Nama

NIM
Kelas
Kelompok

: Rohmatul Hasanah
: 125100101111015
:G
:9

BAB IV
EKSTRAKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE

A. Pre Lab
1.

Mengapa enzim amilase bisa didapatkan pada kecambah biji-bijian?

Pada kecambah biji-bijian dibutuhkan energi yang berasal dari bahan organik untuk
perkecambahannya. Salah satunya adalah karbohidrat. Pada kecambah terkandung KH
dalam jumlah yang tinggi agar dapat dihasilkan energi yang cukup untuk pertumbuhan si
biji. Penghasilan energinya adalah melalui pemecahan substrat KH dengan enzim amilase.
Karena banyak terkandung KH maka banyak terkandung enzim amilase pula. Denagn
kandungan enzim amilase yang banyak tersebut maka kita dapat mengekstraknya dari
kecambah dengan cara dihancurkan karena enzim amilase dalam kecambah merupakan
enzim endoseluler (Suarni,2007).
2.

Jelaskan prinsip pengukuran aktivitas enzim amilase secara kuantitatif pada percobaan ini?

Yakni dengan metode analisa gula pereduksi menggunakan regen DNS (3,5 dinitro salicilic
acid) untuk mengukur hasil hidrolisis pati setelah kontak dengan enzim dalam waktu, pH
dan suhu tertentu. Regen DNS akan bereaksi dengan gula pereduksi hasil hidrolisis dan
menghasilkan warna dari kuning menjadi merah-jingga kemudian diukur absorbansinya.
Sehingga data aktivitas enzin amilase dapat diketahui (Andarwula,2010).
3.

Bagaimana cara mengidentifikasi secara kualitatif bahwa telah terjadi reaksi enzimatis pada
percobaan ini?

Dengan mencari hasil absorbansi dan konsentrasi maltosa dengan mencampurkan larutan
standar maltosa dengan reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid) yang kemudian diinkubasi
400C selama 15 menit kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer
panjang gelombang 550 nm sehingga didapatkan persamaan matematik untuk standar
maltose yang akan digunakan dalam pengukuran kadar enzim. Perhitungan aktivitas enzim
-amilase
1
1unit
T

1 mikromol
C

(Andarwulan,2010).

B. Diagram Alir

Persiapan Sampel
Sampel biji kacang
hijaukering 50 g

Dibagi sesuai perlakuan

10 g biji
kacang hijau
kering

10 g biji
kacang hijau
direndam
semalam 12
jam

10 g biji
kacang hijau
dikecambahka
n 12 jam

10 g biji
kacang hijau
dikecambahan
24 jam

10 g biji
kacang hijau
dikecambahka
n48 jam

a. Ekstraksi Enzim Amilase

Sampel

Dihancurkan dan ditimbang sebanyak 5 g

Ditambah 50 mlbuffer asetat (0,1 0,5 M) pH 5,5
Dibiarkan selama 30 menit sambil sesekali diaduk
Disaring dengan kertas saring Whatman
Di sentrifugasi 1500 rpm selama 30 menit
Diambil supernatan

b. Uji Kuantitatif
- Persiapan Substrat Pati

Hasil

1 gram Soluble starch (Merck) dan

100 ml Air

Filtrat = larutan
enzim kasar

Dilarutkan
Diaduk dan dipanaskan hingga jernih dan homogen

Hasil
-

Pengukuran Aktivitas Enzim Hasil Ekstraksi

1 ml enzim hasil ekstraksi dan 1ml

larutan substrat pati
Dicampur
Diinkubasi 3 menit suhu 300C
Ditambahkan 2 ml DNS
Dipanaskan sampai mendidih
Didinginkan dengan cepat pada air mengalir
Ditambah 20 ml aquades
Dispektrofotometri pada panjang gelombang 550 nm
Dihitung kadar maltosa dari plottin regresi linear standar maltosa

Pembuatan Larutan Standar Maltosa

Hasil

50 mg maltosa

Dilarutkan dalam 50 ml buffer HCL

Diencerkan hingga diperoleh stok konsentrasi 1000 ppm.
Dilakukan pengenceran hingga konsentrasi larutan standar maltosa 0 ppm; 100 ppm; 200 ppm;
300 ppm; 400 ppm; 500 ppm; 600 ppm

Hasil

Pembuatan Grafik Standar

1 ml larutan stok standar maltosa

Ditambah 3 ml DNS
Di inkubasi pada water bath 400C selama 15 menit
Didinginkan
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm

Hasil
C. Hasil dan Pembahasan
1. Data Hasil Praktikum

Kurva Standar
Konsentrasi
Absorbansi
0 ppm
0,09
100 ppm
0,115
200 ppm
0,218
300 ppm
0,322
400 ppm
0,4
500 ppm
0,435
600 ppm
0,577
Sehingga didapat kurva standar sebagai berikut :

KURVA STANDAR
0.8
0.6
ABSORBANSI

0.4
0.2

f(x) = 0.08x - 0.02

R = 0.98

absorbansi
Linear
(absorbansi)

0
012345678
KONSENTRASI

Dari kurva tersebut didapatkan persamaan kurva standar y = 0.081x - 0.018

Kurva Sampel
Dari persamaan kurva standar tersebut dapat diperoleh konsentrasi pada sampel dengan
memasukkan nilai absorbansi sampel (y). Sehingga didapatkan data:
Sampel
Absorbansi
Konsentrasi (ppm)
Blanko
0,264
3,48
Kacang hijau kering
0,379
4,901
Kacang hijau rendam 12 jam
0,29
3,802
Kecambah 12 jam
0.311
4,06
Kecambah 24 jam
0.328
4,27
Kecambah 48 jam
0.436
5,505
Sehingga didapatkan kurva sampel:

KURVA SAMPEL
0.6
0.4
Absorbansi

0.2

f(x) = 0.08x - 0.02

R = 1

0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
Konsentrasi (ppm)

Perhitungan Konsentrasi dan Aktivitas Enzim

Linear ()

Perhitungan konsentrasi sampel dengan menggunakan persamaan pada kurva standar

yakni y = 0.081x - 0.018 sedangkan perhitungan Aktivitas enzim menggunakan rumus
Cx

1
1unit
x
T 1 mikromol

Blanko A=0,264
y
= 0,081x 0,018
0,264 = 0,081x 0,018
x
= 3,48 ppm

aktivitas enzim =

pada masing-masing sampe adalah sebagai berikut:

Cx

1
1unit
x
T 1 mikromol

Kacang hijau kering A= 0,379

y
= 0,081x 0,018
0,379 = 0,081x 0,018
x
= 4,901 ppm

1
1unit
Cx x
aktivitas enzim =
T 1 mikromol

Kacang hijau basah A= 0,290

y
= 0,081x 0,018
0,290 = 0,081x 0,018
x
= 3,802 ppm

1 unit
1 mikromol
unit
mikromol

= 1,16

= 4,901 x

1
3

1 unit
1 mikromol
= 1,36

1
3

= 3,48 x

unit
mikromol

= 3,802 x

1
3

1 unit
1 mikromol
aktivitas enzim =
-

Cx

1
1unit
x
T 1 mikromol

Kecambah 12 jam A= 0,311

y
= 0,081x 0,018
0,311 = 0,081x 0,018
x
= 4,06 ppm

aktivitas enzim =

Cx

1
1unit
x
T 1 mikromol

= 1,27

unit
mikromol

= 4,06 x
1 unit
1 mikromol

1
3

= 1.35
-

Kecambah 24 jam A= 0,328

y
= 0,081x 0,018
0,328 = 0,081x 0,018
x
= 4,27 ppm

aktivitas enzim =

unit
mikromol

Cx

1
1unit
x
T 1 mikromol

Kecambah 48 jam A= 0,436

y
= 0,081x 0,018
0,436 = 0,081x 0,018
x
= 5,605 ppm

aktivitas enzim =

Cx

1
1unit
x
T 1 mikromol

1
3

= 4,27 x

1 unit
1 mikromol
= 1,42

unit
mikromol

= 5,605 x

1
3

1 unit
1 mikromol
= 1,87

unit
mikromol

Berikut data nilai aktivitas enzim amilase pada masing-masing sampel:

Sampel

Blanko
Kacang hijau kering
Kacang hijau basah
Kecambah 12 jam
Kecambah 24 jam
Kecambah 48 jam

