ISOLASI DNA Stomatopoda Sp DAN Drosophila Melanogaster

Abstrak

Isolasi DNA merupakan teknik untuk memisahkan DNA dalam suatu sel dari zat zat
lain selain DNA. DNA tersebut dapat berasal dari hewan maupun tumbuhan. Sumber DNA yang
digunakan dalam praktikum isolasi DNA diperoleh dari Drosophila melanogaster dan larva
udangStomatopoda Sp. Tujuan dari praktikum isolasi DNA adalah untuk mengetahui teknik

teknik isolasi DNA menggunakan Genomic DNA Mini Kit dan Genomic DNA Purification
Kit.Genomic DNA Mini Kit diterapkan untuk memisahkan DNA pada Drosophila
melanogastersedangkan Genomic DNA Purification Kit diterapkan untuk memisahkan DNA pada
larva udangStomatopoda Sp. Kedua teknik tersebut memiliki prinsip umum yaitu lisis, ekstraksi,
presipitasi, purifikasi, dan pengawetan. Hasil dari praktikum isolasi DNA Drosophila
melanogaster dan larva udang Stomatopoda Sp terdapatnya endapan tipis (pellet) pada tube.
Endapan tersebut adalah DNA.

Kata kunci: Drosophila melanogaster, Genomic DNA Mini Kit,Genomic DNA Purification Kit,
isolasi DNA, dan larva udang Stomatopoda Sp.

1. Pendahuluan

DNA merupakan polimer dari nukleotida nukleotida yang masing masing terdiri atas tiga
komponen yaitu basa nitrogen, gula pentosa, dan gugus fosfat. Basa dalam DNA dapat berupa
adenin (A), timin (T), guanin (G), dan sitosin (C) (Campbel 2008 : 332).
Struktur DNA yang digambarkan oleh Watson dan Crick dari hasil foto Rosalind Franklin yaitu
berupa untaian double helix dengan gula fosfat terletak di luar struktur double helix dan basa
basa nitrogen menghadap ke sebelah dalam struktur double helix (Klesger 2006 : 44).

DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, dan kloroplas. DNA nukleus merupakan DNA yang
terdapat dalam nukleus (nDNA). nDNA memiliki struktur double helix yang dilengkapi protein
histon dan cenderung linear. nDNA lebih sering digunakan dalam analisis forensik. DNA
mitokondria merupakan DNA yang terdapat di matriks mitokondria. mDNA memiliki laju mutasi
tinggi, diwariskan hanya dari ibu, memiliki ukuran genom yang kecil, tidak memiliki protein
histon, struktur double helix, dan berbentuk lingkaran. Laju mutasi mDNA yang tinggi
disebabkan karena mDNA tidak memiliki mekanisme reparasi yang efisien. DNA kloroplas
merupakan DNA yang terdapat pada kloroplas. DNA kloroplas memiliki struktur double helix,
tidak memiliki protein histon, dan melingkar. Proses transkripsi dan translasi pada DNA
kloroplas sama seperti pada prokariot (Snustad 2003 : 26).

DNA dapat diisolasi atau dipisahkan dari zat zat lain selain DNA. Prinsip prinsip yang
digunakan untuk mengisolasi DNA yaitu pelisisan, ekstraksi, pengendapan, dan pemurnian.
Pelisisan yang dimaksud yaitu menghancurkan dinding sel atau membran sel sehi ngga DNA di
dalam sel tersebut dapat keluar dari sel. Pelisisan tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan
NLS maupun melalui pemanasan. Ekstraksi merupakan penghancuran sel. Ekstraksi dapat
dilakukan secara mekanik yaitu dengan menumbuk sel tersebut. Prinsip selanjutnya yaitu
pengendapan. Pengendapan atau presipitasi bertujuan untuk memisahkan supernatant dengan
pellet. Pengendapan tersebut dapat menggunakan sentrifugator (Juwita 2012 : 2) .

