Anda di halaman 1dari 11

1

Isolasi, Purifikasi, Kinetika, Dan Karakterisasi Enzim Invertase


Saccharomyces cerevisiae

Anggun Widya Ninggar (G84070034)1, Amelinda2, dan Waras Nurcholis3


Mahasiswa Praktikum1, Asisten Praktikum2, dan Dosen Praktikum3
Pengantar Penelitian Biokimia
Departemen Biokimia, FMIPA, IPB
2010

ABSTRAK
Invertase merupakan katalis pada hidrolisis sukrosa menghasilkan glukosa dan fruktosa (gula invert).
Praktikum ini bertujuan mengisolasi dan mempurifikasi enzim invertase dari ragi, menentukan aktivitas
dan kuantitas protein enzim invertase menggunakan assay Nelson dan metode Lowry, menentukan nilai
Km dan Vmaks dari enzim invretase melalui study kinetika, dan mengkarakterisasi enzim invertase
berdasarkan bobot molekul, pengaruh suhu, dan pengaruh pH. Assay Nelson berprinsip pada
pengukuran jumlah gula pereduksi. Pada metode ini aktivitas enzim invertase ditunjukkan oleh
bertambahnya produk reaksi (glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat (fruktosa/ satuan
waktu). Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen arsenomolibdat menghasilkan
warna biru. Hasil optimum karakterisasi enzim invertase amobil diperoleh pada kadar Na-alginat 5 gr,
konsentrasi substrat (sukrosa) 0,5 M, pH 4,5, dan suhu 30 oC. Pengukuran aktifitas enzim invertase
dilakukan dengan metode spektrofotometri menggunakan reagen Nelson. Dari hasil pengukuran
diperoleh aktifitas enzim invertase terbesar pada fraksi I sebesar 1.2256 unit/menit, kadar protein
terbesar pada fraksi II sebesar 0,0255 mg/mL, fold enzim dan yield enzim berturut-turut adalah 931,49%
dan 90,14%. Sedangkan Nilai konstanta Michaelis, Vmaks = -1,0940 µmol/mL. menit dan Km = -1,8818
mM.

PENDAHULUAN dan kerangka karbon, sukrosa juga berperan dalam


Indonesia merupakan negara yang memiliki pengaturan ekspresi gen lainnya (Koch, 1996;
sumber daya alam yang melimpah, baik hayati atau Ohto et al., 2001), partisi karbon asimilate (Lunn
non-hayati. Tetapi masih banyak sumber daya & Hatch 1997; Grof et al. 1998) serta
alam yang belum dimanfaatkan secara maksimal pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Fung et
oleh masyarakat, padahal sumber daya alam al, 2003).
tersebut sangat berpotensi untuk dimanfaatkan Enzim invertase banyak ditemukan pada
lebih optimal lagi. Mikroorganisme merupakan ragi roti yang mengandung khamir Saccharomyces
salah satu sumber daya alam yang bisa dirasakan ceriviseae. Invertase diproduksi oleh bakteri,
manfaatnya dalam kehidupan. Beberapa macam fungi, tumbuhan tingkat tinggi, dan beberapa sel
mikroorganisme dapat menghasilkan enzim adalah hewan (Lee Huang et al. 2000). Tetapi banyak
khamir, fungi, dan bakteri. Diantaranya yang penelitian dilakukan pada produksi invertase yang
paling lazim adalah khamir Saccharomyces dihasilkan oleh khamir Saccharomyces cereviceae.
cerevisiae yang merupakan mikroorganisme paling Khamir ini banyak terkandung pada ragi roti, dan
komersial saat ini. Penggunaan S. cerevisiae secara komersil banyak dijual dipasaran. Yeast
sebagai pabrik etanol telah banyak dikembangkan merupakan mikroorganisme uniseluler berbentuk
di beberapa negara, seperti Brasil, Afrika Selatan, ellips, bulat atau silindris, yang ukurannya 5-10
dan Amerika Serikat. Khamir lebih banyak kali lebih besar dari bakteri. Ragi ini banyak
digunakan untuk memproduksi alkohol secara digunakan dalam pembuatan bir dan roti serta
komersial dibandingkan dengan bakteri (Narita dikenal pula sebagai suplemen makanan karena
2005). kaya akan vitamin.
Invertase, dikenal sebagai β- Enzim invertase banyak digunakan dalam
fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26) industri fermentasi karena berfungsi sebagai
merupakan sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa katalis dalam hidrolisis sukrosa menjadi glukosa
yang menghasilkan fruktosa dan glukosa (gula dan fruktosa (gula invert/gula pereduksi).
invert). Sukrosa merupakan produksi akhir Kemampuan enzim dalam mengkatalisis reaksi
asimilasi karbon (C) pada proses fotosintesis yang kimia dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang
terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan bentuk meliputi pH, suhu, waktu inkubasi, dan konsentrasi
karbohidrat yang mudah ditransporta-sikan ke substrat. Enzim invertase yang dihasilkan oleh
jaringan simpan atau sink tissues (Cheng et al. Saccharomycees ceriviceae mempunyai aktivitas
1996). Selain berfungsi dalam penyediaan energi
2