Aktivitas Enzim Amilase

unit
( mikromol )
1,16
1,36
1,27
1,35
1,42
1,87

2. pembahasan

A. Perbandingan kurva standar dengan kurva sampel

Antara kurva standar dengan kurva sampel tidak ada perbedaan yang signifikan.
Sama seperti kurva standar yang ada, kurva sampel dapat dikatakan linear. Hal ini terlihat
dari garis linear pada kurva yang semakin naik. Semakin besar nilai absorbansi maka
konsentrasi enzim yang didapat akan semakin tinggi. Walaupun pada sampel ketiga
mengalami penurunan nilai absorbansi yang menjadikan penurunan konsenttasi pada kurva
namun hal itu tidak seberapa signfikan. Pada kedua kurva tersebut juga dapat dilihat
kesamaannya melalui persamaan yang terbentuk. Pada kurva standar didapat persamaan y
= 0.081x - 0.018 dengan R = 0.979 sedangkan pada kurva sampel y = 0.080x - 0.017
dengan R = 1. Sehingga dapat dikatakan bahwa kurva sampel adalah linear.
B. Analisa Prosedur
Pada praktikum ekstraki dan pengujian aktivitas enzim amilase dilakukan dengan 5
kondisi sampel yang berbeda. Hal pertama yang dilakukan adalah persiapan sampel yakni
dengan menyiapkan 10 gram biji kacang hijau kering, 10 gram biji kacang hijau direndam
selaam 12 jam, 10 gram biji kacang hjau dikecambahkan 12 jam, 10 gram biji kacang hijau
dikecambahkan 24 jam dan 10 gram biji kacang hijau dikecambahkan 48 jam. Selanjutnya
masing-masing sampel ditumbuk pada mortar untuk memperluas permukaan sampel dan
ditimbang sebanyak 5 gram dengan menggunakan timbangan analitik. Berat dari sampel
yang ditimbang dicatat. Pada erlenmeyer telah disiapkan larutan buffer asetat sebanyak 50
ml untuk masing-masing sampel. Sampel yang telah ditimbang sebanyak 5 gram kemudian
dimasukkan dalam larutan buffer asetat dan dikocok lalau dibiarkan selama 30 menit

dengan sesekali diaduk. Larutan buffer asetat diberikan untuk mempertahankan pH pada
sampel netral agar enzim amilase dapat bertahan dan tetap bekerja/aktif.
Setelah 30 menit sampel disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman untuk
mendaatkan filtrat/larutan enzim kasar. Larutan enzim selanjutnya dimasukkan dalam tube
sentrifuge sebanyak 10 ml untuk selanjutnya disentrifuge selama 30 menit 1500 rpm.
Sebelum filtrat disentrifugasi dibutkan larutan blanko dengan mencampurkan 5 ml aquades
dalam 50 ml buffer asetat dan dimasukkan sebanyak 10 ml pada tube sentrifuge. Setelah
disentrifugasi supernatan diambil dan didapatkan hasil berupa ekstrak enzim amilase dari 5
sampel biji kacang hijau.
Setelah didapatkan ekstrak enzim amilase dari sampel selanjutnya dilakukan
pengukuran aktivitas enzim amilase. 1 ml enzim amilase diambil dari tube sentrifuge dan
dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan dengan 1 ml larutan substrat pati
dengan menggunakan pipet ukur dan dicampur. Selanjutnya sampel diinkubasi selama 3
menit suhu 300C pada water bath. Inkubasi dilakukan pada suhu 300C karena enzim
amilase bekerja optimum dalam memecah substrat pati pada suhu tersebut. Setelah
inkubasi selesai lalu ditambahkan 2 ml reagen DNS (reagen DNS berwarna kuning dan
membuat larutan enzim berwarna ungu juga). Reagen DNS digunakan untuk mendeteksi
adanya gula pereduksi dalam sampel (disakarida, maltosa) sebagai hasil dari hidrolisi
substrat pati oleh enzim amilase.
Kemudian dipanaskan pada aquades dalam beker gelas hingga mendidih. Hal ini
dilakukan karena reagen DNS bereaksi pada suhu 1000C serta saat dicapai suhu tersebut
untuk mebginaktivasi enzim agar tidak terus menghidrolisis pati. Saat telah dipanaskan
warna akan berubah menjadi merah-jingga menandakan bahwa DNS telah bereaksi dengan
substrat hasil hidrolisi enzim amilase (spt maltosa,dll). Setelah itu kemudian didinginkan
dengan cepat pada air mengalir untuk mendinginkan sampel. Kemudian dipindahkan dalam
erlemneyer dan ditambahkan dengan 20 ml aquades untuk mengencerkan larutan serta
membuat agar warna merah-jingga tidak terlalu pekat agar memudahkan saat sbsorbansi
pafda spektrofotomenti. Caranya dengan dimasukkan larutan enzim tersebut dalam kuvet
dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm sehingga didapatkan nilai
absorbansi dan dapat dihitung konsentrasinya. Sehingga akan diketahui besar aktivitas
enzim amilase yang dibutuhakan untuk melepaskan 1 mikromol maltosa setiap menit tiap
ml enzim pada masing-masing sampel.
C. Hubungan Reangen DNS dengan Aktivitas Enzim Amilase
DNS merupakan suatu senyawa yang bentuknya di alam merupakan bentuk padat
dimana titik lelehnya 170,5oC yang akan larut dalam metanol dan n-oktanol. Apabila dalam
bentuk padat produk ini stabil. Namun sangat reaktif dengan agen oksidasi, zat pereduksi
dan alkalis(MSDS).
Reagen DNS (3,5-dinitro salisilic acid) adalah reagen yang digunakan untuk
mengidentifikasi banyaknya maltosa yang dihasilkan dari hasil penecahan pati oleh enzim
amilase ditandai dengan intensitas warna merah-jingga yang berbeda tiap sampel

