBS Tween 0,05%, BSA 0,02%, antibodi secunder ( Peroksidase/biotin
Conjugate) ponceu 5%, aquadest, TMB dan kertas saring Whatman.

E. Prosedur kerja
1. Pembuatan Gel SDS PAGE
1) Formulasi Gel
Persentase DD Acrylamide/Bi Gel 10% Keterangan
H2O s Buffer* w/v
SDS
Gel ml Ml ml ml
4% 6.1 1.3 2.5 0.1 Stacking
10% 4.1 3.3 2.5 0.1 Separating
12% 3.4 4.0 2.5 0.1
15% 2.4 5.0 2.5 0.1
*Separating Gel Buffer : 1.5M Tris HCl pH 8.8
* Stacking Gel Buffer : 0.5 M Tris HCl pH 6.8

2) Untuk 10 ml Monomer Solution

Separating Gel Buffer : 50 µl 10% APS (Ammonium Persulfate) dan 5 µl
TEMED
Stacking Gel Buffer : 50 µl 10% APS (Ammonium Persulfate) dan 10
µl TEMED

Penambahan APS dan TEMED dilakukan sesaat sebelum larutan

dituang ke dalam gel cassette

3) Volume yang dibutuhkan Per Gel

Ketebalan Gel (mm) Volume (ml)
0.5 2.8
0.75 4.2
1.0 5.6
1.5 8.4

4) Tuangkan Separating monomer solution ke dalam gel cassette. Diamkan

hingga gel mengeras
5) Tuangkan Stacking monomer solution ke dalam gel cassette yang telah
berisi Separating monomer solution. Tambahkan ddH 2O untuk meng-
adjust volume
6) Pasang cetakan (comb) ke dalam gel cassette,tunggu hingga Stacking gel
mengeras
7) Lepaskan gel cassette dari gel casting, dan masukkan ke dalam chamber
8) Tuangkan Running buffer hingga gel cassette terendam sempurna
Persiapan Sampel
1. Siapkan sampel protein dengan kosentrasi diatas 5 mg/ml
2. Tambahkan RSB (Reducing Sample Buffer) ke dalam sampel dengan
perbandingan 1:1
0
3. Panaskan pada suhu 95 selama kurang lebih 5 menit untuk
mendenaturasi protein
Running Gel
1. Masukkan 10 µl marker protein ke dalam well
2. Masukkan sampel ke dalam masing-masing well yang telah tercetak (
± 15-20 µl/well)
3. Running gel selama 90 menit dalam larutan running buffer dengan
tegangan 100V, constant voltage.
4. Perhatikan pergerakan marker protein dan tracking dye (berwarna
biru)
5. Jika tracking dye sudah mencapai garis hijau dari gel cassette, proses
running dapat dihentikan
Staining Gel
1. Lepaskan gel dari gel cassette secara perlahan
2. Masukkan ke dalam staining box
3. Tuangkan larutan Staining buffer coemasie blue hingga gel terendam
sempuran. Inkubasi selama ± 4 jam-overnight dalam shaker inkubator
4. Ganti larutan staining buffer dengan larutan de-staining buffer.
Inkubasi dalam shaker inkubator hingga pita pita protein tampak
jelas.
 Analisis Gel SDS PAGE
Gel akan didokumentasikan dan dianalisis menggunakan alat Gel doc EZ Gel
Documentation System- Biorad .
Hasil :

