Laporan Praktikum Enzimologi PJP Dr.

Popi Asri Kurniatin

Pertemuan ke 6 Asisten Mustika Luthfia
Tanggal 01 Oktober 2021 Nama Rahmah Fauziah
Waktu 08-00-11.00 NIM/Kel G84190034/K6

PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM SELULASE

PENDAHULUAN

Aktivitas enzim menunjukkan jumlah mikromol substrat yang diubah menjadi

produk per unit waktu pada kondisi suhu dan pH optimum. Aktivitas enzim merupakan
ukuran kuantitas keadaan aktif enzim dan tergantung pada kondisi yang harus spesifik.
Satuan internasional (SI) unitnya adalah katal dengan satuan 1 mol s-1 untuk setiap
unitnya. Satuan yang umum digunakan adalah unit enzim (U) dengan 1 U = 1 mol
min-1 atau setara dengan 16,67 nanokatal (Seftiono 2017). Aktivitas enzim
mencerminkan kualitas enzim yang akan digunakan sebagai katalis. Menurut
Wijanarka et al. (2016), enzim dengan aktivitas yang rendah memiliki kemampuan
katalitik rendah sehingga tidak dapat digunakan sebagai katalis dalam industri maupun
farmasi, sedangkan enzim yang memiliki kualitas tinggi dicirikan dengan nilai aktivitas
yang tinggi sehingga aktivitas enzim menjadi parameter yang penting untuk ditentukan
dalam produksi enzim.
Penentuan aktivitas enzim merupakan salah satu tahapan dalam produksi enzim
yang tergolong sebagai karakterisasi protein. Karakterisasi protein merupakan tahapan
yang bertujuan menentukan jenis aktivitas serta struktur protein yang terdapat dalam
suatu larutan (Boyer 2012). Penentuan aktivitas enzim bertujuan mengetahui seberapa
besar kemampuan enzim yang diproduksi dalam mengonversi substrat menjadi produk
(Aryani 2012). Menurut Wijanarka et al. (2016), hal ini menjadi sangat penting karena
kemampuan enzim untuk mengonversi substrat menjadi produk merupakan tolok ukur
utama untuk menentukan kualitas enzim hasil produksi. Selain itu, penentuan aktivitas
enzim merupakan langkah untuk menentukan metode pemurnian enzim yang paling
optimum. Hal ini dikarenakan tahapan pemurnian yang paling optimum adalah tahapan
yang menghasilkan enzim dengan aktivitas tertinggi (Murtiyaningsih dan Hazmi
2017).
Secara umum, terdapat tiga prinsip pengukuran yang digunakan untuk
menentukan aktivitas enzim, antara lain pengukuran jumlah produk yang terbentuk,
pengukuran jumlah substrat yang terkonversi, dan pengukuran jumlah koenzim yang
berkurang. Metode yang paling sering digunakan untuk menentukan aktivitas enzim
ialah dengan mengukur jumlah produk yang terbentuk. Hal ini dikarenakan galat yang
dihasilkan cenderung lebih kecil dan lebih banyak metode pengukuran yang dapat
digunakan (Farris et al. 2016). Menurut Boyer (2012), metode pengukuran yang dapat
digunakan untuk penentuan aktivitas enzim diantaranya adalah metode
spektrofotometri dan metode yang berbasis elektrokimia. Praktikum ini bertujuan
memahami tujuan penentuan aktivitas enzim serta memahami beberapa metode
penentuan aktivitas enzim selulase.

METODE

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah tabung Ependorf, penangas air,
spektrofotometer UV-Vis. Adapun bahan-bahan yang digunakan berupa ekstrak enzim
selulase, substrat CMC (karboksimetil selulosa), dan reagen DNS atau dinitrosalisilat
yang terdiri atas campuran NaOH, garam Rochelle, asam dinitrosalisilat, fenol serta
natrium sulfit (Aryani 2012).

Prosedur Percobaan

Aktivitas enzim selulase diukur menggunakan metode Miller. Sebanyak 100

μL ekstrak enzim selulase dicampurkan dengan 100 μL substrat CMC dalam tabung
Ependorf, kemudian diinkubasi pada temperatur 50℃ selama 30 menit. Setelah
diinkubasi, sebanyak 600 μL reagen DNS ditambahkan ke dalam tabung, kemudian
tabung tersebut dimasukkan ke dalam penangas air mendidih selama 15 menit
bersamaan dengan kontrol (urutan penambahan komposisi pada kontrol 100 μL enzim
ditambah 600 μL DNS dan 100 μL substrat CMC namun tanpa inkubasi) kemudian
didinginkan dalam air es selama 20 menit, sehingga diperoleh volume total larutan uji
sebesar 800 μL. Larutan tersebut kemudian diuji absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 550 nm (Aryani 2012).

