LAPORAN PRAKTIKUM

REKAYASA GENETIKA
BAB I
ISOLASI DNA GENOMIK DAN PLASMID

NAMA : INDAH HADIANI

NIM : 195100507111011
KELAS : Q
KELOMPOK : Q5
ASISTEN : RIYANTI ZHAFIRAH

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI INDUSTRI

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2021
 Nama Indah Hadiani
NIM 195100507111011
Kelas Q
Kelompo Q5
k

1 ISOLASI DNA GENOMIK & PLASMID

PRE-LAB
1. Jelaskan apa yang anda ketahui tentang DNA genomik!
DNA genomik merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh setiap makhluk
hidup dan diturunkan kepada keturunannya. DNA genomik mengandung setiap gen
yang diperlukan manusia untuk bertahan hidup (tumbuh dan kembang) dalam suatu
kondisi normal. DNA genomik memiliki struktur double helix dan struktur bengkok
yang terdiri dari gugus fosfat, dan gula deoksiribose. DNA genomik menginstruksikan
tumbuh kembang melalui kode-kode DNA, kode-kode tersebut ialah adenin (A), sitosin
(S), guanin (G), dan timin (T).

2. Jelaskan prinsip dari teknik isolasi DNA genomik!

Teknik isolasi DNA adalah teknik untuk mendapatkan DNA murni yang tidak
tercampur dengan komponen sel lain seperti protein dan karbohidrat. Isolasi genom
dapat dilakukan dengan metode lisis secara fisik dan kimia. Secara fisik yaitu
menggunakan kekuatan mekanik yaitu secara freeze thaw, bead mill homogenization
dan resonansi misalnya dengan sonikasi. Secara kimia yaitu sel dirusak dengan buffer
lisis berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier dinding sel, misalnya
SDS (Sodium Dedocyl Sulfate) dan CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide).

3. Jelaskan perbedaan antara DNA plasmid dengan DNA genomik!

DNA plasmid yang sirkuler memiliki berat molekul yang lebih rendah dibandingkan
DNA genom yang linear dan komponen sel lainnya. DNA genom membawa banyak
kromosom sedangkan DNA plasmid sedikit kromosom. DNA geno memiliki sistem
regulasi utama sedangkan DNA plasmid tidak.

4. Jelaskan prinsip isolasi DNA plasmid!

Prinsip dasar isolasi plasmid adalah pemisahan komponen sel dan DNA genom dengan
DNA plasmid berdasarkan berat molekulnya. DNA plasmid yang sirkuler memiliki
berat molekul yang lebih rendah dibandingkan DNA genom yang linear dan komponen
sel lainnya. Pengaturan pH berperan penting dalam tahapan isolasi plasmid karena hal
ini membuat struktur plasmid yang sirkuler tertutup tetap terjaga dalam larutan,
sedangkan komponen kontaminan lain diendapkan. Kontaminan dapat dihilangkan
dengan cara melarutkan plasmid dalam etanol dan diendapkan dengan sentrifugasi.
Plasmid dapat dipurifikasi lebih lanjut menggunakan filtrasi gel
 DALIR EKSTRAKSI DNA KROMOSOM
1. Pembuatan Stok Kultur E. coli
1 ose E.coli dari agar miring

Diinokulasikan ke dalam 10 ml LB

Diinkubasi 16 jam pada suhu 37 0C

Stok kultur

2. Pembuatan Stok Kultur L. plantarum

1 ose L. plantarum dari agar miring

Diinokulasikan ke dalam 10 ml MRSB

Diinkubasi 24 jam pada suhu 37 0C

Stok kultur

3. Ekstraksi DNA Kromosom Bakteri

10 mL kultur bakteri

Dimasukkan ke dalam falson dan ditimbang

Disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama pada suhu 4℃ selama 5 menit

Supernatan
Pelet

Dicuci menggunakan 2 ml TE buffer (Tris-Cl 10 mM, pH 8, 1 mM EDTA)

