PRAKTIKUM BIOKIMIA II

UJI AKTIVITAS AMILASE

Disusun oleh:

Nama : Muchammad Ismail

NIM : 17630100
Jurusan : Kimia
Asisten : Lailatul Fitria
Kelas :A

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI MAULANA MALIK IBRAHIM
MALANG
2021
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Enzim mempunyai peranan penting di berbagai reksi dalam sel. Sebagai
protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalis
reaksi seperti konversi dan metabolism tubuh. Salah sau enzim yang memiliki
peranan dalam metabolism tubuh, tepatnya dala proses pencernaan yakni
enzim amilase.
Amilase merupakan enzim yang sering digunakan dalam bidang industry,
hal ini dikarenakan enzim amilase memiliki kemampuan untuk menghidrolisis
pati. Pati yang dihidrolisis tersebut berubah menjadi deksirin sebelum menjadi
glukosa atau gula sederhana (Nahgin,2013). Salah satu mikroba penghasil
enzim amilase ialah Bacillus Subtilis.
Aktivitas enzim dapat diketahui dengan 2 cara, yakni zona bening dan uji
iodin. Iodin digunakan untuk menghasilkan perubahan warna akibat beraksi
dengan amilum.bagian yang terdapat enzim akan berwarna bening karena tidak
terdpat amilum didalamnya. Sedangkan mettode DNS bekerja dengan bereaksi
dengan gula pereduksi hasil hidrolisis amilum oleh enzim. Reaksi tersebut
ditandai dengan perubahan warna kuning menjadi jingga kemerahan.
(Fessenden, 19997).
1.2. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah menelaah aktivitas amilase baik secara
kualitatif maupun kuantitatif.

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Dasar Theory

Enzim adalah suatu atau beberapa gugus polipeptida (protein) yang
berfungsi sebagai biokatalisator yakni pemercepat reaksi tanpa ikut bereaksi,
semua enzim yang telah diidentifikasi saat ini hampir semuanya berupa protein.
Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang
bereaksi dan dengan demikian akan mempercepat proses reaksi. Sebagian
besar enzim bekerja secara khusus atau spesifik yang berarti bahwa setiap jenis
enzim hanya bekerja pada satu macam senyawa. Hal ini disebabkan perbedaan
struktur kimia setiap enzim yang bersifat tetap (Malon et al, 1993).
Enzim amilase adalah salah satu enzim yang banyak dihasilkan oleh
makhluk hidup, salah satu penghasil enzim amilase adalah mikroorganisme,
enzim amilase merupakan salah satu enzim dengan klasifikasi enzim hidrolisis
dan berkemampuan untuk memutuskan ikatan glikosida, maltosa, dan dekstrin
(Susilowati, 2015). Kelompok enzim ini memiliki berbagai macam variasi
dalam aktivitasnya yang sangat spesifik tergantung tempatnya bekerja,
beberapa kelompok enzim amilase adalah α-amilase, β-amilase, dan γ-amilase
(Nangin, 2015).
Amilase dapat dihasilkan dari bakteri amilolitik dan jamur amilolitik yang
berasal dari tanah maupun sumber air panas, bakteri amilolitik hidup didalam
tanah sangat melimpah dan mereka memanfaatkan samua nutrient yang
terkandung didalamnya. Amilase dapat diproduksi oleh beberapa jenis bakteri
amilolitik yaitu Bacillus aquamaris MKSC 6.2, Bacillus amyloliquifaciens
ABBD, Bacillus subrelis 6.5, Bacillus licheriformis ATTC 99454,
Streptomycs, Geobacillus thermodenitrificant, Klebsiela Pnemoniac,
Clastridium sp, Lactobacilus sp, Micrococonas sp, dan Bacterionides sp
(Susilowati, 2015).
Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi fungsi enzim seperti:
a) Suhu

3
 Enzim merupakan suatu protein yang mana dapat terdenaturasi
oleh suhu dan memiliki suhu optimum kerja. Pada suhu tinggi
bagian aktif enzim akan terganggu sehingga kecepatan dan
konsentrasi enzim berkurang.
b) pH
Enzim memiliki efektifitas pH antara 4,5-8,0 dan pada pH yang
terlalu tinggi maupun terlalu rendah umumnya enzim tidak bekerja
secara aktif.
c) Konsentrasi Substrat
Konsentrasi daripada substrat dapat meningkatkan efektifitas
enzim akan tetapi terdapat batas tertentu sehingga tidak terjadi
peningkatan yang signifikan.
d) Konsentrasi Enzim
Sama halnya konsentrasi substrat, konsentrasi enzim akan
meningkatkan reaksi enzim, tapi pada keadaan tertentu tidak terlalu
efektif.
e) Inhibitor
Inhibitor (penghambat) merupakan zat yang akan menghambat laju
reaksi enzim.

