I.

Judul Praktikum : Enzim

II. Tujuan Praktikum

1. Menentukan kadar protein secara biuret
2. Menentukan jumlah produk yang terbentuk dari aktivitas invertase
III. Tinjauan Pustaka

3.1 Enzim
Enzim adalah sekelompok protein yang bersifat katalis dan mengatur
perubahan senyawa kimia dalam sistem biologis. Enzim dihasilkan dari
organ-organ hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Secara katalitik,
enzim mempunyai fungsi dalam berbagai reaksi seperti hidrolisis,
oksidasi, reduksi, isomerasi, adisi, transfer gugus, dan kadang-kadang
pemutusan rantai karbon. Salah satu aktivitas enzim adalah memerlukan
kofaktor, yaitu gugus non protein dari enzim yang menentukan aktivitas
katalitiknya (Sulistiyowati, dkk., 2016).
Enzim berfungsi sebagai katalisator, yaitu senyawa yang
meningkatkan kecepatan reaksi kimia. Enzim mempercepat reaksi 108
sampai 1011 kali lebih cepat dibandingkan ketika reaksi tersebut tidak
menggunakan katalis. Enzim juga dapat menurunkan atau memeprkecil
energi aktivasi suatu reaksi kimia. Reaksi tersebut dapat membuat enzim
mengubah senyawa selanjutnya yang disebut substrat menjadi senyawa
yang baru yaitu produk, namun enzim tidak ikut berubah dalam reaksi
tersebut (Supriyatna, dkk., 2015).

3.2 Enzim Invertase

Sistem tatanama untuk invertase adalah β-fructofuranosidase

menunjukkan bahwa reaksi yang dikatalisasi oleh enzim ini adalah reaksi
hidrolisis. Enzim invertase dapat diisolasi oleh mahluk hidup yang
termasuk dalam three domain of life. Enzim invertase dapat diisolasi dari
mikroorganisme (bakteri, khamir, dan kapang) dan organisme tingkat
tinggi seperti tanaman. Invertase memiliki aktivitas yang relatif tinggi
 pada kisaran pH yang luas antara 3,5 sampai 5,5, dengan aktivitas
optimum pada pH 4,5. Aktivitas maksimum dicapai pada suhu 550C
(Sanjaya, dkk., 2020).

Enzim invertase dapat memproduksi gula invert secara enzimatik.

Enzim invertase diperoleh dari ragi roti yang mengandung khamir
Saccharomyces ceriviseae. Kemampuan enzim invertase dalam hidrolisis
sukrosa dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, yaitui pH, waktu hidrolisis,
temperatur, dan konsentrasi substrat. Invertase dapat dipertahankan
dengan metode imobilisasi karena dapat digunakan berulang karena enzim
belum mengalami kerusakan struktur selama penggunaan (Yadnyani,
2019).

3.3 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Enzim

Aktivitas enzim invertase ditentukan dari kemampuannya

mendegradasi gula, seperti sukrosa, rafinosa, dan fruktosa. Laju degradasi
dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain suhu, pH, lama pemanasan,
konsentrasi substrat dan konsentrasi enzim. Laju degradasi sukrosa dapat
diperlambat bahkan dihambat dengan penambahan inhibitor. Peningkatan
suhu pada reaksi enzim menyebabkan peningkatan laju reaksi dan di sisi
lain sehingga menyebabkan inaaktivasi enzim. Suhu maksimum aktivitas
invertase adalah 600C, peningkatan suhu lebih lanjut menyebabkan
penurunan laju degradasi sukrosa (Sanjaya, dkk., 2020).

Enzim relatif stabil pada kisaran pH asam sampai pH netral.

Perubahan pada laju reaksi enzim oleh pH mungkin dapat disebabkan oleh
tiga faktor, antara lain: protonasi sisi aktif rantai asam amino pada
kompleks enzim-substrat (ES) berubah, menghasilkan perubahan
kemampuan ES dalam menghasilkan produk, perubahan muatan ion pada
molekul substrat atau sisi aktif enzim yang dapat mengubah
kecenderungan dari dua molekul tersebut untuk membentuk kompleks ES,
dan perubahan pH dari netral dapat melemahkan stabilitas protein,
 mempercepat denaturasi enzim yang bersifat irreversible (Sanjaya, dkk.,
2020).