Isolasi DNA merupakan tahap awal dari DNA barcode. DNA barcode merupakan teknik untuk
mengidentifikasi suatu organisme melalui potongan gen tertentu. Oleh karena itu, secara tidak
langsung isolasi DNA bermanfaat untuk mengidentifikasi semua bentuk tingkatan kehidupan
mulai dari telur, larva, pupa, sampai dewasa bahkan mampu digunakan untuk fragmen tubuh yang
tidak diketahui asalnya. Aplikasinya dalam kehidupan yaitu dalam analisis forensik atau analisis
penyakit genetik (Zein 2013 : 49).

Isolasi DNA dapat menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit atau Genomic DNA
Mini Kit. Wizard Genomic DNA Purification Kit dirancang untuk mengisolasi DNA dari leukosit,
jaringan hewan dan tumbuhan, yeast, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Prinsip isolasi
DNA menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit yaitu lisis, ekstraksi, homogenisasi,
presipitasi protein, rehidrasi DNA. Lisis bertujuan untuk menghancurkan dinding sel maupun
membran sel. Ekstraksi bertujuan untuk menghancurkan sel sehingga materi yang ada di dalam
sel dapat keluar. Homogenisasi bertujuan untuk mencampurkan zat. Homogenisasi biasanya
dilakukan setiap penambahan suatu zat. Teknik teknik homogensasi meliputi flicking, thawing,
inverting, dan vortexing. Presipitasi atau pengendapan bertujuan untuk memisahkan supernatant
dengan pellet. Rehidrasi DNA merupakan teknik pemurnian DNA dengan cara mengeringkan
atau menguapkan (Promega 2012 : 12).

Genomic DNA Mini Kit merupakan salah satu metode untuk pemurnian DNA dari jaringan
hewan dan serangga. Prinsip isolasi DNA menggunakan Genomic DNA Mini Kit yaitu lisis,
ekstraksi, dan presipitasi. Sama seperti prinsip Wizard Genomic DNA Purification Kit, lisis
bertujuan untuk menghancurkan dinding atau menbran sel. Ekstraksi dilakukan agar sel hancur
sehingga isi sel keluar. Presipitasi dilakukan untuk menghasilkan supernatant dan pellet. Akan
tetapi, dalam Genomic DNA Mini Kit dibutuhkan GD column (Juwita 2012 : 2).

2. Metodologi

Alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA larva udang yaitu mesin sentrifugasi, tabung
sentrifugasi, pipet mikro, tips, water bath, timer, vorteks, dan pestle. Bahan yang digunakan
dalam praktikum isolasi DNA larva udang yaitu larva udang Stomatopoda sp, Nuclei Lysis
Solution, RNAse, Protein Precipitation Solution, isopropanol, rehydration solution, 1,5 ml tube,
dan sarung tangan (gloves).
Cara kerja praktikum isolasi DNA larva udang dibagi menjadi beberapa tahap yaitu persiapan alat
dan bahan, persiapan jaringan, lisis dan presipitasi protein, serta presipitasi dan rehidrasi DNA.
Pertama, persiapan alat dan bahan. Alat yang akan digunakan disterilisasi menggunakan alkohol
70%. Alat tersebut meliputi mikropipet, meja kerja, dan gloves. Reagen reagen dan bahan lain
yang dibutuhkan disiapkan dan diletakkan di tempat yang terjangkau.
Kedua, persiapan jaringan. Larva udang yang sudah disiapkan diambil dan dibuang pengawetnya.
Selanjutnya, dilakukan penambahan 200 l Nuclei Lysis Solution pada larva udang tersebut.
Larva tersebut kemudian digerus hingga halus dengan menggunakan pesrle. Setelah halus,
ditambahkan 400 l NLS. Sampel diinkubasi pada suhu 65 C selama 30 menit.
Ketiga, lisis dan presipitasi protein. Setelah 30 menit, 3 l RNAse Solution ditambahkan ke
dalam sampel. Selanjutnya dilakukan vortexing pada sampel agar RNAse tercampur. Prosedur
selanjutnya yaitu inkubasi sampel pada 37 C selama 30 menit. Setelah 30 menit, 200 l Protein
Precipitation Soluton ditambahkan ke dalam sampel. Tahap selanjutnya.yaitu
dilakukan vortexingagar PPS yang ditambahkan dapat tercampur baik dalam sampel. Sampel
tersebut didinginkan pada es selama lima menit. Selanjutnya, agar terjadi endapan dilakukan
sentrifuge pada sampel selama empat menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
Keempat, presipitasi dan rehidrasi DNA. Supernatant yang terbentuk dipindahkan dalam tube
yang baru dan ditambahkan isopropanol. Isopropanol dan supernatant dicampur dengan cara
inverting. Setelah tercampur, dilakukan sentrifugasi pada sampel selama satu menit dengan
kecepatan 13. 000 rpm. Supernatant yang terbentuk dibuang. 600 l etanol 70% ditambahkan ke
dalam sampel dan dilakukan sentrifugasi ulang pada sampel. Pellet yang terbentuk dikeringkan
selama sepuluh menit. 20 l rehydrat ion solution ditambahkan ke dalam sampel. Selanjutnya,
dilakukan rehidrasi DNA pada suhu 65 0C selama satu jam. Tahap terakhir yaitu sampel disimpan
dalam freezer.

Alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA D. melanogaster yaitu mesin sentrifugasi,
tabung sentrifugasi, pipet mikro, tips, water bath, timer, vorteks, pestle, 1,5 ml microcentrifuge
tube, GD column, dan collection tube. Bahan yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA D.
melanogaster yaitu D. melanogaster, GT buffer, GBT buffer, Elution buffer, W1 buffer, Wash
buffer, Etanol absolut, dan proteinase K.
Cara kerja praktikum isolasi DNA D. melanogaster adalah sebagai berikut. Dua puluh ekor D.
melanogaster dimasukkan ke dalam 1,5 ml microcentrifuge tube. D. melanogaster tersebut
digerus dengan pestel. Selama penggerusan, ditambahkan 200 l GT buffer. Selanjutnya, 20 l
proteinase K ditambahkan ke dalam sampel dan dilakukan inverting. Sampel kemudian diinkubasi
selama 30 menit dalam suhu 60 0C. Setelah 30 menit, 200 l GBT buffer ditambahkan ke dalam
sampel dan dikocok dengan kuat selama lima detik. Selanjutnya, sampel diinkubasi selama 20
menit pada suhu 60 0C.

Sebelum dilanjutkan pada tahap berikutnya, perlu disiapkan elution buffer yang dipanaskan
hingga suhunya 60 0C. Sampel yang diinkubasi selama 20 menit ditambahkan 200 l etanol
absolut dan dikocok kuat selama 10 detik. Sampel tersebut kemudian dipindahkan ke GD
column. Sementara itu, GD column ditempatkan ke dalam 2 ml collection tube. Selanjutnya,
dilakukan sentrifugasi selama dua menit dengan kecepatan 14.000 rpm. GD column dipindahkan
ke 2 ml collection tubebaru, kemudian ditambahkan 400 L W1 buffer. Selanjutnya, dilakukan
sentrifugasi selama tiga puluh detik dengan kecepatan 14. 000 rpm. Cairan yang terkumpul
dalam collection tube dibuang, kemudian GD column ditempatkan lagi pada collection tube. GD
column tersebut ditambahkan 600 L Wash buffer dan dilakukan sentrifugasi selama 30 detik
dengan kecepatan 14. 000 rpm. Cairan yang terkumpul di collection tube dibuang, kemudian
GD column ditempatkan lagi dicollection tube dan dilakukan sentrifugasi selama
tiga menit dengan kecepatan 14. 000 rpm. GD colum dipindahkan ke 1,5 ml microcentrifuge
tube steril. Sampel ditambahkan 100 L Elution buffer 60 oC, kemudian tabung dibiarkan selama
lima menit dengan posisi tegak. Selanjutnya, dilakukan sentrifugasi selama 30 detik dengan
kecepatan 14.000 rpm. GD column dibuang dan cairan yang terkumpul di microcentrifuge
(mengandung DNA) disimpan di suhu 4 oC atau - 20oC.