2.1.1. Metode DNS

Metode DNS merupakan metode menggunakan pereaksi DNS dimana
DNS digunakan untuk mengukurgula reduksi yang diproduksi oleh
mikrobamemiliki tingkat ketelitian yang tinggi sehingga dapar diaplikasikan
pada gula dengan kadar yang sangat kecil. DNS merupakan senyawa aromatis
yang akan bereaksi dengan gula reduksi membentuk asam-3-amino-5-dinitro-
salisilat yang merupakan senyawa yang mampu menyerap denagn kuat radiasi
gelombang elektromagnetik pada panjang gelombang 540 nm (Putri, 2016).
Pereaksi DNS dapat bekerja dengan adanya komponen pendukung yang
membantu kerja DNS yaitu Kna-Tartarat-Fenol, Sodium bisulfit (Na2SO3) dan
(NaOH) (Irawati, 2016). Prinsip pengujian DNS adalah gugus aldehid pada
rantai polisakarida dioksida menjadi gugus karboksil, disaat yang bersamaan

4
gugus aldehid gula akan mereduksi asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi asam 3-
amino-5-nitrosalisilat. Reaksi tersebut akan berlangsung terus-menerus selama
terdapat gula pereduksi didalam larutan yang akan diujikan (Hasannah dan
Iwan, 2015). Adanya gula pereduksi pada sampel akan bereaksi dengan larutan
DNS yang awala berwarna kuning menjadi warna jinga kemerahan (Irawati,
2016).
Aktivitas enzim dapat ditentukan dengan mengkonversi nilai absorban
yang diperoleh dari konsentrasi glukosa standar, kemudian dihitung dengan
rumus (Irawati, 2016).
𝑪 𝑯
𝑨𝑬 = =
𝑩𝑴 𝑷𝒓𝒐𝒅𝒖𝒌 𝒙 𝒕 𝑬
Keterangan:

AE : Aktivitas enzim (Unit/ml)

C : Konsentrasi

BM : Berat molekul glukosa (180 g/mol)

H : Volume total enzim substrat (ml)

E : Volume enzim

Reaksi tersebut merupakan reaksi antara pereaksi 3,5 dinitrosalisilat dan

gula reduksi, reaksi tersebut akan berlangsung trus-menerus selama terdapat
gula pereduksi (hasanah, 2014).

5
 Isolasi bakteri termofilik yang mengindikasikan penghasil enzim amilase
dilihat aktifitasnya dengan mengukur diameter zona bening disekitar isolat
bakteri termofilik menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut mampu
menghidrolisis pati. isolasi bakteri termofilik penghasil enzim amilase dengan
aktivitas hidrolitik yang termasuk kriteria memiliki potensi tinggi dengan
diameter zona bening >30mm, kriteria potensi sedang 20-30mm dan potensi
rendah <20mm (Hasanah, 2014).

2.2. Tinjuan Bahan

2.2.1. Larutan Iodin
Iodin merupakan unsur non logam tergolong unsur halogen merupakan
padatan tidak berwarna, dapat menguap pada suhu kamar, dan membenuk
warna ungu dengan bau tak sedap serta dapat membuat iritasi, memiliki Td
134,35 °C, Tl 113,5 °C, dan densitas 11,27 g/c. Sedikit larut dalam air dan
larut baik pada larutan KI (Mulyono, 2005).
2.2.2. KNa Tartarat
Garam yang dimanfaatkan pada larutan fehling untuk mengui karbohidrat,
selain itu juga untuk uji gula pereduksi dengan rumus molekul
NaKC4H3O6.4H2O dan Mr 282,22 g/mol (Mulyono, 2005)
2.2.3. Pati Padat
Merupakan media agar selektif amilolitik dengan komposisi 0,2% yeast
ekstrak 0,5% pepton, 0,05%% NaCl, 0,05% MgSO4, 0,015% CaCl2, 2%
agar, 1% soluble starch (Hasanah, 2014).
2.2.4. Aquades
Air suling proses pengembunan uap air Td 100°C, Tbeku 0°C, densitas 18
g/mol (Mulyono, 2005).
2.2.5. Larutan Buffer
Buffer merupakan larutan penyangga adalah larutan yang memiliki pH
dapat dikatakan tetap. Walaupun ditambahn senyawa asam ataupun basa.
Biasanya buffer merupakan asam ataupun basa lemah konjugasi dalam
konsentrasi hampir sama, buffer berperan dalam kontrol ion dan sekaligus
mempertahankan pH dalam proses biokimia dan fisiologis (Oxtoby, 2004).
2.2.6. Reagen DNS