3.4 Gula Invert

Gula invert adalah gula yang dihasil dari proses hidrolisis sukrosa
menjadi glukosa dan fruktosa dengan bentuk berupa larutan kental.
Memproduksi gula invert dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu
hidrolisis sukrosa menggunakan asam secara kimiawi dan menggunakan
enzim invertase secara enzimatik (Yadnyani, 2019). Gula invert digunakan
untuk memperlambat kristalisasi gula pada konsentrasi larutan yang tinggi.
Gula invert digunakan dalam krim non kristal, selai, madu buatan dan
industri permen serta industri yang hanya memproduksi larutan gula
(Suwarno, dkk., 2015).

Sifat lain yang menguntungkan dari gula invert adalah dapat

berfungsi sebagai humectant (mempertahankan kadar air), penstabil
emulsi, pengawet dan memiliki rasa yang lebih halus sehingga tidak
menimbulkan iritasi. Sedangkan fruktosa sendiri sangat ideal dikonsumsi
oleh penderita diabetes, karena tidak berdampak terhadap proses sekresi
insulin. Gula invert dapat dijadikan alternatif bahan pemanis selain gula
pasir (Suwarno, dkk., 2015).

IV. Metodologi
4.1 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah blender,
erlenmeyer, gelas beaker, gelas ukur, kapas, pipet tetes, rak tabung reaksi,
spektrofotometer, tabung reaksi, timbangan, water-bath.
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah buffer
asetat pH 4,5, fruktosa, glukosa, larutan BSA, natrium bikarbonat
(NaHCO3), ragi roti dan sukrosa.
4.2 Prosedur Kerja
4.2.1 Preparasi Enzim Invertase
 Ragi roti 50 gram diblender dalam 100ml NaHCO3 0,1 M
selama 2-5 menit. Bubur ragi dituang dalam Erlenmeyer dan mulut
Erlenmeyer ditutup dengan kapas. Bubur ragi diinkubasi pada suhu
40oC selama 24 jam dan sentrifase pada kecepatan 12.000 selama 15
menit. Supernatant didekantasi kedalam gelas ukur, volume dicatat
dan disimpan dalam lemari es. Larutan enzim encer (larutan enzim
dibuat 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000), disimpan untuk percobaan
selanjutnya, Sedangkan larutan enzim invertase yang masih ada
tidak dibuang untuk percobaan selanjutnya.
4.2.2 Penentuan kadar protein secara Biuret
Larutan protein standar dipipet kedalam tabung reaksi 1 ml
larutan protein yang mengandung 2; 4; 6; 8; 10 mg/ml dan ditambah
4 ml reagen Biuret. Larutan dikocok dan didiamkan selama 10 menit
pada suhu 37oC. Serapan dibaca pada panjang gelombang 540nm
dan larutan blanko digunakan 1 ml aquades dan 4 ml reagen biuret.
Sampel adalah larutan enzim sebelum pengenceran dan enzim yang
telah diencerkan masing-masing sebanyak 1 ml (1:10; 1:100;
1:1000; 1:10.000).
4.2.3 Penentuan jumlah produk yang terbentuk dari aktivitas intervase
Larutan enzim (larutan enzim tanpa pengenceran dan enzim
dengan pengenceran 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000), dimasukan
kedalam tabung reaksi masing-masing 1 ml, digunakan 1 ml aquades
sebagai blanko. Masing-masing tabung baik sampel air blanko
ditambahkan 1 ml buffer pH 4,5.
Larutan ditambahkan pada masing-masing (sampel dan
blanko) 1 ml sukrosa 0,25 M, larutan diaduk dan disimpan kembali
pada suhu kamar selama 15 menit. Reaksi dihentikan dengan
ditambahkan 1 ml reagen nelson pada masing-masing tabung.
Semua tabung ditutup dengan kelereng dan semua tabung
dimasukkan kedalam penangas air mendidih selama 15 menit.
Tabung didinginkan dan ditambahkan 1 ml reagen Arsenomolibdat
 (tidak dipipet dengan mulut), vortex dan didiamkan selama 5 menit.
Tabung ditambahkan air hingga volume akhir 10 ml. Absorbansi
dibaca pada Panjang gelombang 510nm.
4.2.4 Standar gula invert
Standar gula invert dibuat sebagai berikut : kedalam tabung-
tabung reaksi dimasukkan 0,1 ; 0,3 : 0,5 : 0,7 dan 1 ml larutan 0,0025
gula invert (campuran 0,0025 M glukosa dan 0,0025 fruktosa).
Volume tabung dibuat menjadi 1 ml buffer asetat. Selanjutnya 1 ml
reagen nelson di tambahkan pada masing masing tabung. Semua
tabung ditutup dengan kelereng dan dimasukkan kedalam penangas
air mendidih selama 15 menit. Tabung didinginkan dan ditambahkan
1 ml reagen arsenomolibdat, vortex, dan didiamkan selama 5 menit.
Tabung ditambahkan air hingga volume akhir 10 ml. Absorbansi
dibaca pada panjang gelombang 510nm.