HASIL DAN DISKUSI

Aktivitas enzim merupakan ukuran kuantitatif untuk menentukan kemampuan

enzim dalam mengubah suatu substrat menjadi produk pada reaksi-reaksi biokimia.
Aktivitas enzim sendiri didefinisikan sebagai jumlah enzim aktif yang dapat
mengkonversi 1 μmol substrat menjadi 1 μmol produk dalam 1 menit inkubasi enzim
pada kondisi optimumnya, sedangkan aktivitas spesifik enzim lebih menunjukkkan
enzim yang bekerja per miligram protein. Aktivitas spesifik mengukur kemurnian dari
enzim yaitu jumlah dari produk yang dibentuk oleh enzim pada waktu tertentu per
miligram enzim (Nelson dan Cox 2013; Seftiono 2017).
Metode yang paling umum dilakukan untuk menentukan aktivitas enzim
selulase adalah metode spektrofotometri DNS atau dikenal sebagai metode Miller
(Aryani 2012). Metode ini menggunakan pereaksi atau reagen asam dinitrosalisilat
(DNS) yang direaksikan dengan ekstrak enzim selulase. Reagen DNS merupakan hasil
pencampuran dari dua larutan yaitu larutan hasil pencampuran padatan asam
dinitrosalisilat dengan padatan NaOH yang dilarutkan dalam akuades dan hasil
pelarutan padatan natrium kalium tartarat dalam akuades. Prinsipnya, reagen DNS akan
bereaksi dengan gugus aldehida pada glukosa yang merupakan produk degradasi
selulosa dengan bantuan selulase. Gugus aldehida akan teroksidasi menjadi gugus
karboksil sehingga glukosa akan berubah menjadi asam 3-amino-5-salisilat pada
kondisi basa. Produk tersebut dapat menyerap sinar pada panjang gelombang 540 nm
(Bintang 2018). Metode ini akan menentukan konsentrasi glukosa sebagai produk
selulase, sehingga metode ini merupakan metode indirect assay atau pengukuran
aktivitas enzim secara tidak langsung (Aryani 2012).
Sebelum reagen asam 3,5 dinitrosalisilat (DNS) digunakan, sampel terlebih
dahulu dicampurkan dengan CMC atau karboksimetil selulosa. CMC berperan sebagai
substrat selulosa dan juga berperan sebagai inducer atau zat penginduksi untuk
memacu produksi selulosa oleh mikrob (Putri 2016). Selain digunakan dalam
penentuan aktivitas enzim, CMC juga sering digunakan sebagai substrat dalam uji
skrining enzim. Substrat CMC disisipkan ke dalam medium pertumbuhan mikroba
yang akan diuji. Medium ini akan memberikan ciri khusus berupa munculnya zona
bening yang menandakan bahwa telah terjadi degradasi substrat selulosa oleh selulase
yang diproduksi oleh mikroba (Nagah et al. 2016).
Metode lain yang dapat digunakan untuk menentukan aktivitas enzim selulase
adalah metode p-nitrophenil-β-D-glucopyranosidase (pNPG). Penentuan aktivitas
enzim selulase (β-glucosidase) dapat ditentukan dengan menggunakan substrat pNGP.
Pelepasan p-nitrofenol dapat diukur melalui metode spektrofotometer UV-VIS pada
panjang gelombang 405 nm. Jumlah p-nitrofenol yang dihasilkan berkaitan dengan
aktivitas enzim. Apabila aktivitas enzim semakin tinggi, maka semakin banyak pula p-
nitrofenol yang dihasilkan. Hal ini akan berdampak kepada nilai absorbansi yang
terukur pada spektrofotometer akan tinggi pula (Aryani 2012).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Aryani (2012), penentuan aktivitas
enzim selulase diawali dengan pengukuran absorbansi larutan standar glukosa (Tabel
1) yang telah diketahui konsentrasinya pada panjang gelombang 550 nm. Selanjutnya,
data yang sudah diketahui tersebut digunakan untuk membuat kurva standar dengan
bantuan larutan standar glukosa. Berdasarkan kurva standar (Gambar 1), didapatkan
persamaan regresi linear y = 0,131x + 0,131. Kemudian, dilakukan substitusi
absorbansi produk ke dalam persamaan regresi linear untuk mendapatkan konsentrasi
produk. Setelah konsentrasi produk diketahui, aktivitas enzim selulase dapat ditentukan
dengan menggunakan persamaan :

𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑘 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑥 10

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑠𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠𝑒 =
𝑊𝑎𝑘𝑡𝑢 𝑖𝑛𝑘𝑢𝑏𝑎𝑠𝑖 𝑥 𝐵𝑀 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎

Tabel 1 Absorbansi standar glukosa (Aryani 2012)