2x Disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 5 menit

Supernatan
Pelet

200μl Lisozim
 Diinkubasi dalam inkubator selama 3 jam pada suhu 37℃ dan dibolak-balik setiap 10 menit

200 𝜇L proteinase-K

Diinkubasi dalam shaker water bath selama 1 jam pada suhu 65℃ dan dibolak-balik
perlahan setiap 10 menit

Ditambahkan 300 𝜇L TE Buffer ke dalam falcon

Didiamkan selama 10 menit

Ditambahkan 750 𝜇L Tris Buffer Fenol ke dalam falcon dan dibolak-balik perlahan selama 5
menit

Disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm pada suhu 4℃ selama 5 menit

Fase tengah terambil Fase atas terambil

Diulangi tahap penambahan Tris Buffer Fenol Kloroform:isoamil alhokol (24:1)

dan disentrifugasi ulang (1x volume sampel)

2x
Dibolak-balik perlahan

Disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm

pada suhu 4℃ selama 5 menit

Diambil fase atas dan dipindah ke falcon baru

5 𝜇L RNAse

Diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit

 Na-asetat 3M
(0.1x volume sampel)

Ethanol absolut
(2.5x volume sampel)

Dibolak-balik secara perlahan

Diinkubasi selama 1 jam pada suhu −20℃

Disentrifugasi pada kecepatan 10,000 rpm

pada suhu 4℃ selama 15 menit

Supernatan

Pelet

Dicuci menggunakan 1 mL
ice cold ethanol 70% 2x

Disentrifugasi pada kecepatan 10,000

rpm pada suhu 4℃ selama 15 menit
Supernatan
Pelet

Diinkubasi hingga alkohol

menguap dan tidak berbau

50 𝜇L TE 50 mM
Dilarutkan pelet DNA

Disimpan pada suhu −20℃

Hasil
4. Elektoforesis DNA
0.32 gram agarosa

40 mL 1x TAE Buffer

Dilarutkan dan dipanaskan hingga terlarut sempurna

Dipasang sisir pada set elektroforesis gel agarosa

Dituang larutan agarosa hangat pada cetakan agarosa set peralatan elektroforesis

Dibiarkan 30 – 45 menit hingga memadat sempurna

Diangkat sisir dari gel agarosa secara perlahan

1x TAE Buffer

Dituang hingga gel agarosa tertutup sempurna

7 𝜇L marker DNA

Dituang perlahan pada sumuran agarosa dengan mikropipet

4L sampel DNA 2 𝜇L 6x loading dye

2 L gel Red

Dicampur hingga homogen (Pipetting)

Dimasukkan perlahan campuran sampel DNA dan loading dye ke sumuran gel
agarosa dengan mikropipet sebanyak 2 𝜇L