tergantung jumlah maltosa yang terhidrolisis. Pati akan terhidrolisis oleh enzim amilse dari
sampel yang diekstrak dan menghasilkan gula pereduksi. Gula pereduksi akan mereduksi
regen DNS menjadi asam 3-amino,5-dinitrosalisilat yaitu senyawa yang mampu menyerap
dengan kuat radiasi gelombang elektromagnetik pada panjang gelombang tertentu.
Terbentuknya asam 3-amino,5-dinitrosalisilat menghasilkan warna merah-jingga. Semakin
pekat warna merah-jingga menandakan banyaknya gula pereduksi serta besarnya aktivitas
enzim amilase. Secara kuantitatif semakin pekat warna merah-jingga berarti semakin besar
absorbansi yang didapat sehingga konsentrasi maltosa tinggi dan aktivitas enzim amilase
juga tinggi pada sampel tersebut (Pavia,2005).
D. Perbandingan Antar Sampel
Dari praktikum yang telah dilakukan dengan menggunakan 5 sampel dengan
perlakuan yang berbeda didapatkan hasil pada sampel biji kacang hijau kering aktivitas
enzim amilase sebesar 1,36 unit/mikromol. Pada sampel selanjutnya yakni kacang hjau
basah (rendam 12 jam) didapatkan aktivitas enzim turun menjadi 1,27 unit/mikromol
sedangkan pada kecambah 12 jam adalah naik menjadi 1,35 unit/mikromol. Pada sampel
kecambah 24 jam aktivitas enzimnya sebesar 1,42 unit/mikromol dan terakhir pada
kecambah 48 jam adalah 1,87 unit/mikromol. Untuk larutan blanko sendiri didapatkan
aktivitas enzim amilase sebesar 1.16 unit/mikromol.
Berdasarkan data tersebut maka dapat ditarik urutan aktivitas enzim amilase pada
smpel dari yang terbesar adalah pada kecambah 48 jam kecambah 24 jam kacang
hijau kering kecambah 12 jam kacang hijau basah (rendam 12 jam) dan paling
sedikit pada blanko. Pada praktikum kali ini ada keanehan data untuk sampel kacang hijau
rendam 12 jam mengalami penurunan aktivitas enzim amilase menjadi 1,27 unit/mikromol
dan kemudian mengalami kenaikan pada saat sampel kecambah setengah hari atau 12 jam
menjadi 1,35 unit/mikromol.
Menurut literatur semakin lama perkecambahan suatu kacang hijau maka akan
semakin besar aktivitas enzim amilase dalam memecah pati menjadi gula-gula pereduksi.
Pada masa perkecambahan hampir semua enzim pada biji-bijian akan aktif termasuk enzim
amilase. Pada perkecambahan hari pertama aktivitas enzimnya 3.09 unit/mikromol lalau
turun pada perkecambahan hari kedua menjadi 2,99 unit/mikrimol dan naik menjadi 4,09
unit/mol pada perkecambahan hari ketiga. Dilanjutkan dengan penurunana pada hari
keempat dan kelima menjadi 2,87 dan 2,66 unit/mikromol (Suarni,2007).
Jika ditinjau dari literatur tersebut maka peningkatan aktivitas enzim pada kacang
hijau kering hingga perkecambahan sudah sesuai yakni mengalami peningkatan. Namun
adanya penurunan kacang hijau rendam 12 jam serta pada kecambah hari kedua tidak
mengalami penurunan malah kenaikan aktivitas enzim diduga terjadi karena beberapa
faktor seperti varietas dan kualitas biji kacang hijau yang berbeda serta perlakuan suhu,
ketersediaaan air dan lainnya yang dapat mengakibatkan terjadinya perbedaan kondisi
tersebut.