[Glukosa] [µg/mL] Absorbansi
2 0,1191
3 0,2782
4 0,3771
5 0,5745
6 0,7646
7 0,7892
8 0,8985
 Gambar 1 Kurva standar glukosa
Aktivitas enzim berbeda dengan aktivitas spesifik enzim. Aktivitas enzim
menunjukkan jumlah mikromol substrat yang diubah menjadi produk per unit waktu
pada kondisi optimum sedangkan aktivitas spesifik enzim mengukur kemurnian dari
enzim yaitu jumlah dari produk yang dibentuk oleh enzim pada waktu tertentu per
miligram enzim. Aktivitas enzim memiliki satuan SI katal dan satuan yang sering
digunakan adalah unit enzim (U) sedangkan aktivitas spesifik enzim memiliki satuan
SI katal kg-1 dan yang sering digunakan adalah U mg-1 (Seftiono 2017).
Menurut hasil diskusi, aktivitas enzim dan aktivitas spesifik enzim setiap
tahapannya akan meningkat sedangkan total aktivitas akan menurun. Menurunnya total
aktivitas disebabkan oleh berkurangnya volume enzim yang digunakan pada setiap
fraksi berkurang, sehingga total aktivitas akan menurun. Hal ini sesuai dengan Megha
et al. (2015) yang menyatakan bahwa total protein, total aktivitas, dan yield yang
dihasilkan dari setiap tahap pemurnian akan menurun, sementara aktivitas spesifik serta
tingkat kemurnian yang dihasilkan cenderung meningkat pada setiap tahapan
pemurnian. Hal ini terjadi karena semua tahapan pemurnian enzim akan
menghilangkan pengotor yang mampu menurunkan aktivitas enzim namun terlihat
menambah rendemen enzim.
Aktivitas enzim dan aktivitas enzim selulase dari setiap literatur berbeda.
Perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan sumber mikroba yang digunakan
dalam produksinya. Hal ini dapat terjadi karena jenis mikroba yang digunakan sangat
menentukan karakteristik enzim selulase yang dihasilkan (Soeka et al. 2019). Selain
itu, hal ini juga disebabkan akibat adanya perbedaan faktor-faktor dasar yang
memengaruhi kerja enzim seperti pH, waktu inkubasi, konsentrasi atau jumlah enzim
serta suhu percobaan (Aryani 2012).

SIMPULAN

Penentuan aktivitas enzim bertujuan menentukan seberapa besar kemampuan

enzim dalam mengubah substrat menjadi produk, mengukur kualitas enzim serta
menentukan metode pemurnian yang paling optimum. Aktivitas enzim selulase dapat
ditentukan dengan metode spektrofotometri Miller dengan bantuan reagen DNS
maupun dengan metode p-nitrophenil-β-D-glucopyranosidase (pNPG). Metode
spektrofotometri Miller merupakan metode yang paling sering digunakan dikarenakan
memberikan hasil yang lebih akurat serta galat yang lebih kecil.

DAFTAR PUSTAKA

Aryani SW. 2012. Isolasi dan karakterisasi ekstrak kasar enzim selulase dari kapang
selulolitik Mucor sp. B2 [skripsi]. Surabaya: Universitas Airlangga.
Bintang M. 2018. Biokimia Teknik Penelitian Edisi Ke-2. Jakarta (ID): Erlangga.
Boyer RF. 2012. Biochemistry Laboratory. Modern Theory and Techniques. New
Jersey (NJ): Pearson Education.
Farris MH, Ford KA, Doyle RC. 2016. Qualitative and quantitative assays for detection
and characterization of protein antimicrobials. Journal of Visualized
Experiments. 110: 1-10.
Megha SV, Maragathavalli S, Brindha S, karthikeyan V, Annadurai B, Gangwar SK.
2015. Isolation and purification of cellulase. International Journal of Science
and Nature. 6 (3): 474 – 479.
Murtiyaningsih H, Hazmi M. 2017. Isolasi dan uji aktivitas enzim selulase pada bakteri
selulolitik asal tanah sampah. Jurnal Agritrop. 15 (2): 293 – 308.
Nagah M, Aziz MSA, Sherbiny GME, Moghannem SAM, Shawky BT. 2016.
Qualitative and quantitative screening of cellulases from different local
egyptian fungal strains. Middle East Journal of Applied Sciences. 6 (3): 579 –
587.
Nelson DL, Cox MM. 2013. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition. New
York (NY): W. H. Freeman and Company.
Putri S. 2016. Karakterisasi enzim selulase yang dihasilkan oleh Lactobacillus
plantarum pada variasi suhu, pH dan konsentrasi substrat [skripsi]. Malang:
Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim.
Seftiono H. 2017. Penentuan aktivitas enzim mananase dari berbagai mikroorganisme
di Indonesia dan peranannya dalam bidang pangan: kajian pustaka.
AGROINTEK. 11(1): 14-20.
Soeka Y, Suharna N, Triana E, Yulinery T. 2019. Characterization of cellulose enzyme
produced by two selected strains of Streptomyces macrosporeus isolated from
soil in Indonesia. Makara Journal of Science. 23 (2): 65-71.
Wijanarka, Kusdiyantini E, Parman S. 2016. Screening cellulolytic bacteria from the
digestive tract snail (Achatina fulica) and test the ability of cellulase activity.
Biosaintifika Journal of Biology and Biology Education. 8 (3): 385 – 391.