ISOLASI DNA PLASMID

WAFIYYATUNNUFUS
P051194131

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2020
 1

1. PENDAHULUAN

Latar Belakang
Isolasi DNA bakteri merupakan pemisahan molekul DNA dari sel bakteri.
Isolasi yang dilakukan pada praktikum ini menggunakan metode boiling. Pada
metode bakteri dipanaskan pada suhu tinggi sehingga dinding selnya lisis.
Pengenalan isolasi DNA penting dipelajari untuk bidang biologi molekuler.
Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman seperti padi, kapas,
dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman
hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran yang
kritis.
Plasmid merupakan DNA sirkular untai ganda ekstrakromosomal pada
bakteri dengan panjang kurang dari 20 kb yang dapat bereplikasi sendiri, sehingga
memungkinkan terdapatnya banyak kopi dalam satu sel (Willey et.al., 2011).
Plasmid hampir selalu membawa gen tertentu (satu atau lebih gen) dan umumnya
gen tersebut mengkode sifat-sifat penting yang ditunjukkan oleh bakteri asal.
Plasmid membawa tipe gen yang sangat bervariasi fungsinya, seperti resistensi
antibiotik, resistensi logam berat, sensitif terhadap mutagen, sensitif atau
resistensi bakteriofag, produksi enzim restriksi, produksi asam amino, produksi
toksin, penentu virulensi, katabolisme molekul organik kompleks, kemampuan
pembentukan hubungan simbiosis, dan transfer DNA antar spesies (Hogg, 2005;
Brown, 2006).
Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu
tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid.
Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri
sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak.
Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar
dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein,
fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas
membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Brock et
al., 1994).

Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan mengisolasi DNA plasmid dari bakteri Escherichia

coli dan menganalisis DNA tersebut secara kualitatif dan kuantitatif.

2. METODE PRAKTIKUM

Waktu dan Tempat

Praktikum dilaksanakan pada tanggal 8 sampai 15 Agustus 2020 pukul

10.00-13.00 WIB. Dilakukan di Laboratorium BIORIN, Gedung Pusat Antar
Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor.

Alat dan Bahan

2

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung mikro steril
1.5 ml, pipet mikro (100 μL, 200 μL, dan 1000 μL), MaxiMix®II vortex mixer
(Thermo Scientific, Jerman), microlitre centrifuges Z 216 MK (HERMLE
Labortechnik GmbH, Jerman), SorvallTM LegendTM Micro 17 microcentrifuge
(Thermo Scientific, Jerman) lemari pendingin, microwave, perangkat
elektroforesis Mupid®exU (Eurogentec, Belgia), Maestro nanopro (alat
nanophotometer).
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi plasmid adalah kultur bakteri
Escherichia coli, Larutan resuspensi, larutan lisis, larutan netralisasi, PCL (Phenol
: Chloroform : Isoamylalcohol) 25:24:1 vol, NaOAc 2 M pH 5.2, EtOH100 % dan
70 %, RNAse 1 mg/ml, Buffer tris-acetic acid EDTA (TAE) 1x, Agarosa, Loading
dye 6x, DNA Maerker Lambda, Ethidium bromide 1 mg/ml, ddH2O.

