Laporan Praktikum Enzimologi PJP Ukhradiya M.

Safira,
Pertemuan ke 7 Asisten Putri Ratna K.
Tanggal 16 Oktober 2020 Nama Muhamad Ilfan A
Waktu 08-00-11.00 NIM/Ke G84180032/K2
l

PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM α-AMILASE

PENDAHULUAN

Enzim merupakan salah satu jenis substrat biologis yang memiliki fungsi yang
sangat penting dalam kehidupan manusia. Selain dimanfaatkan sebagai biokatalisator,
enzim banyak berperan dalam industri komersial dalam bidang pangan maupun medis
dan farmakologi. Untuk mendapatkan suatu produk yang maksimal, maka dalam
setiap kali reaksi biologis digunakan enzim untuk mempermudah proses maupun
menghemat biaya produksi suatu proses. Enzim yang digunakan pun sebaiknya
merupakan enzim yang memiliki kemurnian yang tinggi. Alfa amilase (EC 3.2.1.1,
α-1,4-glucanglucanohydrolase) adalah enzim yang menghidrolisis amilosa
menghasilkan gula sederhana seperti maltosa dan dekstrin. Enzim tersebut memecah
pati secara acak pada ikatan α -1,4-glikosida, akan tetapi tidak memberikan efek
terhadap ikatan α -1,6-glikosida yang terdapat pada struktur amilopektin (Atmaja
2013). Mekanisme kerja enzim α-amilase terdiri dari dua tahap, yaitu : tahap pertama
degradasi amilosa menjadi maltosa dan maltotriosa yang terjadi secara acak.
Degradasi ini terjadi sangat cepat dan diikuti dengan menurunnya viskositas dengan
cepat. Tahap kedua terjadi pembentukan glukosa dan maltosa sebagai hasil akhir dan
tidak acak. Keduanya merupakan kerja enzim α-amilase pada molekul amilosa. Pada
molekul amilopektin kerja α-amilase akan menghasilkan glukosa, maltosa dan satu
seri α-limit dekstrin, serta oligosakarida yang terdiri dari empat atau lebih glukosa
yang mengandung ikatan α-1,6-glikosidik (Winarno 2010).
Aktivitas enzim merupakan sejumlah enzim yang dapat mengonversi substrat
menjadi produk pada waktu tertentu dan pada kondisi optimum. Aktivitas enzim α-
amilase merupakan jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1 mikro mol
gula reduksi (D-galaktosa ekuivalen) per menit (Zelvi et al. 2017). Aktivitas enzim α-
amilase dapat diukur berdasarkan penurunan kadar pati yang larut atau jumlah gula
pereduksi yang terbentuk (Ariandi 2016). Praktikum ini bertujuan memahami tujuan
penentuan aktivitas enzim serta memahami beberapa metode penentuan aktivitas
enzim.

HASIL DAN DISKUSI

Mengolah data laboratorium sehingga dapat diperoleh data aktivitas enzim.

