NAMA : HANINDITA PUSPITASARI

NIM/KELAS : 1804015184/D2

LAPORAN PRAKTIKUM SALTING OUT

Tujuan praktikum

a. Melakukan pemisahan protein dari cairan pankreas dengan menggunakan larutan garam
divalen konsentrasi tinggi (salting out)
b. Memisahkan protein yang mengendap akibat salting out dengan sentrifugasi

A. Salting out
Peristiwa adanya zat terlarut tertentu yang mempunyai kelarutan lebih besar
dibandingkan zat utama, maka menyebabkan penurunan kelarutan zat utama atau
terbentuknya endapan karena adanya reaksi kimia.

B. Dialisis
Dialisis adalah proses perpindahan molekul terlarut dari suatu campuran larutan yang
terjadi akibat difusi pada membran semi permeabel.

C. Amilase pada pankreas

Sel prankreas juga membuat jenis amilase, yang disebut amilase pankreas enzim ini yang
melewati saluran untuk mencapai usus halus. Amilase pankreas mencapai pencernaan
karbohidrat, menghasilkan glukosa.

D. α-Amilase
E. α-Amilase adalah salah satu enzim yang berperan dalam proses degradasi pati. α-
Amilase pada umumnya aktif bekerja pada kisaran suhu 25 oC – 95oC. Penambahan ion
kalsium dan klorida dapat meningkatkan aktivitas kerja dan menjaga kesetabilan enzim
ini. α-Amilase akan memotong ikatan glikosidik α-1,4 pada molekul pati (karbohidrat)
sehingga terbentuk molekul – molekul karbohidrat yang lebih pendek. Hasil dari
potongan enzim ini antara lain maltosa, glukosa dan maltotriosa.

 Amilase pankreas : enzim pada pankreas dengan fungsi mengubah amilum yang
merupakan polisakarida menjadi monosakarida.
 F. Macam – macam metode pengujian konsentrasi protein
- Lowry
- Coomassie blue
- A 280
- Warburg – christian : untuk memperbaiki kontaminasi asm nukleat, sehingga hanya
absobansi protein yang diperoleh menggunakan nilai A280 dan A260.

G. Sentrifugasi
Sentrifugasi adalah teknik pemisahan campuran yang dilakukan dengan memanfaatkan
gaya sentrifugal. Proses atau teknik sentrifugasi dilakukan menggunakan alat yang
dinamakan sentrufuga (centrifuge).
 Metode sentrifugasi : metode pemisahan yang digunakan untuk memisahkan
padatan sangat halus dengan jumlah campuran sedikit.

α-Amilase adalah enzim pencernaan utama yang bekerja pada pati atau glikogen dan terdapat
pada tanaman, jamur dan hewan . pada hewan, α-Amilase terdapat pada pankreas, serum,
parotoid, urin dan kadang – kadang dalam jumlah yang lebih kecil dijaringan atau tumor lain.

Amylase saliva mengalawi pencernaan karbohidrat dimulut dan amilase pankreas adalah enzim
utama untuk pencernaan luminal karbohidrat diusus kecil, amilase pankreas mirip dengan protein
sekretori lainnya dan disintesis dalam retikulum endoplasma kasar.

 α-Amilase pankreas manusia : bobot protein 57 kda, tersusun atas 512 asam
amino

 amilase : kelarutannya baik terhadap air , rantai samping bersifat hidrofilik dan
berbuatan.

Larutan garam menyebabkan kelarutan protein terhadap air berkurang. Hal ini disebabkan karena
larutan garam menetralkan muatan yang ada pada protein sehingga terbentukmya endapan
protein.

o Ammonium sulfat
Digunakan untuk salting out karena :
- Ketersediaanya dalam bentuk murni
- Harga murah
- Kelarutan tinggi
- Memiliki kekuatan ionik yang tinggi
Menambahkan garam kelarutan protein yang dilarutkan dalam air akan menurunkan kelarutan
protein. Jika terus menambahkan garam, protein tidak akan larut dan mengendap. Sebab ketika
garam ditambahkan ke larutan, garam terdisoriasi dalam air membentuk ion. Ion bermuatan ini
berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hidrogen. Lebih sedikit molekul air yang
berinteraksi dengan molekul protein. Molekul protein mulai berkumpul dan menyebabkan
terjadinya pengendapan.