V. Pembahasan

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein secara biuret

dan menentukan jumlah produk yang terbentuk dari aktivitas invertase. Gula
invert adalah hasil dari proses hidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa
dengan bentuk berupa larutan kental. Memproduksi gula invert terdapat dua
metoder, yaitu hidrolisis sukrosa menggunakan asam secara kimiawi dan
menggunakan enzim invertase secara enzimatik. Enzim invertase diperoleh
dari ragi roti yang mengandung khamir Saccharomyces ceriviseae. Enzim
invertase dalam hidrolisis sukrosa dipengaruhi oleh kondisi lingkungan,
yaitui pH, waktu hidrolisis, temperatur, dan konsentrasi substrat (Yadnyani,
dkk., 2019).

Metode biuret merupakan salah satu metode penentuan kadar protein

dengan menggunakan larutan Biuret pada suasana basa bereaksi dengan
ikatan peptida dari protein yang mengakibatkan terjadinya perubahan warna
dari larutan Biuret. Perubahan warna diukur dari intensitas serapan panjang
gelombangnya menggunakan spektrofotometri UV-Vis (Salim dan Rahayu,
2017). Keuntungan dari metode biuret adalah bahan yang digunakan relatif
murah tetapi kelemahannya adalah sensitivitas terhadap bahan yang
diidentifikasi rendah sehingga diperlukan bahan dalam jumlah yang tidak
sedikit (Fendri, dkk., 2019).

5.1 Preparasi Enzim Invertase

Ragi roti 50 gram diblender dalam 100ml NaHCO3 0,1 M selama
2-5 menit. Ragi roti menghasilkan enzim yang dapat mengubah substrak
menjadi bahan lain dengan menggunakan energi. Bahan aktif pada ragi
roti adalah khamir Saccharomyces cereviseae yang dapat memfermentasi
gula menjadi etanol. Khamir yang digunakan dalam fermentasi adalah
Saccharomyces sp. Khamir ini akan mengubah gula menjadi alkohol dan
CO2 (Hartono dan Pagarra, 2011). Natrium bikarbonat merupakan
sumber karbonat terbesar dengan kelarutan yang sangat baik di dalam air,
memiliki sifat higroskopis serta tersedia secara komersial mulai dari
bubuk sampai granular. Natrium bikarbonat dapat menguapkan air dari
bahan dan juga dapat menstabilkan asam (Silalahi, dkk., 2019). Bubur
ragi dituang dalam Erlenmeyer dan mulut Erlenmeyer ditutup dengan
kapas. Kapas berfungsi agar mengurangi kontaminasi terhadap udara
agar erlenmeyer tetap steril. Bubur ragi diinkubasi pada suhu 40oC
selama 24 jam dan sentrifase pada kecepatan 12.000 selama 15 menit.
Ragi di inkubasi pada suhu 40oC yang merupakan suhu ruang dan selama
24 jam untuk memanfaatkan kemampuan mikroba untuk mengasilkan
metabolit primer dan metabolit sekunder (Sulistyarsi, dkk., 2016).
Sentrifase pada kecepatan 12.000 selama 15 menit berfungsi untuk
menghasilkan enzim invertase kasar (Yadnyani, dkk., 2019). Supernatant
didekantasi kedalam gelas ukur, volume dicatat dan disimpan dalam
lemari es. Dekantasi dilakukan untuk memisahkan hasil sentrifase.
Supernatant disimpan dalam lemari es agar menghambat pertumbuhuan
mikroorganisme. . Larutan enzim encer (larutan enzim dibuat 1:10,
1:100, 1:1000, 1:10.000), disimpan untuk percobaan selanjutnya,
 Sedangkan larutan enzim invertase yang masih ada tidak dibuang untuk
percobaan selanjutnya (Firdausa, dkk., 2017).