E. Faktor yang memepengaruhi Aktivitas Enzim Amilase

Beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim amilas adalah:
1. Suhu
Suhu yang terlalu tinggi akan mendenaturasi enzim sehingga bagian sisi aktif enzim
terganggu dan akan menurunkan konsentrasi dan aktivitas enzim.
2. pH
kisaran pH yang efektif untuk enzim pada umumnya adalah 4,5-8. Jika pH terlalu tinggi
atau terlalu rendah maka akan membuat enzim non aktif secara irreversible karena
denaturasi protein.
3. Konsentrasi Enzim
Pada konsentrasi substrat tertentu kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya
konsentrasi enzim.
4. Konsentrasi Substrat
Tingginya konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reksi akan tetapi pada batas
tertentu tidak akan terjadi peningkatan kecepatan reaksi walau konsentrasi substrat
diperbesar.
5. Adanya Inhibitor
Inhibitor akan menghalangi sisi aktif enzim bergabung dengan substrat sehingg reaksi
antara substart dengan enzim terganggu atau bahkan tidak etrjadi sama sekali.
Adapun menurut literatur lain, ada empat faktor utama yang berperan dalam
percepatan laju reaksi suatu enzim antara lain adalah sebagi berikut (Nurhalim, 2005):
1. Penambahan reaktan- reaktan tertentu akan menyebabkan sisi aktif enzim memiliki
probabilitas lebih tinggi untuk bereaksi.
2. Enzim akan membentuk molekul intermediet yang kemudian akan siap untuk
membentuk produk.
3. Adanya donor- donor atau akseptor elektron untuk mewujudkan reaksi asam basa.
4. Ikatan antara enzim dnegan substrat akan menyebabkan probabilitas substrat
membentuk ikatan baru dan terlepas satu sama lain.

3.

Kesimpulan
Prinsip dari ekstraksi dan uji aktivitas enzim amilase adalah menguji aktivitas enzim amilase
dari kecambha biji-bijian dimana aktivitas enzim amilase ditunjukan dan diukur dari
nanyaknya maltosa yang terbentuk ditamdai dengan perubahan warna dari kuning menjadi
merah-jingga setelah direaksikan dengan reagen DNS. Perhitungan aktivitas enzim dilakukan
dengan menggunakan rumus

Cx

1
1unit
x
T 1 mikromol . Faktor yang mempengaruhi adalah suhu,

pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat dan inhibitor. Hasil kurva sampel yang diperoleh
melalaui perhitungan adalah linear atau sesuai dengan kurva standar yang ada. Semakin tinggi
nilai absorbansi maka semakin banyak konsenttasi serta semakin besar aktivitas enzim
amilase yang terjadi. Berdasarkan prektikum yang telah dilakukan, urutan aktivitas enzim
amilase dari yang paling tinggi ke rendah adalah kecambah 48 jam dengan 1,87
unit/mikromol kecambah 24 jam dengan 1,42 unit/mikromol kacang hijau kering
dengan 1,36 unit/mikromol kecambah 12 jam sebesar 1,35 unit/mikromol kacang hijau
basah (rendam 12 jam) sebesar 1,27 unit/mikromol.

Penilaian
Kompone
n
Pre-test
Aktivitas
Hasil dan
Pembahasan

Nilai

Revisi
DAFTAR PUSTAKA
Andarwulan, Nuri, Feri Kusnandar & Dian Herawati. 2010. Analisis Pangan. Jakarta: Penerbit
Cian Rakyat
Material Safety Data Sheet. 3,5- Dinitrosalicylic Acid MSDS. Science Lab.
Nurhalim, M. Shahib. 2005. Biologi Molekuler. Bandung: Universitas Padjajaran Press.
Pavia, Donald L. 2005. Inroduction to Organic Laborartory Techniques. USA: Thomson
Brooks/Cole
Suarni and Rauf Patong. 2007. Potency of Mung Bean Sprout as Enzyme Source (-amilase).
Indo Journal Chemistry vol.7 (3) Hassanuddin University