Lampiran Bahan :
Reducing Sample Buffer (RSB) ;
Tris-cl PH 6,8 1 ml, Gliserol 0,8 ml, SDS 10% 1,6 ml, β-mercapto etanol
0,4 ml, Bromo Phenol Blue 1% 0,2 ml, ditambahkan dH20 sampai 12 ml
Staining Coemassie blue ;
Coemassie 0,25, Methanol 40 ml, Asetic acid glacial 10 ml ditambahkan
dH20 sampai 100 ml
Destainning Buffer ;
Methanol 20 ml, Asetic acid glacial 10 ml ditambahkan dH20 sampai 100
ml
Running Buffer ;
Trisbase 3,03 gram, Glycine 14,4 gram , SDS 1 gram ditambahkan dH20
sampai 1000 ml
Proses Transfer menggunakan system semidry transfer :
a. Rendam nitroseluloce membran 7x9 cm dan gel elektroforesisi SDS
PAGE masing-masing dalam tranfer buffer selama 30 menit di shaker
b. Seting alat : trans blot semi dry merk biora
c. Susun sandwich (urutan dari bawah keatas) meliputi : Kertas saring,
membran NC, Gel SDS PAGE dan kertas saring
d. Running pada 300 mA, 20 Volt selama 2 jam untuk proses transfer pita
protein dari gel SDS PAGE ke membran NC.
e. Angkat NC dan cuci dengan akuades.
f. Konfirmasi keberhasilan proses transfer
g. Rendam dalam ponceau  1 - 5 menit, dan bilas dengan akuades , jika
menggunakan metode ini maka hasil wb akan tampak lebih kotor. Jika
tidak mengunakan ponceau dapat dilihat dari keberhasilan marker protein
tertransfer ke notrocelulosa membrane
2. Proses immunoblotting
a. Bloking dengan TBS Skim milk 5 %, inkubasi selama 30 menit
b. Cuci NC dengan TBS-tween 0,05 % 3x5 menit, dishaker.
c. Inkubasi dengan Antibodi primer yang dilarutkan dalam TBS-T 0,05 %
selama 2 jam pada Suhu ruang jika menggunakan antibody monoclonal,
jika antibody poliklonal diinkubasi overnight
d. Cuci NC dengan TBS-tween 0,05 % 3x5 menit , dishaker.
e. Inkubasi dengan Antibodi sekunder-berlabel yang dilarutkan dalam TBS
selama 1 jam pada suhu Ruang.
f. Cuci NC dengan TBS-tween 0,05 % 3x5 menit , dishaker.
g. Inkubasi dengan SAHRP yang dilarutkan dalam TBS selama 40 menit
pada suhu ruang (jika antibody primer berkonjugat biotin )
h. Cuci NC dengan TBS-tween 0,05 % 3x5 menit , dishaker.
i. Inkubasi dengan substrat (TMB Membrane) sampai dengan muncul pita
protein (jika antibody sekunderny yang digunakan berkonjugat HRP)
gunakan subttrat BCIPNBT ( jika antibody sekunderny yang digunakan
berkonjugat AP)
 j. Stop reaksi dengan akuades steril, kering anginkan membran NC
kemudian scan hasilnya.
k. Hasil WB didokumentasikan menggunakan scanner
l. Pengukuran densitas warna band dapat dilakukan dengan menggunakan
program Image j
F. Kesimpulan
1. Western Blot merupakan metode untuk mengidentifikasi antibodi spesifik
pada suatu protein dengan berat molekul tertentu yang telah di separasi.
Pada awalnya berat molekul protein diseparasi atau dipisahkan dengan
menggunakan SDS PAGE Elektroforesis dan di tranfer ke membrane
nitroselulose (NC) selanjutnya dilakukan labeling antibodi
2. Pada dasarnya prosedur dari western blod adalah gel SDS –PAGE ditranfer
ke membrane nitroselulose selanjutnya imunostaining (bloking Non
spesifik, inkubasi antibody primer, inkubasi antibody secunder, inkubasi
enzim SA-HRP dan inkubasi Substrat)
3. Identifikasi berat molekul sampel dengan cara membandingkan band yang
terpendar pada membran nitroselulose sejajar dengan marker.
LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOHISTOKIMIA (IHK)
Tugas Individu Mata Kuliah Metodelogi Riset II

Dosen Pengampu: Prof. Dr. Dra. Sri Winarsih, M.Si., Apt

Oleh :