5.2 Penentuan kadar protein secara Biuret

Larutan protein standar dipipet kedalam tabung reaksi 1 ml larutan

protein yang mengandung 2; 4; 6; 8; 10 mg/ml dan ditambah 4 ml reagen
Biuret. Penentuan kadar protein ini menggunakan metode biuret
dilengkapi spektrofotometri UV-Vis dengan larutan standar protein yang
digunakan adalah larutan BSA (Bovine Serum Albumin). Bovine Serum
Albumin (BSA) merupakan salah satu protein yang mempunyai
kandungan protein yang banyak dalam plasma dengan konsentrasi
5g/500 ml dan juga mempunyai komposisi asam amino sebanyak 20
macam (Suryantha, dkk., 2019). Penambahan reagen biuret bertujuan
untuk membuat larutan menjadi berwarna akibat terbentuknya senyawa
kompleks antara Cu2+ pada reagen biuret dengan gugus amino pada
protein. Campuran larutan BSA dengan reagen biuret menghasilkan
warna ungu pekat (Fendri, dkk., 2019). Larutan dikocok dan didiamkan
selama 10 menit pada suhu 37oC. Pengocokan bertujuan agar larutan
homogen dan dipanaskan bertujuan untuk membentuk perubahan warna.
Serapan dibaca pada panjang gelombang 540nm dan larutan blanko
digunakan 1 ml aquades dan 4 ml reagen biuret. Larutan yang telah
dipanaskan berubah warna menjadi ungu pudar. Prinsip reaksi Biuret
adalah reaksi antara tembaga sulfat dalam alkali dengan senyawa yang
berisi dua atau lebih ikatan pepetida seperti protein yang memberikan
warna ungu biru yang khas (Machin, 2012). Pengukuran kadar protein
dapat dilakukan pada pengukuran serapan cahaya berwarna ungu dari
protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret dimana yang membentuk
warna kompleks ungu terbentuk karena adanya reaksi antara ion Cu2+
dari pereaksi biuret dalam suasana basa dengan polipeptida atau ikatan-
ikatan peptida yang menyusun protein (Fendri, dkk., 2019). Perubahan
warna yang teramati diukur intesitas serapan panjang gelombangnya
 menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Semakin tinggi intensitas
cahaya yang diserap oleh spektrofotometer UV-Vis maka semakin tinggi
pula kadar protein yang terdapat dalam zat tersebut (Salim dan Rahayu,
2017).

5. 3 Penentuan jumlah produk yang terbentuk dari aktivitas intervase

Larutan enzim (larutan enzim tanpa pengenceran dan enzim

dengan pengenceran 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000), dimasukan kedalam
tabung reaksi masing-masing 1 ml, digunakan 1 ml aquades sebagai
blanko. Masing-masing tabung baik sampel air blanko ditambahkan 1 ml
buffer pH 4,5. Penambahan buffer pH 4,5 karena enzim ini stabil pada
kisaran pH 4-5,5, suhu 500C (Indriani, dkk., 2015).