Enzim yang akan diukur aktivitas enzimnya akan dilakukan serangkaikan tahap,
masing-masing tahap akan diukur aktivitas enzimnya. Aktivitas enzim α-amilase
dapat ditentukan dengan pengukuran bertambahnya produk maupun berkurangnya
substrat, sehingga perolehan data aktivitas enzim bergantung pada metode yang
digunakan untuk pengukuran aktivitas. Terdapat tiga buah metode yang dapat
digunakan dalam pengukuran aktivitas enzim α-amilase, yaitu : metode pengukuran
menggunakan dinitrosalicylic acid (DNS), metode Nelson-Somagyi (NS) dan metode
pengukuran menggunakan iodin (Sundarram dan Murthy 2014). Prinsip dan metode
pengukuran aktivitas enzim menggunakan dinitrosalicylic acid (DNS) adalah alikuot
dari stok substrat larutan dicampur dengan larutan enzim lalu dilakukan inkubasi 10
menit pada suhu 50°C.
Reagen DNS ditambahkan ke dalam tabung reaksi dan campuran diinkubasi
dalam penangas air mendidih selama 5 menit. Setelah pendinginan sampai suhu
kamar, absorbansi supernatan pada 540 nm diukur. Nilai A540 untuk substrat dan
enzim kosong dikurangkan dari nilai A540 untuk sampel yang dianalisis. Dalam
metode NS, alikuot larutan stok substrat dipanaskan pada 50 °C selama 5 menit.
Larutan enzim yang dipanaskan sebelumnya (50 °C selama 5 menit) ditambahkan ke
substrat. Campuran reaksi ini diinkubasi pada suhu 50 °C dan reaksi dilakukan
selama 10 menit. Setelah inkubasi, pereaksi tembaga Somogyi ditambahkan untuk
menghentikan reaksi. Ini kemudian diinkubasi dalam water bath mendidih selama 40
menit & didinginkan hingga suhu kamar. Pada langkah berikutnya, reagen
arsenomolybdate Nelson ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu
kamar. Akhirnya air ditambahkan dan campuran disentrifugasi pada 13.000 rpm
selama 1 menit dan absorbansi supernatan terbaca pada 610 nm (Gusakov et al.
2011).
Prinsip uji aktivitas enzim α-amilase didasarkan pada jumlah gula reduksi
(maltosa) yang dihasilkan dari hidrolisis pati dengan menggunakan metode DNS
yang dimodifikasi. Campuran sebanyak 0,5 mL larutan ekstrak kasar enzim α-
amilase, 0,5 mL buffer natrium fosfat pH 7,0 dan 0,5 mL substrat (pati sagu) 2%
diinkubasi pada suhu 55°C selama 60 menit. Setelah itu campuran tersebut
ditambahkan 1,5 mL pereaksi DNS, lalu dikocok dengan vortex selama 10 detik.
Selanjutnya campuran tersebut dipanaskan di dalam air mendidih selama 10 menit,
kemudian didinginkan dalam air es. Hasil reaksi diukur absorbansinya pada panjang
gelombang maksimum 470 nm. Kadar maltosa hasil hidrolisis pati oleh enzim α-
amilase dapat dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar maltosa
pada kisaran 80-600 ppm. Perhitungan kadar maltosa dilakukan dengan
menyubstitusikan absorbansi larutan yang diperoleh pada penentuan kadar maltosa ke
dalam persamaan regresi kurva kalibrasi larutan standar maltosa.
Kemurnian enzim ditentukan oleh tinggi rendahnya aktivitas spesifik enzim .
Semakin tinggi semakin murni. Aktivitas spesifik adalah nilai yang diperoleh dari
perbandingan antara unit aktivitas terhadap kadar protein. Aktivitas enzim ditentukan
dengan metode Wajzer dan penentuan kadar protein dengan metode Lowry . Aktivitas
enzim menunjukkan kemampuan enzim untuk mengonversi substrat menjadi produk
per satuan waktu, sementara aktivitas spesifik menunjukkan aktivitas enzim per mg
protein. Perbedaan aktivitas enzim dengan aktivitas spesifik enzim adalah bahwa
aktivitas enzim mengacu pada jumlah substrat yang dikonversi menjadi produk per
satuan waktu, sedangkan aktivitas spesifik enzim merujuk pada aktivitas enzim per
miligram protein. Aktivitas enzim dan aktivitas spesifik enzim pada setiap tahap
memiliki perbedaan. Aktivitas enzim cenderung mengalami penurunan hal ini
dikarenakan volume larutan enzim yang selalu menurun dan enzim pengotor ikut
terbuang, karena aktivitas enzim juga mengukur aktivitas dari enzim pengotor pada
larutan enzim tersebut. Aktivitas spesifik enzim cenderung mengalami peningkatan
karena terjadinya penurunan konsentrasi protein yang terdapat pada larutan enzim,
hal tersebut juga menandakan bahwa enzim semakin murni (Tabel 1).

Tabel 1 Tahapan dan aktivitas enzim α-amilase Bacillus stearothermophilus TII-12

(Lestari et al. 2011)

SIMPULAN

Pengukuran aktivitas enzim α-amilase dapat dilakukan menggunakan berbagai

metode berdasarkan pertambahan produk atau pengurangan substrat . Metode yang
digunakan dapat berupa metode DNS, metode NS, dan metode iodin . Terdapat dua
aktivitas yang dapat diukur, yaitu aktivitas enzim dan aktivitas spesifik enzim, namun
aktivitas spesifik enzim lebih digunakan sebagai indikator kemurnian enzim .
Aktivitas enzim cenderung menurun seiring dengan kemurnian enzimnya, sedangkan
aktivitas spesifik enzim cenderung meningkat seiring dengan kemurnian enzim.

DAFTAR PUSTAKA

Ariandi. 2016. Pengenalan enzim amilase (alpha-amylase) dan reaksi enzimatisnya

menghidrolisis amilosa pati menjadi glukosa. J. Din. 07(1):74–82.
Atmaja DS. 2013. Isolasi, purifikasi dan karakterisasi α-amilase dari Trichoderma
viride FNCC 6013. Chem Info J. 1(1):85–93.
Gusakov AV, Kondratyeva EG, Sinitsyn AP. 2011. Comparison of two methods for
assaying reducing sugars in the determination of carbohydrase activities. Int. J.
Anal. Chem. 2011:1–4.doi:10.1155/2011/283658.
Lestari P, Richana N, Darwis AA, Syamsu K, Murdiyatmo U. 2011. Purifikasi dan
karakterisasi α-amilase termostabil dari Bacillus stearothermophilus TII-12. J.
AgroBiogen. 7(1):56.doi:10.21082/jbio.v7n1.2011.p56-62.
Sundarram A, Murthy TPK. 2014. α -Amylase production and applications : a
review. J. Appl. Environ. Microbiol. 2(4):166–175. DOI:10.12691/jaem-2-4-
10.
Zelvi M, Suryani A, Setyaningsih D. 2017. Hidrolisis Eucheuma cottoni dengan
enzim K-kargenase dalam menghasilkan gula reduksi untuk produksi bioetanol .
Jurnal Teknologi Industri Pertanian. 27(1) : 33-41.