6
 Senyawa aromatis yang akan bereaksi dengan gula pereduksi membentuk
asam-3-amino-5- dinitro salisilat merupakan senyawa yang mampu
menyerap kuat radiasi gelombang elektromagnetik pada λ 540nm (Putri,
2016). Pereaksi DNS dapat bekerja akurat dengan komponen pendukung
DNS yaitu KNa tartarat, fenol, Na2SO3, NaOH (Irawati, 2016).
2.2.7. Larutan Pati
Polisakarida putih, dengan butiran halus (tepung), berasal dari tumbuhan,
campuran dari 1 polimer amilosa dan 80-90% amilopektin bila terhidrolisis
akan membentuk dekstrin dan berakhir dengan hasil glukosa (Mulyono,
2015).
2.2.8. Pati Cair
Merupakan media pertumbuhan bakteri dengan komposisi 0,2%, Yeast
0,5% pepton, 0,05% NaCl, 0,05% MgSO4, 0,015% CaCO3, 1% soluble
starch (Hasanah, 2014).

7
 BAB III
METODE PERCOBAAN

3.1. Alat
Adapun alat yang digunakan adalah gelas beaker 3 buah, tabung reaksi 12
buah, Cawan petri 1 buah, pipet ulur 4 buah, bola hisap 1 buah, pipet tetes 1
buah, shaker inkubator, spektrofotometer, neraca analitik, vortex.
3.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan adalah larutan iodin, pati
padat, pati cair, pati terlarut 1%, larutan buffer pH 4,5,6, reagen DNS, KNa
tartarat 40%.
3.3. Cara Kerja
3.3.1. Skrining aktivitas amilase dengan tes Iodin
Isolat bakteri digoreskan pada pati padat, diinkubasi pada suhu 37°C
±24jam, setelah itu ditambah larutan iodin selama 2 menit, dan terakhir
diamati zona beningnya.
3.3.2. Isolasi amilase dari kultur bakteri
Diambil 3 ose bakteri, dimasukkan 25 ml pati cair diinkubasi pada shaker
inkubator pada suhu 37C selama 10 jam, disentrifugasi 5000 rpm selama
10 menit dan hasil filtrat merupakan ekstrak kasar amilase
3.3.3. Uji aktivitas DNS
Dimasukkan 1 ml filtrat yang dihasilkan kedalam tabung raksi, ditambah 1
ml pati terlarut telah dilarutkan pada pH 4,5,6 ditutup dengan alumunium
foil diinkubasi 37°C selama 30 menit ditambah 1ml DNS dikocok dengan
vortex kemudian dipanaskan pada air mendidih selama 15 menit hingga
larutan berwarna merah kecoklatan, ditambah, aquades sampai volume 10

8
 ml dan dihomogenkan diukur absorbansinya dengan spektofotometer
dengan λ 540nm sehingga dapat dilihat aktivitas enzim.
3.3.4. Pembuatan kurva standart
Dibuat larutan standart glukosa konsentrasi 0, 200, 400, 600, 800, 1000
ppm, diambil 1 ml pada masing-masing dimasukkan tabung reaksi dan
ditambah DNS 1 ml dihomogenkan ditutup alumunium foil dipanaskan air
mendidih 15 menit sampai merah kecoklatan ditambah 1ml KNa tartarat 40%
didinginkan ditambah aquades hingga volume 10 ml dihomogenkan terakhir
diukur absorbansi dengan spektrofotometer.

