Chorie's Blog

Life is Strugle, There is NO Life Without Strugle!!!

Selasa, 22 April 2014

Ekstraksi dan Pengujian Aktivitas

Amilase
EKSTRAKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE

Pre Lab
1. Mengapa enzim amilase bisa didapatkan pada kecambah biji-bijian?

Karena pada kecambah biji-bijian terdapat atau memiliki enzim amilase (enzim ini
akan aktif setelah terjadi proses imbibisi atau penyerapan air). Enzim ini dibutuhkan untuk
menghidrolisis pati menjadi maltosa, kemudian maltosa dihidrolisis oleh enzim maltase
menjadi glukosa. Proses katabolisme ini ditujukan untuk pertumbuhan kecambah (Suarni,
2007).
2. Jelaskan prinsip pengukuran aktivitas enzim amilase secara kuantitatif pada percobaan

ini?

Prinsipnya adalah enzim amilase dari kecambah biji-bijian, dimana aktivitas enzim ini
ditunjukkan dari perubahan warna menjadi bening akibat proses hidrolisis pati oleh enzim
tersebut (Bergmeyer, 2010).
3. Bagaimana cara mengidentifikasi secara kualitatif bahwa telah terjadi reaksi enzimatis

pada percobaan ini?

Caranya adalah dengan terjadinya perubahan warna dari biru menjadi bening.
Memudarnya warna biru menjadi bening tersebut dapat mengindikasikan bahwa warna
biru pada pati (setelah ditambahkan iodin) akan terhidrolisis oleh enzim amilase menjadi
bening (Muljoharjo, 2008).
Hasil dan Pembahasan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, ada beberapa tahapan atau prosedur
dalam mengekstraksi dan menguji aktivitas enzim amilase. Tahapan pertama yaitu
persiapan sampel, ada 50 gr biji kacang hijau. Lalu ditimbang masing-masing 10 gr
untuk mendapatkan perlakuan 10 gr biji kering (tanpa perlakuan), 10 gr direndam
selama 12 jam, 10 gr dikecambahkan selama 12 jam, 10 gr dikecambahkan 24 jam dan
10 gr dikecambahkan selama 48 jam.
Tahapan selanjutnya yaitu ekstraksi enzim amilase. Dari 10 gr sampel tersebut,
dihancurkan dengan menggunakan alat mortar untuk mengeluarkan enzim amilase yang
merupakan endoselluler. Kemudian ditimbang sebanyak 5 gr dengan timbangan analitik
lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan larutan buffer asetat
(0,1-0,5 M) pH 5,5 untuk menstabilkan pH agar netral karena enzim tidak dapat
bertahan pada pH yang terlalu tinggi ataupun terlalu rendah. Lalu didiamkan selama 30
menit dan sesekali diaduk. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan pada saat
ekstraksi enzim. Kemudian disaring dengan kertas saring whatman untuk memisahkan
ampas dengan filtrat. Kemudian diambil 15 ml filtrat ditambahkan 15 ml larutan buffer
asetat dan dimasukkan kedalam tabung bertutup. Selain itu, larutan blanko yang terdiri
dari pencampuran 50 ml akuades dan 50 ml buffer asetat dimasukkan ke dalam tabung
bertutup sebanyak 15 ml dan ikut disentrifugasi. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatann
1500 rpm selama 30 menit. Sehingga hasil akhirnya berupa supernatan yang berada di
atas permukaan dan terdapat endapan yang disebut pellet.
Langkah selanjutnya yaitu pembuatan substrat pati. Diambil 1 ml larutan soluble
starch dengan menggunakan pipet volum dan dimasukkan ke dalam gelas beker.
Kemudian ditambahkan air sebanyak 100 ml, lalu diaduk dan dipanaskan diatas kompor
listrik sampai jernih dan homogen, sehingga didapatkan hasil yaitu substrat pati yang
siap untuk digunakan analisis aktivitas enzim amilase.
Kemudian dilakukan pengukuran aktivitas enzim hasil ekstraksi. Diambil 1 ml enzim
hasil ekstraksi dan ditambahkan 1 ml larutan substrat pati yang dimasukkan ke dalam
tabung reaksi. Di sisi lain juga diambil 1 ml larutan blanko dan 1 ml larutan pati yang di
masukkan ke dalam tabung reaksi. Kedua tabung reaksi tersebut diinkubasi pada
shaker waterbath selama 3 menit dengan suhu optimum 30C. Hal tersebut dilakukan
untuk menghomogenkan dan mempercepat reaksi enzimatis antara substrat pati oleh
enzim amilase diubah menjadi maltosa. Setelah diinkubasi, ditambahkan reagen DNS
(3,5 dinitro salicilic acid) sebanyak 2 ml dengan menggunakan pipet volum. Lalu
dipanaskan pada air mendidih. Hal ini bertujuan untuk mempercepat reaksi antara
reagen DNS dengan maltosa sebagai gula perduksi yang akan mereduksi DNS
sehingga terjadi perubahan warna kuning menjadi merah jingga. Lalu didinginkan cepat
dengan dialirkan pada air kran. Hal ini berfungsi untuk mempercepat proses
pendinginan sebelum pembacaan absorbansi oleh spektrofotometer. Kemudian sampel
dan blanko tersebut masing-masing dituangkan ke dalam gelas beker lalu ditambahkan
20 ml akuades. Kemudian diaduk dan dimasukkan sampel ke dalam masing-masing
kuvet untuk pembacaan absorbansi oleh spektrofotometer dengan panjang gelombang