Larutan ditambahkan pada masing-masing (sampel dan blanko) 1

ml sukrosa 0,25 M, larutan diaduk dan disimpan kembali pada suhu
kamar selama 15 menit. Kebutuhan metabolisme mikroorganisme
membutuhkan nutrisi. Salah satu sumber nutrisi adalah sumber C.
Sukrosa salah satu sumber C, bertindak sebagai induser (Indriani, dkk.,
2015). Reaksi dihentikan dengan ditambahkan 1 ml reagen nelson pada
masing-masing tabung. Semua tabung ditutup dengan kelereng dan
semua tabung dimasukkan kedalam penangas air mendidih selama 15
menit. Tabung ditutup di didihkan untuk memperjelas warna yang
terjadi. Setelah 15 menit, tabung didinginkan dengan hasil berwarna biru.
Tabung didinginkan dan ditambahkan 1 ml reagen arsenomolibdat,
vortex, dan didiamkan selama 5 menit. Tabung ditambahkan air hingga
volume akhir 10 ml. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 510nm.
Semakin tinggi konsentrasi gula invert, maka warna biru semakin
dominan. Larutan tersebut larut dengan penambahan reagen
arsenomolibdat dan dikocok dengan vorteks, dibiarkan 5 menit. Warna
larutan yang diperoleh, yaitu semakin tinggi konsentrasi gula invert maka
warna larutan semakin biru pekat. Hasil campuran agar lebih encer dan
bisa diukur absorbansinya, larutan ditambahkan air dan dikocok lagi
 dengan vorteks. Pengukuran absorbansi dilakukan secara spektroskopi
pada panjang gelombang (λ) sebesar 510 nm (Ninggar, 2010).

5.4 Standar gula invert

Standar gula invert dibuat sebagai berikut : kedalam tabung-tabung

reaksi dimasukkan 0,1 ; 0,3 : 0,5 : 0,7 dan 1 ml larutan 0,0025 gula invert
(campuran 0,0025 M glukosa dan 0,0025 fruktosa). Volume tabung
dibuat menjadi 1 ml buffer asetat bertujuan untuk optimasi produksi enzim.
Selanjutnya 1 ml reagen nelson ditambahkan pada masing masing
tabung. Penambahan reagen nelson untuk pembacaan kadar glukosa.
Semua tabung ditutup dengan kelereng agar tidak terkontiminasi dan
dimasukkan kedalam penangas air mendidih selama 15 menit untuk
proses pensterilan. Tabung didinginkan dan ditambahkan 1 ml reagen
arsenomolibdat, vortex, dan didiamkan selama 5 menit. Proses ini
bertujuan untuk perubahan warna. Tabung ditambahkan air hingga
volume akhir 10 ml. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 510nm.
Warna larutan yang diperoleh, yaitu semakin tinggi konsentrasi gula
invert maka warna larutan semakin biru pekat. Hasil campuran agar lebih
encer dan bisa diukur absorbansinya, larutan ditambahkan air dan
dikocok lagi dengan vorteks (Ninggar, 2010).

VI. Simpulan
1. Kadar protein antara biuret pada larutan BSA dengan reagen biuret
diperoleh warna ungu pekat dan setelah dipanaskan larutan berubah
menjadi berwarna ungu pudar. Hal ini dikarenakan semakin tinggi
intensitas cahaya yang diserap oleh spektrofotometer UV-Vis maka
semakin tinggi pula kadar protein yang terdapat dalam zat tersebut.
2. Jumlah produk yang terbentuk dari aktivitas invertase antara larutan
dengan reagen nelson diperoleh warna biru, sedangkan larutan dengan
 reagen arsenomolibdat menjadi berwarna biru pekat. Hal ini dikarenakan
semakin tinggi konsentrasi gula invert, maka warna biru semakin
dominan.

VII. Daftar Pustaka

Fendri, S, T, J., Ifmaily., dan Syarti, S, R., 2019, Analisis Protein Pada
Rinuak, Pensi dan Langkitang dengan Spektrofotometri UV-Vis,
Jurnal Katalisator, Vol. 4, No. 2, Hal. 119-124.