9
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Data Hasil Pengamatan

Perlakuan Hasil
1. Skrining aktivitas amilase
Digoreskan isolat pada media NA Didapat bakteri pada media NA
Diinkubasi pada suhu 37°C waktu 24 Bakteri aktif
jam
Ditambah larutan iodin pada sekitar Didapat media berwarna biru
media
Diamati zona bening Terdapat zona bening
2. Pembuatan Kurva standart
Diambil 1ml glukosa konsentrasi 0, 200, 1ml glukosa dalam tabung
400, 600, 800, 1000
Ditambah 1ml DNS Didapat campuran kuning
Ditutup dengan alumunium foil Tabung tertutup
Dipanaskan ±15 menit Larutan berubah warna
Didinginkan Larutan dingin
Ditambah K-Na tartarat Tidak terjadi perubahan
Ditambah aquades 10 ml Larutan encer
Diukur absorbannya λ 540 nm Didapatkan data absorban
3. Uji akativitas amilasi metode DNS
Dimasukkan filtrat dalam tabung reaksi Didapat 1ml filtrat
Ditambah 1 pati terlarut pH 4,5,6 duplo Didapat filtrat pati pH 4,5,6
Duplo
Ditutup tabung dengan alumunium foil Tabung tertutup

10
 Inkubasi 37°C ±30 menit Tabung hangat
Ditambah 1ml DNS Didapat campuran kuning
Divortex Campuran homogen
Dipanaskan dalam air mendidih Larutan berwarna coklat
Didinginkan Larutan dingin
Ditambah 1ml KNa tartarat 40% Larutan tidak berubah
Ditambah aquades 10 ml Larutan encer
Dihomogenkan Larutan homogen
Diukur absorbannya λ 540 nm Didapat data absorban

4.2. Analisis Prosedur

Enzim merupakan suatu gugus polipeptida yang berfungsi sebagai

biokatalisator dengan cara sisi aktif menempel pada permukaan molekul zat-
zat yang bereaksi. Enzim bekerja secara spesifik bekerja hanya pada substrat
tertentu. Amilase adalah salah satu dari enzim termasuk dalam hidrolitik yang
daoat memutuskan ikatan glikosida pada amilum menjadi beberapa molekul
kecil seperti maltosa, glukosa, dan dekstrin.

Pada percobaan kali ini diawali dengan isolasi bakteri dengan

menggoreskan suspensi pati padat yang mengandung bakteri ke permukaan
medium, setelah itu diinkubasi pada suhu 37C adalah suhu optimum untuk
emnumbuhkan bakteri, setelah bakteri berhasil diisolasi dilakukan skrinning
aktivitas bakteri dengan larutan iodine dan hasilnya terbentuk zona bening
menunjukkan bahwa pati telah terdegradasi oleh bakteri, sedangkan bagian
berwana biru menunjukkan bagian tidak terdegradasi oleh amilase, aktivitas
amilase dapat diukur dengen diameter koloni bagian zona bening dengan zona
biru.

Uji aktivitas amilase secara kuantitatif dilakukan dengan metode DNS

dengan pati sebagai substrat, mula-mula membuat kurva standart dengan
membuat larutan glukosa berbagai konsentrasi yaitu 0, 200, 600, 800, dan 1000
masing-masing konsentrasi pada tabung di tambah reagen DNS untuk
mengukur gula tereduksi, ditutup dan dipanaskan sehingga reaksi DNS

11
 semakin cepat, ketika warna berubah ditambah KNa Tartrat untuk
mempertahankan larutan, didinginkan dan diukur pada spektrofotometer λ 540
nm pada masing-masing, dan hasilnya diplotkan hasilnya kurva standart,

Aktivitas amilase dilakukan dengan cara diuji dengan pati 1 ml dilarutkan

pada pH 4,5,6 diduplo kemudian diinkubasi pada suhu 37C, masing-masing
reagen ditambah DNS yang berfungsi untuk mereduksi gula, setelah itu ditutup
dan dipanaskan, saat warna sudah mulai berubah ditambah KNa Tartrat yang
berfungsi untuk untuk mempertahankan larutan, lalu didinginkan dan diukur
pada spektrofotometer λ 540 nm yang berfungsi untuk mengukur
absorbansinya dan mengetahui aktivitasnya.

4.3. Analisis Hasil

abs
1

y = 0.0009x - 0.055
0.8 R² = 0.9846

0.6
ABSORBANSI

0.4

0.2

0
0 200 400 600 800 1000 1200
-0.2
PPM

Kurva standar DNS didapati hasil untuk tiap-tiap konsentrasi adalah 200 ppm:
0.0912, 400 ppm: 0.265, 600 ppm: 0.4323, 800 ppm: 0.6253, 1000 ppm: 0,8621,
dengan hasil R2 mendekati 1.