paling tinggi pada pH 4,5 dan temperatur 30ºC tersebut merupakan metode terbaik untuk
(Bergamasco et al. 2000). mengurangi pengeluaran biaya dalam proses
Setiap enzim mempunyai nilai tetapan enzimatik secara kontinu khususnya dalam industri
Michaelis-Menten tertentu, dimana nilai K m dapat makanan dan minuman (Bucke 1987).
digunakan untuk memperkirakan jumlah substrat
yang diperlukan agar reaksi enzimatis berjalan METODE PERCOBAAN
efisien. Dengan mengetahui nilai Km dan Vm suatu
enzim, maka dapat dilakukan optimalisasi Waktu dan Tempat
penggunaan enzim tersebut sebagai biokatalisator Praktikum dilakukan selama 6 minggu yaitu
reaksi pemecahan substrat menjadi produk. Laju 2 Maret - 27 April 2010. Tempat pelaksanaannya
reaksi meningkat saat suhu mencapai nilai di Laboratorium Pendidikan Departemen
optimum dan berkurang saat suhunya maksimum. Biokimia, FMIPA IPB.
Sedangkan aktivitas enzim akan meningkat dengan
meningkatnya kadar substrat (Lehinger 1982). Alat dan Bahan
Pemanfaatan enzim secara komersial terus Alat-alat yang digunakan dalam praktikum
dipelajari dan diterapkan yaitu pemanfaatan enzim ini antara lain mortar, sentrifus, refrigerator
untuk proses enzimatik pada industri makanan, Sorvall, rotor SS-34, pipet pasteur, bulb, tabung
minuman, farmasi, dan biokimia. Salah satu sentrifus 50 mL, inkubator, gelas ukur, gelas piala
contoh pemanfaatan tersebut adalah pematangan 100 dan 600 mL magnetic stirer, tabung reaksi
buah-buahan hijau yang dipanen, pelayuan daging, bertutup, waterbath, vortex, spektrofotometer
pengawetan keju, pencegahan kekeruhan bir, dan UV/VIS, stopwatch, dan mikropipet, pipet kaca,
pembentukan tekstur gula. Sedangkan pipet stirer, magnetic stirer, seperangkat peralatan
pemanfaatan enzim invertase banyak dilakukan SDS-PAGE.
dalam industri makanan dan minuman khususnya Bahan-bahan yang digunakan yaitu ragi
pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula, (Saccharomyces cerevisiae), pasir/ glassbead,
dan produksi asam laktat dari fermentasi sirup tebu toluen, akuades, asam asetat1N, parafilm,
(Acosta et al. 2000). amonium sulfat, 4mM glukosa, 4 mM fruktosa,
Invertase juga digunakan untuk Reagen arsenomolibdat, bufer asetat 0.2 M pH 4.5,
memproduksi etanol dari sukrosa sebagai sumber bufer tris-HCl 0.05 M pH 7.3, reagen A (2%
karbon (Lee Huang 2000). Adanya isu sosial dan Na2CO3 dalam NaOH 0.1 N), reagen B (2.7%
fakta akan terbatasnya sumber bahan bakar fosil sodium potasium tartrat), reagen C (1% CuSO4
telah menstimulasi upaya penggunaan dan dalam H2O), reagen D (reagen folin Cioucalteou
pengembangan bahan bakar alternatif yang yang telah diencerkan dengan air sampai 1 N
renewable dan ramah lingkungan. Produksi etanol dalam asam, harus dibuat fres), fraksi enzim
melalui fermentasi mikroba dianggap sebagai invertase I, II, III, sukrosa 0.5M, H2O, reagen
metode alternatif sumber energi bahan bakar fosil Folin Wu, larutan monomer, 4x running gel bufer
dikarenakan keunggulannya, yaitu rendahnya (1.5 M Tris-Cl pH 8.8), 4x stacking gel bufer (0.5
biaya produksi, persentase rendemen yang tinggi, M Tris-Cl pH 6.8), 10% SDS, 10% amonium
prosesnya relatif lebih cepat, penanganannya persulfat, 2x treatment bufer (0.125M Tris-Cl, 4%
sederhana, dan produk samping yang relatif lebih SDS, 20% v/v gliserol, 0.2 M DDT, 0.02%
sedikit serta aman bagi lingkungan (Narita 2005). bromfenol blue, pH 6.8), tank bufer (0.025M Tris,
Secara umum enzim larut dalam air, 0.192M glisin, 0.1% SDS, pH 8.3), water saturated
sehingga banyak enzim tidak ekonomis untuk n-butanol, TEMED, standar BM protein campuran
digunakan pada pengoperasian tipe batch dalam (marker), larutan fikasasi (25% isopropanol, 10%
skala besar di industri, karena hanya dapat asam asetat) dan larutan pewarna commassie blue
digunakan satu kali proses dengan biaya yang (0.06 commassie blue G-250, 10% asam asetat).
cukup mahal. Tetapi dalam tahun-tahun
belakangan ini berbagai teknik telah ditemukan Prosedur Percobaan
untuk memperbaiki kerja enzim, yaitu dengan cara Isolasi Invertase Ragi
mengikatkan enzim pada bahan-bahan yang tidak Ekstraksi invertase ragi. Ragi ditimbang
larut dalam air, dimana bahanbahan tersebut dapat 10 gram dan sejumlah glass bead (2-3 gram)
dipisahkan dari produk dengan mudah. Hal itu dimasukkan ke dalam mortar. Setelah itu
memungkinkan penggunaan kembali bahan-bahan ditambahkan 10 mL toluen ke dalam mortar
tak larut yang mengandung enzim tersebut. Teknik tersebut, gerus sedikit demi sedikit hingga
ini disebut dengan amobilisasi enzim. Teknik membentuk pasta yang halus, lalu ditambahkan 20
amobilisasi pada enzim merupakan suatu teknik mL akuadessecara bertahap selama 30 menit,
yang dapat meningkatkan kemampuan hidup dilanjutkan dengan penggerusan setiap
enzim sehingga dapat digunakan kembali. Teknik penambahan. Seluruh isi mortar dipindahkan ke
3