a. Alat dan Bahan

- Cairan pankreas
- Garam ammonium sulfat
- Tabung miktosentrifuse
- Daoar fosfat pH 7,4
- Gelas ukur
- Motar / belender
- Mikropipet 1000 mikroliter
- Batang gelas pengaduk
- Spatel / sudip stainless steel

b. Prosedur Kerja

Prosedur
pankreas dihaluskan dengan digerus/
blender dengan menambahkan buffer fosfat (1:1)
sebanyak 10 ml cairan pankreas disentrifuse pada
suhu 4C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10
menit, supernatan diambil dan ditambahhkan
dengan 70% garam amm sufat tetes demi tetes
presipitasi protein dilakukan selama 1 jam
pada suhu 4C, kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit,. Endapan
hasil sentrifugasi di dialisis
Hasil
pipet larutan buffer fosfat
ukuran supernatan (timbang)
hitung amm sulfat( timbang)
endapan supernatan dengan
amm. Sufat yang telah ditimbang
diambil endapannya
didialisis

Tabel 1

Sampel Jumlah
pankreas ayam 10 mg
sampel saluran pencernaan
setelah dihaluskan dengan 15 ml
dapar fosfat
ammonium sulfat
7,080 mg
yang ditambahnkan
 o Volume ekstraksi protein = 15ml = 0,015 L
472 g x 0,015 L
o Bobot amm. Sulfat yang ditambahkan =
1L

= 7,08 g = 7,080 mg
Tabel 2

Sampel Jumlah
bobot mikrotube 200 mg
bobot mikrotube setelah
dihaluskan dengan 211 mg
dapar fosfat
endapan protein setelah 211 - 200 mg = 11 mg
salting out 11 mg = 0,11 ml

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan isolasi amilase dari cairan pankreas salting out dan
dialisis, dengan tujuan memisahkan protein dari cairan pankreas dengan menggunakan larutan
garam (salting out). Selain percobaan isolasi amilase dilakukan pula percobaan identifikasi kadar
protein dan aktivitas amilase menggunakan protein hasil isolasi dengan tujuan mengidentifkasi
protein dengan cara enzimatis dan menentukan kadar serta aktivitas protein.

Pada bercobaan isolasi amilase tahap pertama adalah menimbang pankreas sebanyak 10 mg
kemudian dihaluskan dan ditambahkan buffer fosfat, lalu dipipet sebanyak 1ml. Sampel saluran
pankreas setelah dihaluskan dengan fosfat berjumlah 15 ml. Buffer fosfat sebanyak 1 ml
dimasukkan ke dalam mikrotobe, setelah itu dilakukan sentrifugasi pada suhu 4 oC dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Setelah selesai pisahkan supernatan dan di ukur.
Selanjutnya timbang ammonium sulfat 70% yang sebelumnya telah dihitung dan didapat
sebanyak 7,08 gr. Selanjutnya supernatan yang telah ditimbang tadi selama 30 menit. Setelah 30
menit kembali dilakukan sentrifugasi pada suhu 4oC (sentrifugasi dingin) dengan kecepatan
10.000 rpm selama 10 menit dan diambil endapannya. Dan proses selanjutnya adalah dialisis.

Kesimpulan
 Salting out adalah peristiwa adanya zat terlarut tertentu yang mempunyai kelarutan lebih
besar dibanting zat utama, maka menyebabkan penurunan kelarutan zat utama atau
berbentuknya endapan karena adanya reaksi kimia.
 Larutan garam menyebabkan kelarutan protein terhadap air berkurang. Hal ini
disebabkan karena larutan garam menetralkan muatan yang ada pada protein sehingga
terbentuknya endapan protein.
 Ammonium sulfat digunakan untuk salting out karena : Kelarutannya yang tinggi,
memiliki kelarutan ionik yang tinggi, ketersediaan dalam bentuk murni dan harganya
murah.
 Dalam praktikum kali ini bobot ammonium sulfat yang ditambhkan berjumlah 7,080 mg
dan endapan protein setelah salting out yang didapat berjumlah 0,11 ml.

Daftar Pustaka

Sadikin, Mohamad,2009. Biokimia Enzim. Jakarta : Widya Medika

Soewanto Hafiz. 2001. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Jakarta : widiya medika

Poedjiad, Anna.1994. Dasar - dasr Biokimia. Jakarta : UI Press