12
 Abs
0.012

0.01 71.77777778,
0.0096
0.008 69.72222222,
69.27777778,
Absorbansi

0.00775
0.00735
0.006

0.004

0.002

0
69 69.5 70 70.5 71 71.5 72
ppm

Hasil dari absorbansi pH 4,5,6 duplo pada tabel terlihat yang diambil dari rata rata
dari keduanya, pada pH 4: 0.00735 dengan konsentrasi 69.277ppm, pH 5: 0.00775
dengan konsentrasi 69.722ppm, pH 6: 0,0096 dengan konsentrasi 71,77ppm

13
 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Pada percobaan uji aktivitas enzim amilase dapat disimpulkan bahwa Aktivitas
amilase dapat diketahui secara kualitatif maupun kuantitatif, kualitatif dapat
dilakukan dengan uji Iodine dengan menghitung besar diameter zona bening dan
zona biru sedangkan secara kuantitatif dapat diketaui dengan metoe DNS dimana
DNS akan menghidrolisis subtrat menjadi monosakarida dan dihitung nilai
absorban hasilnya sebagai berikut yaitu pH 4: 0.00735 konsentrasi 69.277ppm, pH
5: 0.00775 konsentrasi 69.722ppm, dan pH 6: 0,0096 konsentrasi 71,77ppm.

14
 DAFTAR PUSTAKA

Fessenden. 1997 Dasar Dasar Kimia Organik ; Binarupa

Hasanah, Nur. 2014. Seleksi dan Optimasi Pemurnian Enzim Selulase Mikroba dari
Limbah media Tanam Jamur Merang. Skripsi. Bogor. FMIPA IPB

Hasanah, Nur dan Iwan Saskiawan. 2015. Aktivitas Selulase Isolat Jamur dari
Limbah Media Tanam Jamur Merang. J Prosidium seminar masyarakat
Brodiv Indonesia No 5 P 110-1115.

Irawati, Rosyida. 2016. Karakterisasi Suhu, pH, dan konsentrasi substat enzim
selulase kasar yang diproduksi basilus circuluar. Skripsi. Malang F Saintek
Uin Malang.

Malon et al. 1993. Human Biology and Health USA Englewood Cliffs New Jersey.
Pr Tice Hall. P 256.

Mulyono. 2005. Kamus kimia. Bumi aksara.

Nangin, Debora dan Sutrisno, Aji. 2015. Enzim Amilase Pemecah Pati Mentah dari
Mikroba. Jurnal Pangan dan Agroindustri. vol 3. no 3. P 1032-1039.

Oxtoby, David W. 2004. Prinsip-prinsip Kimia Modern edisi 4. Jakarta. Erlangga.

Putri, Syarafina. 2016. Karaktersisasi Enzim Selulase yang Dihasilkan

Lactobacillus Platanium pada Variasi Suhu, pH dan Konsentrasi Substrat.
Skripsi .Malang. F saintek. Uin Malang

Susilawati, Ika dkk. 2015. Analisis Aktivitas Enzim Amilase dari Bakteri Tanah
dan Kawasan Universitas Jambi. Prosidium Semirata 2015. bidang MIPA.
Tanjung pura. Pontianak. 359=367

15
 LAMPIRAN PERHITUNA

Aktivitas Amilase DNS

Didapatkanlah Persamaan :

𝑦 = 0,0009𝑥 − 0,055

pH Abs 1 Abs 2 Abs

4 0,0094 0,0053 0,00735
5 0,0108 0,0047 0,00775
6 0,0107 0,0085 0,0096

Ppm pH 4 (𝑦 = 0,00735) Ppm pH 5 (𝑦 = 0,00775)

𝑦 = 0,0009𝑥 − 0,055 𝑦 = 0,0009𝑥 − 0,055
0,00735 = 0,0009𝑥 − 0,055 0,00775 = 0,0009𝑥 − 0,055
𝑥 = 69,27778 𝑝𝑝𝑚 𝑥 = 69,72222 𝑝𝑝𝑚

Ppm pH 6 (𝑦 = 0,0096)
𝑦 = 0,0009𝑥 − 0,055
0,0096 = 0,0009𝑥 − 0,055
𝑥 = 71,77778 𝑝𝑝𝑚

16