Ditutup set perlatan elektroforesis

Dihubungkan dengan power supply

Dijalankan proses elektroforesis menggunakan daya 100 volt

Dideteksi keberadaan DNA menggunakan UV illuminator

Hasil
Diagram Alir
1. Pembuatan stok kultur E. coli DH5alfa rekombinan

1 ose isolat E.coli

Diinokulasikan pada 10 ml medium LB

Ditambahkan ampicillin 900μl

Divortex

Diinkubasi selama 12 jam pada suhu 37 C dalam shaker waterbath

o

Stok 10 ml

2. Ekstraksi DNA plasmid

Stock culture 10 ml

Dipindahkan ke falcon tube

Disentrifugasi 6000 rpm, 4 C, 5 menit

c

Supernatan

Ditambahkan 100 μl Sol. I ke pelet

Divortex hingga homogen

200 μl sol.II

Dikocok pelan sebanyak 5 kali

 Diinkubasi di atas es selama 5 menit

150 μl sol. III

Dikocok cepat selama 1 menit

Diinkubasi di atas es selama 5 menit

Disentrifugasi 10000 rpm, 4 C, 30 menit

o

Pelet

Dipindahkan supernatan ke falcon tube baru

300 μl Isopropanol

Dibolak-balik perlahan

Didiamkan selama 30 menit

Disentrifuge 10000 rpm, 4 C, 5 menit

o

Supernatan

Dicuci pelet dengan ice cold etanol 70% sebanyak 0.5 ml

Disentrifuge 10000 rpm, 4 C, 10 menit

o

Supernatan

Diinkubasi pelet pada suhu 55 C sampai etanol hilang

o

Ditambahkan Mili-q water 50 μl

 Disimpan pada suhu -20 C
o

Diambil 4 μl untuk elektroforesis Dinanodrop

Hasil Hasil
 Nama Indah Hadiani
NIM 195100507111011
Kelas Q
Kelompok Q5

LAPORAN PRAKTIKUM
Praktikum 1. Isolasi DNA Genomik dan Plasmid

1. Tulislah data hasil absorbansi dari larutan standar DNA!

Absorbansi pada panjang
Konsentrasi DNA
gelombang
standar (µg/ml)
280 nm 260 nm
0 0,02 0,0086
20 0,423 0,2331
40 0,78 0,431
60 1,2 0,6553
80 1,61 0,861
100 2,011 1,0965
Keterangan :
Nilai absorbansi 1,0 pada panjang gelombang 260 nm setara dengan
konsentrasi 50 µg DNA per ml.
*A260 : y = 0,0199x + 0,0119
R2 = 0,9996
*A280 : y = 0,0108x + 0,0085
R2 = 0,9996
2. Buatlah kurva standar, nilai regresi, slope, dan intercept untuk menentukan
konsentrasi DNA kromosom dan plasmid!
Absorbansi pada panjang gelombang 260 nm
2.5

y = 0.0199x + 0.0119
2
R² = 0.9996

1.5

1
Absorbansi

0.5

0
0 20 40 60 80 100 120
Konsentrasi DNA
 Nama Indah Hadiani
NIM 195100507111011
Kelas Q
Kelompok Q5

Absorbansi pada panjang gelombang 280 nm

3. Tulilslah data hasil absorbansi sampel DNA kromosom dan plasmid dengan
metode spektrofotometri!
Absorbansi DNA Kromosom Absorbansi DNA Plasmid
Sampel
A (λ280 nm) A (λ260 nm) A (λ280 nm) A (λ260 nm)
1 0,065 0,133 0,585 0,296
2 0,315 0,540 0,604 0,294
3 3,001 1,508 1,221 0,617
4 0,774 0,367 0,939 0,501
5 0,863 0,432 0,497 0,278
4. Tentukan konsentrasi sampel DNA genomik dan plasmid pada tiap
pengenceran dengan menggunakan ekstrapolasi dari kurva standar DNA!
- Konsentrasi DNA genomik :
1. Sampel 1
Konsentrasi DNA = 0,133 x 1 x 50 = 6.65
2. Sampel 2
Konsentrasi DNA = 0,540 x 1 x 50 = 27
3. Sampel 3
Konsentrasi DNA = 1,508 x 1 x 50 = 75.4
4. Sampel 4
Konsentrasi DNA = 0,367 x 1 x 50 = 18.35
5. Sampel 5
 Nama Indah Hadiani
NIM 195100507111011
Kelas Q
Kelompok Q5

Konsentrasi DNA = 0,432 x 1 x 50 = 21.6

- Konsentrasi DNA Plasmid :
1. Sampel 1
Konsentrasi DNA = 0,296 x 1 x 50 = 14.8
2. Sampel 2
Konsentrasi DNA = 0,294 x 1 x 50 = 14.7
3. Sampel 3
Konsentrasi DNA = 0,617 x 1 x 50 = 30.85
4. Sampel 4
Konsentrasi DNA = 0,501 x 1 x 50 = 25.05
5. Sampel 5
Konsentrasi DNA = 0,278 x 1 x 50 = 13.9
5. Tentukan berapa rasio A260/A280 untuk tiap sampel hasil pengenceran!
Rasio Aλ260/Aλ280
Sampel
DNA Kromosom DNA Plasmid
1 2.046 0.506
2 1.714 0.487
3 0.502 0.505
4 0.474 0.534
5 0.501 0.559