3. Hasil dan Pembahasan

Proses isolasi DNA dari larva udang dengan Wizard Genomic DNA Purification Kit menggunakan
beberapa reagen yaitu Nuclei Lysis Solution, Protein Precipitation
Solution, RNAse, Isopropanol,dan Rehydration Solution. NLS berfungsi untuk Melisiskan sel dan
nukleus. Larva udang memiliki membran yang semipermeable. Membran sel tersebut dapat
hancur dengan cara mekanik maupun kimia. Cara mekanik dapat berupa penumbukan atau
penggerusan. Penambahan NLS merupakan cara kimia untuk melisiskan membran sel. NLS
melisiskan membran sel larva udang dengan mengganggu ikatan kimia pada membran tersebut
(Clouse 1999 : 1).

PPS berfungsi merupakan larutan yang digunakan untuk mengendapkan protein atau presipitasi
protein. PPS tersusun atas garam penyangga (salt buffer). PPS dapat menurunkan kelarutan
protein sehingga protein dapat mengendap (Sanchez 2001 : 1).
RNAse merupakan enzim yang berfungsi untuk mendegradasi RNA. Hal tersebut dapat
memudahkan isolasi karena RNAse akan merusak RNA sedangkan DNA tidak Isopropanol
berfungsi untuk mengendapkan DNA. Rehidration solution berfungsi untuk pengeringan atau
penguapan larutan ( U.S. national library of medicine 2014 : 1).

Perlakuan terhadap sampel dalam praktikum isolasi DNA larva udang dengan Wizard Genomic
DNA Purification Kit memiliki alasan masing masing. Penggerusan larva udang menggunakan
pestel dilakukan sebagai usaha mekanik untuk menghancurkan sel. Penambahan NLS 200 L
dilakukan sebagai usaha kimiawi untuk melisiskan membran sel larva udang. Selain itu, setelah
penambahan NLS dilakukan inkubasi sampel selama tiga menit pada suhu 60 0C. Inkubasi
tersebut dilakukan agar NLS dapat bereaksi secara optimal. Setelah proses inkubasi
selesai,Protein Precipitation Solution ditambahakan ke dalam sampel untu kemudian dilakukan
sentrifugasi pada sampel larva udang tersebut. Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan
supernatant dengan pellet. Pellet (endapan) yang dihasilkan adalah protein sedangkan supernatan
yang dihasilkan mengandung DNA. Hal tersebut terjadi karena sebelum proses sentrifugasi
sampel ditambahkan PPS yang berfungsi untuk mengendapkan protein. Oleh karena itu, pada
tahap selanjutnya supernatant ditambahkan isopropanol dan disentrifuse agar pelet yang
dihasilkan adalah DNA (Promega 2012 : 12-14).

Proses isolasi DNA D. melanogaster dengan Genomic DNA Mini Kit menggunakan beberapa
reagen yaitu GT buffer dan GBT buffer, elution buffer, wash buffer, etanol absolut, dan protein
ase K. GT buffer dan GBT buffer digunakan untuk melisiskan sistem membran dan organel
sehingga DNA dapat keluar dari dalam sel maupun organel. Akan tetapi, penggunaan GBT buffer
harus dilakukan dengan hati hati karena GBT mengandung guanidine hydrochloride yang dapat
menyebabkan iritasi (Promega 2014 : 1).

Elution buffer merupakan larutan penyangga yang dapat mempertahankan PH. Elution buffer
digunakan sebagai larutan isotonis untuk menjaga DNA selama penyimpanan. Wash buf fer
digunakan untuk membersihkan DNA dari pengotor lain. Etanol absolut digunakan untuk
mengendapkan DNA. Proteinese K digunakan untuk mendegradasi protein (Promega 2014 : 1).