RASYIDAH
196070400111016

PROGRAM STUDI MAGISTER KEBIDANAN

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
TAHUN 2020
A. Dasar Teori
Tehnik imunohisto/ sitokimia bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi,
karakterisasi suatu protein atau antigen tertentu merupakan pemeriksaan kualitatif
ada atau tidak pada labaratorium patologi anatomi untuk menetukan diagnosis
terapi dan prognosis kanker. Detektor dengan menggunakan antibodi yang dilabel
enzim atau zat fluoresen target melekul sel akan berwarna dan untuk observasi di
perlukan mikroskop. Prinsip meodr terbagi 2 yaitu indirect merupakan antibodi
primer sebagai detektor di label enzim /zat fluoresen dan indirect merupakan
antibodi detektor adalah antibodi sekunder dilabel enzim atau zat flouresen
Interaksi antara antigen dan antibodi adalah reaksi yang tidak kasat mata. Oleh
karena itu, diperlukan visualisasi adanya ikatan tersebut dengan molekul antibodi
yang digunakan dengan enzim atau fluorokrom. Enzim (yang dipakai untuk
molekul) selanjutnya direaksikan dengan substrat chromogen (yaitu substrat yang
menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut) yang dapat diamati dengan
mikroskop bright fiekl (mikroskop bidang terang). Imunohistokimia yang
menggunakan fluorokrom untuk molekul antibodi, dapat langsung diamati
dibawah mikroskop fluorescence.
Berbagai jenis molekul yang yang terkandung dalam sel dapat dideteksi dengan
teknik ini, termasuk berbagai jenis reseptor, onkoprotein, faktor pertumbuhan dan
protein-protein lainnya. Dengan ditemukannya teknik ini maka berbagai
pemahaman-pemahaman baru di bidang penyakit, termasuk onkologi, menjadi
semakin baik sehingga telah membawa dunia kedokteran kepada era yang baru.
Imunohistokimia menjadi teknik pilihan untuk menentukan petanda-petanda
biologik tersebut karena relatif mudah, murah dan dapat diterapkan pada sediaan
rutin histopatologik. Namun demikian perlu diperhatikan sejumlah faktor yang
dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan, dimana pengaruh faktor-faktor tersebut
dimulai dari tahap pembedahan, pengolahan jaringan hingga penilaian hasil
pulasan.
B. Tujuan
1. Mampu memahami metode yang dilakukan dalam melakukan proses
imunohistokimia
2. Mampu memahami tehnik dasar imunohistokimia
3. Mampu memahami mekanisme imunohistokimia

C. Waktu pelaksanaan kegiatan praktikum

Praktikum dilaksanakan secara daring melalu aplikasi zoom pada hari Jumat
Tgl 8 Mei 2020 Jam: 08.00-11.00 WIB

D. Alat dan Bahan

Becker Glass, Microwave, Objek Glass, Deck Glass, Pipet tetes, Tissue,
Waterbath, Chambers, Kulkas, Erlenmeyer, Gelas ukur