6. Jelaskan definisi dari nilai rasio Aλ260/Aλ280? Bahaslah nilai rasio tiap sampel
DNA kromosom dan plasmid!
Nilai rasio Aλ260/Aλ280 adalah nilai yang digunakan untuk menilai kemurnian dari DNA
ekstraksi. DNA yang terekstrasi dapat dikatakan murni apabila nilainya antara 1,8-2,0.
Nilai kemurnian dibawah 1,8 menunjukan bahwa DNA ekstraksi terkontaminasi
protein dan polisakarida. Sedangkan nilai kemurnian lebih dari 2,0 dapat disebabkan
oleh kontaminasi fenol, fenol memiliki serapan maksimal di panjang gelombang 270
nm dan mampu memberi sumbangan kecil serapan di panjang gelombang 260 nm
sehingga dapat diperoleh nilai lebih dari dua (Dewi dkk, 2015).
Dari hasil praktikum didapatkan rasio Aλ260/Aλ280 pada lima sampel DNA kromosom
dan DNA plasmid. Pada sampel 1, 2, 3 , 4, dan 5 berturut-turut memiliki nilai rasio
DNA kromosom yaitu 2.046, 1.714, 0.502, 0.474, dan 0.501. Dari data tersebut dapat
disimpulkan bahwa pada hanya sampel 2 DNA kromosom saja yang memiliki
kermurnian terbaik. Pada sampel 1 DNA kromosom memiliki nilai lebih dari 2, hal
tersebut disebabkan sampel masih terkontaminasi oleh fenol atau terkontaminasi oleh
RNA (Dewi dkk, 2015).
Selanjutnya pada sampel 1,2,3,4, dan 5 berturut-turut memiliki rasio DNA plasmid
yaitu 0.506, 0.487, 0.505, 0,534, dan 0,559. Pada sampel ini tidak ada sampel yang
dapat dikatakan murni karena nilainya dibawah 1,8. Hal tersebut disebabkan adanya
kontaminasi dari polisakarida dan protein (Dewi dkk, 2015).
 Nama Indah Hadiani
NIM 195100507111011
Kelas Q
Kelompok Q5

7. Jelaskan peranan dari penambahan lisosim pada teknik isolasi DNA genomik!
Pada praktikum inj isolasi DNA genomik menggunakan kultur E. Coli dan kultur L.
plantarum. Kultur tersebut memiliki struktur dinding sel dengan lapisan peptidoglikan
yang tebal dan kuat serta asam teichoic. Oleh karena itu, proses perusakan dinding sel
bakteri dapat dilakukan dengan menambahkan lisozim. Lisozim berfungsi mencerna
dinding sel bakteri yaitu dengan cara menghidrolisis lapisan peptidoglikan yang tebal
(Agung dkk, 2016).

8. Jelaskan peranan proteinase-K pada isolasi DNA genomik!

Proteinase-K merupakan enzim hidrolitik yang digunakan dalam DNA genomik pada
proses pelisisan sel. Proteinase-K berfungsi untuk merusak protein dan Sodium
Dodecyl Sulfat (SDS) untuk mengikat lipid sehingga membran sel rusak dan semua isi
sel keluar. Proteinase-K berkerja dengan memutus ikatan-ikatan peptida pada protein
(Kamaliah, 2017).

9. Apa peranan etanol absolut pada teknik isolasi DNA genomik?

Etanol absolut merupakan salah satu bahan yang digunakan pada isolasi DNA genomik.
Etanol berfungsi sebagai agen presipitasi lanjutan pada isolasi DNA. Etanol memiliki
dielektrik lebih rendah daripada air sehingga memudahkan garam yang memiliki
muatan positif (Na+) untuk berinteraksi dengan DNA yang bermuatan negatif. Interaksi
tersebutmenyebabkan DNA bersifat hidrofob dan mengendap. Pellet DNA kemudian
dicuci dengan etanol 70% untuk menghilangkan kelebihan garam (Chacon, 2014).