Perlakuan terhadap sampel dalam praktikum isolasi DNA D. melanogaster dengan Genomic
DNA Mini Kit memiliki alasan tersendiri. Penggerusan D. melanogaster menggunakan pestel
dilakukan untuk menghancurkan sel D. melanogaster secara mekanik, namun hal tersebut tidak
cukup. Oleh karena itu, ditambahkan GT buffer yang dapat membantu pelisisan membran sel
maupum organ D. melanogaster secara kimiawi. Pelisisan membran sel D.
melanogastermenggunakan GT buffer karena disesuaikan objek penelitian. Selain penambahan
GT buffer juga dilakukan penambahan proteinase K yang bertujuan untuk mendegradasi protein.
Setelah ditambahkan proteinase K dilakukan inverting. Inverting yaitu teknik homogenisasi yang
dilakukan dengan menggerakkan tube membentuk angka delapan. Proses isolasi DNA D.
melanogaster juga menggunakan water bath sebagai inkubator. Tujuan dari inkubasi adalah untuk
mengoptimalkan reaksi. Hal yang membedakan Genomic DNA Mini Kit dengan Wizard Genomic
DNA Purification Kit yaitu adanya GD column (Zein 2013 : 54).

4. Kesimpulan

Isolasi DNA merupakan teknik pemisahan DNA dari zat zat lain selain DNA. Teknik yang
digunakan yaitu Genomic DNA Mini Kit untuk isolasi DNA D. melanogaster dan Wizard
Genomic DNA Purification Kit untuk isolasi DNA larva udang. Prinsip yang digunakan dalam
isolasi DNA yaitu lisis, ekstraksi, presipitasi, purifikasi, dan pengawetan. Selama proses isolasi,
digunakan banyak reagen. Reagen yang digunakan dalam Wizard Genomic DNA Purification
Kitantara lain NLS, PPS, RNAse, Isopropanol, dan Rehydration Solution. Reagen yang digunakan
dalam Genomic DNA Mini Kit antara lain GT buffer dan GBT buffer, elution buffer, wash buffer,
etanol absolut, dan protein ase K. Reagen yang disunakan dalam proses isolasi dapat berbeda
beda berdasarkan sumber objek yang diisolasi.

5. Daftar Acuan
 Campbel, N.A & J.B. Reece. 2008. Biologi. Terj dari Biology oleh Wulandari, D.T., E, PT
Gelora Aksara Pratama, Jakarta: xii + 486 hlm.
Klesger, M.W.S. 2006. Genetics. Mac millan publishing company, New York : 842 hlm.
Promega. 2012. Wizard genomic DNA purification kit. Promega Corp, USA: 21 hlm
Snustad, D.P. & M.J. Simmons. 2003. Principles of genetics. John Willey & Sons inc, U.S
: 840hlm.
Zein, M.S.A. & D.M. Prawiradilaga. 2013. DNA barcode fauna indonesia. Kencana, Jakarta
: 242 hlm.
Clouse, R. Purpose of Cell Lysis
Solution. 1999. http://www.ehow.com/about_6652172_purpose-cell-lysis-solution.html:
1hlm. 30 April 2014, pk 14.46 WIB.
Juwita & R.N. Sinaga. 2012. Isolasi DNA dan teknik
PCR.http://openwetware.org/images/6/6d/Praktikum_DNA_pdf. : 27 hlm. 29 April 2014,
pk 13.00 WIB.
Promega Corp. 2014. DNA purification. http://worldwide.promega.com/: 1hlm. 29 April 2014, pk
15.00 WIB.
Sanchez, L. 2001. TCA protein precipitation
protocol.http://www.its.caltech.edu/~bjorker/Protocols/TCA_ppt_protocol.pdf: 1hlm. 30 April
2014, pk 14.00 WIB.
U.S. National Library of Medicine. 2014. RNAse gene
family.http://ghr.nlm.nih.gov/geneFamily/rnase: 1hlm. 30 April 2014, pk 14. 30 WIB.

http://mifa-s.blogspot.co.id/2015/02/praktikum-isolasi-dna.html