Prosedur Praktikum
Isolasi DNA Plasmid
Bakteri Escherichia coli yang akan dilakukan isolasi DNA Plasmid sudah
dikulturkan dalam medium LB dan diinkubasi selama 24 jam. Tabung mikro 1,5
ml disiapkan untuk isolasi DNA Plasmid. Sebanyak 15 ml kultur bakteri
Escherichia coli diambil kemudian sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm
selama 5 menit. Terbentuk pellet endapan, supernatant dibuang kemudian
ditambahkan larutan resuspensi sebnayak 250 µl kemudian cairan diresuspensi.
Cairan lisis sel dimasukkan sebanyak 250 µl, bolak balik tube perlahan sektar 10x.
Selanjutnya ditambhakan larutan netralisasi sebanyak 250 µl, bolak balik tube
perlahan sekita 10x. Setelah itu, sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10000
rpm selama 10 menit. Supernatant diambil dan ditambahkan PCL
(phenol;chloroform;isoamylalcohol) sebanyak 1x volume supernatant yang
terambil, homogenkan dengan vortex kemudian di sentrifugasi dengan kecepatan
10000 rpm selama 10 menit. Tabung baru disiapkan dan cairan fase atas
(terbentuk 2 fase pada tabung) dipindahkan ke tabung baru. Kemudian
ditambahkan 0,1 x volume NaOAc 2M. Selanjutnya ditambahkan 2-3x volume
EtOH 100%, bolak balik tube perlahan sekitar 10x. Setelah itu dimasukkan
kedalam lemari pendingin dengan suhu -25°C selama semalam. Setelah diinkubasi
semalam, sampel disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm dan suhu 4°C selama
25 menit. Supernatant dibuang hingga tersisa endapan dan ditambahkan EtOH
70% sebanyak 500 µl sebagai larutan pencuci (washing), kemudian disentrifugasi
kembali pada kecepatan 10000 rpm dengan suhu 4°C selama 5 menit. Supernatant
dibuang kemudian keringkan sampel dengan vacuum dryer dengan suhu 60°C
selama ± 10 – 15 menit. Kemudian ditambahkan 15-20 µl ddH20, disetrifugasi
untuk menurunkan cairan yang menempel di dinding tabung, dan ditambahkan
RNAse 0,2 x volume. Sampel diinkubasi selama 10 menit dan simpan di freezer -
25°C sebelum diuji selanjutnya.

Pembuatan Agarose
Gel agarose 1% dibuat dengan menimbang sebanyak 0,35 gr agarose, kemudian
TAE 1x ditambahkan sebanyak 35 ml, dipanaskan pada microwave hingga larut
sempurna. Setelah suhu gel agarose tidak terlalu panas, gel dicetak dengan
menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran.
 3

Uji Kualitatif DNA Plasmid (Elektroforesis)

Setelah gel mengeras, sisir dilepas kemudian gel agarose 1% dipindah ke dalam
tangka electroforesis dan direndam dalam bufer TAE 1x hingga setinggi 1-2 mm
di atas gel. Sebanyak 5 μl DNA plasmid dicampur dengan 1 μl larutan Loading
Dye (LD). Kemudian sampel dimasukkan kedalam sumur pada gel agarose dan
ditambahkan DNA marker berupa DNA lambda (marker λ) sebanyak 1µl dan 3µl.
Selanjutnya running dengan tegangan 100 volt selama 28 menit (DNA bergerak
dari muatan negatif ke positif). Setelah itu gel direndam dalam larutan EtBr
(Etidium Bromide) 15 mg/ml selama 10 menit. Setelah itu, dibilas dengan
akuades. Gel hasil elektroforesis diamati dibawah GelDoc/Transluminator.

Uji Kuantitatif DNA Plasmid (Nanophotometer)

Alat nanophotometer (Maestro nanopro) disiapkan dan pilih menu dsDNA
(double strand). Alat dikalibrasi dengan blanko ddH20 sebanyak 2 µl kemudian
tekan tombol blank. Sampel DNA plasmid dimasukkan sebanyak 2 µl dan tekan
tombol sampel, pengukuran diulangi terhadap semua sampel. Tombol ikon home
ditekan untuk mengakhiri lalu simpan, file hasil pengukuran yang telah disimpan
disalin atau pindahkan.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Proses isolasi plasmid dari suatu bakteri, ada tiga tahap penting yang perlu
dilakukan, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi DNA, 3. Pengendapan
DNA. Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS
(sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis
dinding atau membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai
larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain
menjadi single strain). Terjadinya proses lisis ditandai dengan terbentuknya
lendir. Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil supernatannya berupa
lautan suspensi. Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi, terdapat senyawa
DNA plasmid, RNA, Protein, Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Ekstraksi
dilakukan dengan adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol)
dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana
Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan
komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah
disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling
atas tempat DNA plasmid berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di
tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat
chloroform yang berat jenisnya besar. Fase air yang diambil kemudian
diendapkan menggunakan sodium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan
alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA
mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan
penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan
pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabila dilakukan
resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral lagi.
Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA
4

setelah dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE
ataupun dH2O.