10. Mengapa pada tahapan isolasi DNA genomik ditambahkan larutan chloroform-
isoamil alkohol?
Chloroform-isoamil alkohol perlu ditambahkan pada tahapan isolasi genomik.
Chloroform-isoamil alkohol berfungsi untuk pemurnian DNA dari protein yaitu dengan
cara mengendapkan protein. Chloroform-isoamil alkohol akan mengikat makromolekul
selain DNA seperti protein, lipid, dan karbohidrat. Pada tahap ini DNA dan air terpisah
dari bahan organik lainnya setelah disentrifugasi. Untuk menarik air dari DNA
dibutuhkan alkohol yang disebut dengan presipitasi (Romana, 2014).

11. Jelaskan peranan ampisilin pada isolasi DNA plasmid!

Ampisilin merupakan bahan yang penting digunakan dalam isolasi DNA plasmid.
Ampisilin berfungsi untuk seleksi koloni rekombinan yang membawa DNA plasmid.
Ampisilin yang digunakan dicampurkan ke dalam media LB yang akan ditumbuhkan
kultur. Kultur yang dapat tumbuh pada media merupakan kultur yang mengandung
DNA plasmid. Kultur yang tumbuh pada media dapat dilakukan isolasi DNA plasmid
(Sarah dkk, 2019).
 Nama Indah Hadiani
NIM 195100507111011
Kelas Q
Kelompok Q5

12. Apa fungsi dari larutan II (NaOH dan SDS) pada teknik isolasi DNA plasmid?
Larutan II yang mengandung NaOH dan SDS digunakan dalam pelisisan sel. NaOH
yang terkandung didalamnya digunakan untuk memisahkan DNA genom dan DNA
plasmid. Penambahan NaOH akan membuat medium menjadi basa, sehingga molekul
dsDNA akan terdenaturasi dan basa komplemennya tidak akan saling berikatan lagi.
Namun, DNA plasmid yang terdenaturasi tidak mengalami pemisahan basa komplemen
karena strukturnya yang sirkuler, sehingga dapat kembali terenaturasi ketika larutan
basa dinetralisasi. Sedangkan SDS yang terkandung berfungsi untuk mengikat protein-
protein sel (Tanio, 2017).

13. Jelaskan fungsi dari alkohol 95% dan 70% dingin!

Alkohol 95% digunakan untuk memisahkan DNA dengan komponen non-DNA seperti
debris sel, kotoran dan protein. Semua kompenen non-DNA akan terendapkan dan
DNA akan bergerak ke lapisan atas yaitu alkohol. Alkohol mempunyai densitas yang
lebih kecil bila dibandingkan dengan air, sehingga alkohol ini akan berada pada bagian
atas dua lapisan yang terpisah. Sedangkan alkohol 70% digunakan untuk digunakan
untuk mencuci garam residu yang terkandung pada pellet dan mencuci isopropanol.
Penambahan alkohol digunakan dalam kondisi dingin untuk menyempurnakan
presipitasi, karena temperatur yang rendah, akan menurunkan aktivitas molekul air
yang dapat menyebabkan pengendapan DNA lebih efektif (Karuna et al., 2016).