550 nm. Kemudian dibuat kurva standar dan kurva sampel dengan plotting regresi
linear. Sehingga dengan menggunakan rumus aktivitas enzim -amilase = C x 1/T x 1
unit/1 mikromol didapatkan hasil pengukuran aktivitas enzim tiap-tiap sampel.
Berdasarkan data hasil pengamatan terdapat 2 kurva yaitu kurva standar dan kurva
sampel. Kurva standar didapatkan dari plotting hubungan antara konsentrasi standar
maltosa dalam satuan ppm yaitu 0, 100, 200, 300, 400, 500, dan 600 dengan nilai
absorbansi berurut-urut 0,13, 0,166, 0,205, 0,216, 0,243, 0,243, 0,243, dan 0,256. Dari
hasil plotting tersebut didapatkan persamaan regresi linear yaitu y=0,0204x+0,127.
Mengacu pada persamaan tersebut didapatkan nilai x atau C (konsentrasi maltosa
ekstrak enzim dalam ppm) dengan memasukkan nilai y sebagai absorbansi tiap sampel
yaitu 0,154, 0,068, 0,093, 0,134, dan 0,149. Sedangkan kurva sampel didapatkan dari
hubungan antara x (konsentrasi sampel) dan y (absorbansi sampel), sehingga
menghasilkan persamaan regresi linear y=0,02x+0,126. Apabila dibandingkan antara
kurva sampel dengan kurva standar, dilihat dari persamaan regresi linear yang
didapatkan tidak berbeda nyata. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa data hasil
pengamatan sampel sudah sesuai dengan standar baku yang telah ditetapkan.
Sementara itu, reagen yang digunakan pada percobaan ini, salah satunya adalah
reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid) yang berfungsi sebagai pendeteksi adanya gula
pereduksi pada sampel (disakarida: maltosa yang merupakan hasil hidrolisis pati oleh
enzim amilase). Oleh karena itu, reagen DNS sangat penting peranannya dalam
menentukan aktivitas enzim amilase. Reagen DNS sebagai oksidator akan tereduksi
oleh gula pereduksi yaitu maltosa menjadi asam-3-amino-5-dinitro salisilat dan terjadi
perubahan warna kuning menjadi merah jingga. Oleh karena itu semakin pekat warna
yang dihasilkan maka semakin banyak gula pereduksi yang terkandung. Gula pereduksi
ini dihasilkan dari proses hidrolisis oleh enzim amilase. Oleh karena itu, semakin besar
aktivitas enzim amilase maka semakin banyak reagen DNS yang tereduksi oleh gula
pereduksi dan perubahan warna menjadi merah jingga semakin pekat.
Berdasarkan data hasil pengamatan yang telah dilakukan, didapatkan aktivitas
enzim amilase pada biji kering sebesar 0,4412 unit/mikromol , biji yang direndam selama
12 jam sebesar -0,9641 unit/mikromol, biji yang dikecambahkan selama 12 jam sebesar
-0,5556 unit//mikromol, biji yang dikecambahkan selama 24 jam sebesar 0,1144
unit/mikromol, dan biji yang dikecambahkan selama 48 jam sebesar 0,3595
unit/mikromol. Sehingga apabila diurutkan dari yang terkecil sampai yang terbesar
aktivitas enzim amilase-nya yaitu biji direndam 12 jam < biji dikecambah 12 jam < biji
dikecambah 24 jam < biji yang dikecambah 48 jam < biji kering.
Pada uji aktivitas enzim amilase untuk biji kacang hijau kering memiliki nilai aktivitas
enzim yang lebih besar dibanding biji kacang hijau yang mengalami proses penyerapan
air (imbibisi). Padahal menurut Suarni (2007) pada ekstrak biji kacang hijau kering masih
dalam masa dorman atau masa istirahat sehingga enzim amilase belum aktif. Selain itu
proses penyerapan air pada perkecambahan biji mempunyai aktivitas utama untuk
mengaktifkan makromolekul dan organel sel dalam biji. Selama proses perkecambahan

1.