Firdausa, F, K., Santoso, A, B., dan Handayani, W., 2017, Ekstraksi Xilan
dari Limbah Ampas Singkong dan Pemanfaatannya sebagai Substrat
Endo-B-1,4-D-Xilanase, Berkala Sainstek, Vol. 1, Hal. 50-54.

Hartono dan Pagarra, H., 2011, Analisis Kadar Etanol Hasil Fermentasi Ragi
Roti Pada Tepung umbi Gadung (Dioscorea hispida Dennst) terhadap
kadar etanol, Bionature, Vol. 12, No. 2, Hal. 82-86.

Indriani, D, O., Syamsudin, L, N, I., dan Sriherfyna, F, H., 2015, Invertase

dari Aspergillus niger dengan Metode Solid State Fermentation dan
Aplikasi di Industri : Kajian Pustaka, Jurnal Pangan dan Agroindustri,
Vol. 3, No. 4, Hal. 1405-1411.

Machin, A., 2012, Potensi Hidrolisat Tempe sebagai Penyedap Rasa melalui
Pemanfaatan Ekstrak Buah Nanas, Biosantifika, Vol. 4, No. 2.

Ninggar, A, W., 2010, Isolasi, Purifikasi, Kinetika, Dan Karakterisasi Enzim

Invertase Saccharomyces cerevisiae, Pengantar Penelitian Biokimia
FMIPA ITB

Salim, R., dan Rahayu, I, S., 2017, Analisis Kadar Protein Tempe Kemasan
Plastik dan Daun Pisang, Jurnal Akademi Farmasi Prayoga, Vol. 2, No.
1.

Sanjaya, W, T., Giyanto, Widyastuti, R., dan Santosa, D, A.,

Keanekaragaman Enzim Invertase, Pengembangan Strain Unggul dan
 Teknologi Produksinya, Jurnal Bioteknologi dan Biosains Indonesia,
Vol. 7, No. 1.

Silalahi, N, A, P., Ginting, S., dan Rusmarilin, H., 2019, Pengaruh

Perbandingan Nira Tebu dengan Sari Jeruk Manis dan Penambahan
Natrium Bikarbonat (NaHCO3) terhadap Mutu Minuman Nira Tebu
Berkarbonisasi, Jurnal Rekayasa Pangan dan Pertanian, Vol. 7, No. 2.

Sulistyarsi, A., Pujiati., dan Ardhi, M, W., 2016, Pengaruh Konsentrasi dan
Lama Inkubasi terhadap Kadar Protein Crude Enzim Selulase dari
Kapang Aspergillus niger, Proceeding Biology Education Conference,
Vol. 13, No. 1.

Sulistyowati, E., Salirawati, D., dan Amanati., 2016, Karakterisasi Beberapa

Ion Logam terhadap Aktivitas Enzim Tripsin, Jurnal Penelitian
Saintek, Vol. 21, No. 2.

Supriyatna, A., Amalia, D., Jauhari, A, A., dan Holydaziah, D., 2015,
Aktivitas Enzim Amilase, Lipase, dan Protease dari Larva, Jurnal Istek,
Vol. 9, No. 2.

Suryanatha, I, M, A., Bebas, W., dan Laksmi, D, W, D, I., 2019, Penambahan

Bovine Serum Albumin pada Pengencer Beltsville Thawing Solution
terhadap Motilitas dan Daya Hidup Spermatozoa Babi Landrace,
Buletin Veteriner Udayana, Vol. 11, No. 2, Hal. 176-181.

Suwarno., Ratnani, R, D., dan Hartati, I., 2015, Proses Pembuatan Gula Invert
dari Sukrosa dengan Katalis Asam Sitrat, Asam Tartrat dan Asam
Klorida, Momentum, Vol. 11, No. 2, Hal. 99-103.

Yadnyani, I, A, M, D., Bahri, S., dam Sumarni, N, K., 2019, Penggunaan

Ekstrak Enzim Invertase Amobil dari Ragi Roti dalam Pembuatan Sirup
Gula Invert dari Nira Kelapa, Jurnal Riset Kimia, Vol. 5, No. 1, Hal.
24-29.
VIII. Lampiran
Lampiran Jurnal