14. Apa peranan RNAse pada teknik isolasi DNA plasmid?

Dalam teknik isolasi DNA plasmid mengharapkan DNA yang murni tanpa kontaminasi
seperti adanya RNA. Untuk itu, penambahan RNAse digunakan untuk menghilangkan
RNA pada larutan DNA. RNAse merupakan enzim pendegradasi RNA. Prinsip kerja
RNAse adalah memotong ikatan fosfodiester antara 5'-ribosa dari nukleotida dan gugus
fosfatyang melekat pada 3'-ribosa, yang kemudian dihidrolisis membentuk 3'-
nukleosida fosfat (Murtiyaningsih, 2017).
 Nama Indah Hadiani
NIM 195100507111011
Kelas Q
Kelompok Q5

Kesimpulan
Teknik isolasi DNA adalah teknik untuk mendapatkan DNA murni yang tidak tercampur
dengan komponen sel lain seperti protein dan karbohidrat. Prinsip dasar isolasi plasmid adalah
pemisahan komponen sel dan DNA genom dengan DNA plasmid berdasarkan berat
molekulnya. Tujuan dari praktikum ini untuk mengisolasi DNA genomik, mengetahui
konsentrasi dan kemurnian DNA genomik hasil isolasi, mengisolasi DNA plasmid,
mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA plasmid hasil isolasi. Dari hasil praktikum
didapatkan didapatkan rasio Aλ260/Aλ280 pada lima sampel DNA kromosom dan DNA plasmid.
Pada sampel 1, 2, 3 , 4, dan 5 berturut-turut memiliki nilai rasio DNA kromosom yaitu 2.046,
1.714, 0.502, 0.474, dan 0.501. Selanjutnya pada sampel 1,2,3,4, dan 5 berturut-turut memiliki
rasio DNA plasmid yaitu 0.506, 0.487, 0.505, 0,534, dan 0,559. DNA yang terekstrasi dapat
dikatakan murni apabila nilainya antara 1,8-2,0, maka dari sampel hanya satu sampel saja
yang dikatakan murni yaitu sampel 2 pada DNA kromosom.
Daftar Pustaka
Agung Pambudiono, Endang Suarsini, Mohamad Amin. 2016. Isolasi DNA Genom Bakteri
Potensial Pengkelat Logam Berat Kadmium dari Limbah Cair Penepungan Agar.
Seminar Nasional Pendidikan dan Saintek 2016.
Chacon-Cortes D, Griffiths L. 2014. Methods for extracting genomic DNA from whole blood
samples: current perspectives. Journal of Biorepository Science for Applied Medicine.
2(1): 1-9.
Dewi Andayani Farmawati, I Nengah Wirajana, dan Sagung Chandra Yowani. 2015.
Perbandingan Kualitas DNADengan Menggunakan Metode Boom Original Dan
Boom Modifikasi Pada Isolat Mycobacterium Tuberculosis 151. Jurnal Kimia 9(1):
41-46.
Kamaliah. 2017. Perbandingan Metode Ekstraksi Dna Phenol-Chloroform Dan Kit Extraction
Pada Sapi Aceh Dan Sapi Madura. Jurnal Biotik 5(1): 60-65
Karuna Gokarn, Vishwas Sarangdhar and Ramprasad B. Pal. 2016. Ethanol Extraction
Method For Dna Isolation From Mycobacterium smegmatis. International Journal of
Current Research 8(9):3 9013-39015.
Murtiyaningsih, H. 2017. Isolasi DNA Genom dan Identifikasi Kekerabatan Genetik Nanas
Menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Agritrop: Jurnal Ilmu-
Ilmu Pertanian (Journal of Agricultural Science) 15(1): 83-93
Romana Siddique. 2014. Optimization Of Genomic Dna Extraction Protocol For Molecular
Profiling Of Banana / Plantain (Musa Species). European Scientific Journal 10(33)
Sarah H. C. Rotinsulu, Fatimawali, Trina E. Tallei. 2019. Transformasi Plasmid Yang
Mengandung Gen Merb Pada Bakteri Escherichia Coli Top-10. Jurnal Pharmacon
8(2)
Tanio, Eunike Priscilla.2017. Efisiensi Transformasi Plasmid Pta7002-Atrkd4 Pada
Escherichia Coli Bl21(De3) Dengan Metode Kejutan Panas. Skripsi. Universitas
Atma Jaya Yogyakarta.

Tanggal Nilai Paraf

Asisten
SS Literatur