E. Prosedur Kerja
Rangkaian pemeriksaan imunohistokimia di mulai dengan pengambilan
sampel, pembuatan parafin block dan pewarnaan imunohistokimia dengan
prosedur sebagai berikut
1. Pengambilan sampel
Sampel diambil sesuai dengan kebutuhan yang di butuhkan dalam penelitian
yang akan di lakukan
2. Pembuatan parafin Block
1) Jaringan di cuci dengan PBS
2) Difiksasi dengan formalin 10%
3) Dilakukan dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat (30%, 505,70%,
80%, 96% dan absolute)
4) Clearing menggunakan xilol 2 kali masing masing 60 menit
5) Infiltrasi menggunakan parafin lunak selama 60 menit pada suhu 480ºC
6) Block dalam paraffin keras pada cetakan dan diamkan selama sehari
 7) Tempelkan pada holder dilakukan pemotongan setebal 4-6 mm dengan
rotary microtome
8) Mounting pada objek dengan gelatin 5%
3. Prosedur Imunostaining untuk Jaringan yang Difiksasi dengan Formalin
1. Deparafinasi
Tujuan dari deparafinasi ini adalah menghilangkan paraffin. Slide
dipanaskan pada suhu 600C selama 60 menit. Kemudian direndam
dalam larutan-larutan dibawah ini secara berurutan:
 Sampel direndam dalam Xylen 1 didiamkan selama 10 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi Xylen 2 didiamkan
selama 10 menit
2. Rehidrasi
Direndam dengan alcohol seri menurun, agar jaringan yang hidroprof
dapat mudah mengenali air dan air bisa lebih mudah masuk ke jaringan.
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 100% A (yang
pertama) didiamkan selama 10 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 100% B (yang
kedua) didiamkan selama 10 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 90% didiamkan
selama 5 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 80% didiamkan
selama 5 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 70% didiamkan
selama 5 menit
 Dicuci dengan air mengalir selama 5 menit
3. Antigen Retrieval dengan Buffer Sitrat
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi Citrate Buffer
 Dimasukan ke dalam microwave selama 5 menit, citrate buffer
ditamah apabila berkurang (langkah ini diulangi hingga mencapai
waktu 15 menit) dipanaskan 980C dengan 300 volt.
  Sampel dipindahkan ke humidity chamber
 Sampel dikeringkan menggunakan kertas tisu pada permukaan
bawahnya dan sekitar jaringan (tanpa menyentuh jaringan).
4. Imunohistokimia
 Sampel diteteskan H202 3% sebanyak 60-200 µL didiamkan selama 5
menit.
 Sampel dicuci dengan 1000 µL PBS sebanyak 3 kali selama 2
menit.
 Sampel dikeringkan menggunakan kertas tisu pada permukaan
bawahnya dan sekitar jaringan (tanpa menyentuh jaringan).
 Diteteskan larutan background sniper (Starr Trek Universal- HRP
Detection Kit) Sampel ditutup menggunakan parafilm didiamkan
selama 1 jam di suhu ruang tetap di chamber untuk membloking
protein yang tidak spesifik.
 Sampel dicuci dengan 1000 µL PBS sebanyak 3 kali selama 2
menit.
 Diteteskan 70-100 µL antibodi primer, pengenceran antibody bias di
trial dari 1: 250 atau 1:100 tergantung mana yang lebih efektif.
 Diinkubasi pada suhu 40 c selama semalaman.
 Keesokan harinya dikeluarkan dari suhu 40 c ditunggu sampai suhu
ruang.
 Sampel dicuci dengan 1000 µL PBS sebanyak 3 kali selama 2
menit.
 Sampel dikeringkan menggunakan kertas tisu pada permukaan
bawahnya dan sekitar jaringan (tanpa menyentuh jaringan).
 Diaplikasikan antibody sekunder, larutan Trekkie Universal Link
(Starr Trek Universal – HRP Detection Kit).
 Sampel ditutup menggunakan parafilm didiamkan selama 1 jam suhu
ruang
  Sampel dicuci dengan 1000 µL PBS sebanyak 3 kali selama 2
menit.
 Sampel dikeringkan menggunakan kertas tisu pada permukaan
bawahnya dan sekitar jaringan (tanpa menyentuh jaringan).
 Sampel diteteskan SA-HRP diinkubasi selam 45 menit suhu ruang.
 Sampel dicuci dengan 1000 µL PBS sebanyak 3 kali selama 2
menit.
 Sampel dikeringkan menggunakan kertas tisu pada permukaan
bawahnya dan sekitar jaringan (tanpa menyentuh jaringan).
 Diteteskan 100 µL larutan chromagen DBA (buffer 1:40) diinkubasi
sampai 20 menit (tergantung pengamatan mikroskopis) pada suhu
ruang.
 Dicuci dengan aquadest selama 3 x 2menit
 Diteteskan Mayer’s Hematoxilen (Mayer’s Hematoxilen : aquades =
1:3), inkubasi 1 - 10 menit pada suhu ruang.
 Dicuci di air mengalir selama 5 menit.
5. Dehidrasi (pengeringan) dengan alcohol seri naik
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 70% didiamkan
selama 5 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 80% didiamkan
selama 5 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 90% didiamkan
selama 5 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 100% B
didiamkan selama 5 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi EtOH 100% A
didiamkan selama 5 menit
 Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi Xylen 2 didiamkan
selama 10 menit
  Sampel dipindahkan ke dalam wadah berisi Xylen 1 didiamkan
selama 10 menit
6. Mounting Dengan Entellan
 Mounting jaringan dengan meneteskan entellan dan ditutup dengan
kaca penutup, ditunggu kering keesokan harinya bari diamati.
 Hasil immunohistokimia dapat diamati menggunakan mikroskop
yang telah terhubung dengan computer.

F. Kesimpulan
1. Imunohistokimia dapat digunakan untuk mendeteksi berbagai penyakit,
seperti kanker, tumor dan dapat digunakan untuk identifikasi sel atau
jaringan. 
2. Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur
derajat imunitas atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan.
Pewarnaan sediaan jaringan menimbulkan ikatan antibodi pada antigen di
permukaan atau didalam sel yang selanjutnya dapat dideteksi dengan cara
dilabel dengan enzim, isotop, fluoropore,atau coloidal gel. Metode yang
dilakukan dalam Imunohistokimia adalah metode direct, metode indirect,
Metode Peroxidase – anti – Peroxidase (PAP), Metode Avidin-Biotin-
Complex (ABC).