2.
3.
4.

sebagian besar enzim dalam biji menjadi aktif diantaranya enzim -amilase. Terdapat
ketidakcocokan data hasil pengamatan dengan literatur yang ada, menurut tim
penyusun buku petunjuk praktikum biokimia dan enzimologi (2006) disebabkan karena
saat penghancuran biji, enzim dalam biji kering yang didapatkan lebih besar daripada biji
yang direndam, sehingga ketika diberi akuades enzimnya aktif atau keberadaan kofaktor
atau koenzim yang membantu kerja enzim. Selain itu, konsentrasi enzim tiap perlakuan
berbeda tegantung dari proses ekstraksi enzim.
Sementara itu pada uji aktivitas enzim amilase beberapa sampel bernilai negatif,
yaitu niji direndam 12 jam dan biji dikecambahkan 12 jam. Nilai negatif tersebut
menandakan adanya penurunan aktivitas enzim amilase yang dihasilkan. Ada beberapa
hal yang menyebabkan penurunan aktivitas enzim, diantaranya karena adanya proses
awal perkecambahan diperlukan energi yang cukup besar, untuk itu diperlukan enzim
amilase yang banyak untuk merombak karbohidrat. Setelah waktu tertentu, fase
perkecambahan akan dialihkan menjadi fase pertumbuhan, sehingga pembentukan
enzim amilase menjadi menurun (Bahri, 2012). Selain itu, dimungkinkan kondisinya tidak
sesuai (terlalu asam atau basa) sehingga interaksi antara enzim dan substrat menjadi
kurang maksimal. Pada suasana yang terlalu asam atau basa, konformasinya berubah
sehingga aktivitas enzim terganggu (Mappiratu, 2009).
Pada pengujian aktivitas enzim amilase ini, ada beberapa faktor yang
memengaruhi, yaitu sebagai berikut:
Suhu: karena enzim adalah suatu protein maka kenaikan suhu dapat menyebabkan
denaturasi dan bagian aktif enzim terganggu sehingga konsentrasi dan kecepatan enzim
menurun
pH: umumnya efektivitas maksimal enzim pada pH 4,5-8. Pada pH terlau tinggi atau
rendah umumnya enzim menjadi non aktif secara irreversible karena denaturasi protein.
Konsentrasi enzim: pda konsentrasi substrat tertentu kecepatan reaksi bertambah
dengan bertambahnya konsentrasi enzim
Konsentrasi subtrat: umumnya konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi,
akan tetapi pada batas tertentu tidak terjadi peningkatan kecepatan reaksi walau
konsentrasi substrat diperbesar.
Adanya zat penghambat: hambatan/ inhibitor suatu reaksi berpengaruh terhadap
penggabungan substrat pada bagian aktif yang mengalami hambatan.
Kesimpulan
Ada beberapa poin kesimpulan dari percobaan ekstraksi dan uji aktivitas enzim
amilase diantaranya adalah
1. Prinsip percobaan ini adalah menguji aktivitas enzim amilase dari kecambah
biji-bijian dimana aktivitas enzim amilase ditunjukkan dan diukur dari
banyaknya maltosa yang terbentuk setelah substrat pati diinkubasi dengan
enzim amilase.

2. Tujuan dari percobaan ini adalah mengisolasi enzim amilase dari kecambah
kacang hijau dan untuk menguji aktivitas enzim yang telah diekstrak.
3. Berdasarkan data hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa aktivitas enzim
amilase dari yang terkecil ke terbesar adalah biji direndam 12 jam < biji
dikecambah 12 jam < biji dikecambah 24 jam < biji yang dikecambah 48 jam <
biji kering. Hal ini tidak sesuai dengan literatur, karena terdapat
kesalahan penghancuran biji yang kurang halus, sehingga enzim dalam biji
kacang hijau tidak terekstraksi keseluruhan.
Ada beberapa faktor yang memengaruhi dalam percobaan ekstraksi dan uji aktivitas enzim
amilase, yaitu suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat dan adanya inhibitor.
Daftar Pustaka
Bahri, Syaiful. 2012. Karakterisasi Enzim Amilase dar Kecambah Biji Jagung Ketan. Palu: FMIPA
Universitas Tadulako.
Bergmeyer, Hans-Ulrich. 2010. Methods of Enzymatic Analysis. New York: Academic Press.
Mappiratu dan Nurhaeni. 2009. Penuntun Praktikum Enzim Pangan. Palu: Jurusan Kimia FMIPA
Universitas Tadulako.
Muljoharjo, Muchji. 2008. Analisis Pati dan Produk Pati. Yogyakarta: Pusat Antar Universitas
Pangan dan Gizi UGM.
Suarni. 2007. Potensi Kecambah Kacang Hijau sebagai Sumber Enzim alfa-amilase. Makasar:
FMIPA Universitas Hasanudin.
Tim penyusun, dkk. 2006. Buku petunjuk Praktikum Biokimia dan Enzimologi. Malang: FTP
Universitas Brawijaya.