Gambar 1. Hasil Uji Kualitatif DNA Plasmid (Elektroforesis)

Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa isolasi DNA plasmid berhasil

ditunjukkan dengan adanya pita yang terbentuk di gel pada saat elektroforesis.
Diantara 10 sampel yang digunakan, dua diantaranya yaitu sampel 1 dan sampel
10 tidak menunjukan terbentuknya pita atau menunjukkan pita DNA smear. Hal
itu disebabkan bahwa hasil isolasi DNA yang dilakukan belum cukup murni.
Sementara itu pemisahan DNA kromosom dengan elektroforesis pada sampel 2 -
8 menunjukkan hasil yang lebih jelas, terlihat spot-spot yang memisah pada jarak
tertentu. Hasil tersebut menunjukkan bahwa isolasi DNA yang dilakukan
sebelumnya cukup baik. Sehingga saat elektroforesis terlihat pemisahan molekul
DNA berdasarkan ukurannya seperti spot-spot. Spot yang terletak pada bagian
akhir merupakan molekul yang bermobilitas lebih cepat. Hal ini menandakan
ukuran molekul DNA lebih tersebut lebih kecil. Sementara spot yang berada
didekat spot awal permulaan (sumur), bergerak lebih lambat yang menandakan
bahwa ukuran molekulnya lebih besar.

Tabel 1. Hasil Uji Kuantitatif DNA Plasmid (Nanophotometer)

Sampel Konsentrasi A260 A260 A260 A230 A280
/A230 /A280
1 1697.353 33.947 1.737 -0.663 19.563 -51.021
2 560.387 11.207 1.783 2.597 6.341 4.393
3 2085.605 41.712 1.959 3.245 21.315 12.893
4 1462.552 29.251 1.864 1.950 15.713 15.017
5 1721.773 34.435 1.736 -2.027 19.882 -16.809
6 1752.446 35.048 2.103 1.962 16.750 17.939
7 1466.708 29.334 1.508 -0.375 19.486 -77.620
8 1967.023 39.340 1.938 -11.017 20.332 -3.495
9 1788.279 35.765 1.832 -1.042 19.551 -34.159
10 2118.731 42.374 1.937 2.154 21.893 19.686

Hasil pada tabel 1 menunjukkan bahwa DNA total hasil isolasi RNA
pada setiap sampel memiliki nilai kemurnian rata rata sebesar 1,7 – 1,9.
Kondisi tersebut cukup bagus untuk nukleat keasaman murni (Haris et al.,
 5

2005). Kualitas sampel secara akurat, yaitu rasio 260/280. Nukleat murni
asam biasanya menghasilkan rasio 260/280 ~ 1,8 dan rasio 260/280 ~ 2,0
untuk DNA dan RNA. Jika rasio kemurnian yang secara signifikan lebih
rendah dari nilai yang diharapkan dapat mengindikasikan teknik isolasi yang
digunakan mungkin memerlukan optimasi lebih lanjut karna mengalami
kontaminasi sehingga pita DNA yang dihasilkan smear atau tidak jelas
(Desjardins & Conklin, 2010)

4. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA

plasmid yang telah dilakukan menunjukkan kemurnian yang cukup bagus setelah
diuji melalui pemisahan metode elektroforesis dan spektrofotometri.

DAFTAR PUSTAKA

Brock, T. D., Michael T. Madigan, john M. Martinko and Paker. 1994. Biology of
microorganisms. Prentice Hall

Brown, T.A. 2006. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. Fifth
edition. Wiley Blackwell.

Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop Microvolume Quantitation of

Nucleic Acids. Journal of Visualized Experiments, (-1). doi:10.3791/2565

Haris, N., Aswidinnoor, H., Suwanto A., Suhartono, M., Mathius, N. T.,
Purwantara, A. 2005. Konstruksi pustaka cDNA dari daun klon karet
AVROS 20137 yang diinfeksi patogen Corynespora cassiicola. Menara
Perkebunan, 73(2): 44-62.

Hogg, S. 2005. Essential Microbiology. John Wiley & Sons Ltd. England.

Willey, J.M., L.M. Sherwood and C.J. Woolverton. 2011. Prescott’s

Microbiology. 8ed. McGraw-Hill.