dalam tabung sentrifus 50 mL laulu sentrifugasi 20 menit, tabung didinginkan, ditambahkan reagen
selama 15 menit, 12000 rpm. Setelah itu, lapisan arsenomolibdat 1 mL, dikocok dengan vorteks,
air dipindahkan dan ekstrak protein dikumpulakan, lalu biarkan selama 5 menit. Setelah 5 menit,
dicatat volumenya. Fraksi satu didapat dari aliquot tambahkan semua tabung dengan H2O 7 mL,
sebagai sampel dari ekstrak kasar, lalu diukur dikocok lagi dengan vorteks, dan dibaca
aktivitas dan kadar proteinnya. serapannya pada panjang gelombang 510 nm.
Pemanasan ekstrak invertase ragi. Setelah itu, ditentukan aktivitas spesifiknya.
Ekstrak diinkubasi pada suhu 50oC selama 30
menit lalu ekstrak didinginkan, disentrifugasi 15 Penentuan Kadar Protein dengan Metode
menit, 15000rpm. Volume supernatan diukur, lalu Lowry
diambil 2 mL aliquot untuk uji aktivitas dan kadar Pembuatan kurva standard. Sepuluh
protein ekstrak kasar pemanasan. tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi
Fraksinasi ekstrak invertase ragi. standard BSA pada tabung 2 sampai 10 berturut-
Fraksinasi pengendapan dibuat dengan amonium turut adalah 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35,
sulfat 20, 40, 60, dan 80% dengan menambahkan 0.40, dan 0.45 mL; H2O dari tabung 1 sampai 10
garam amonium sulfat selama satu jam. Lalu berturut-turut adalah 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30,
disentrifugasi selama 30 menit, 30000 rpm. 0.25, 0.20, 0.15, 0.10, 0.05 mL; reagen ABC pada
Supernatan yang didapat ditambahakan amonium semua tabung sebanyak 5 mL. Setelah itu, semua
sulfat lagi untuk fraksi pengendapan berikutnya. tabung dikocok dengan vorteks, diinkubasi 10
Hasilnya disimpan dalam suhu -20oC. Setelah itu, menit pada suhu ruang. Penambahan reagen harus
endapan dilarutkan dengan buffer tris-HCl dengan diatur dengan baik. Pada saat sepuluh menit
pH 7.3 lalu diukur volume total masing-masing terakhir ditambahkan 0.5 mL reagen D ke tabung
fraksi, diambil 1-2 mL untuk uji kadar aktivitas. pertama dan seterusnya. Kemudian dicampur
dengan vorteks, diinkubasi selama 30 menit pada
Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Assay suhu ruang lalu dibaca serapannya pada panjang
Nelson’s gelombang 700 nm.
Pembutan kurva standar. Sepuluh tabung Pengukuran kadar protein enzim
disiapkan lalu diisi dengan komposisi glukosa 4 invertase. Sampel fraksi 1 dan 2 diencerkan
mM pada tabung dua sampai delapan berturut-turut dengan air dalam perbandingan 1:4 dengan
adalah 0.02, 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.3 mL; komposisi assay tabung 1 sebagai blanko berisi 0.5
fruktosa 4 mM hanya pada tabung sembilan yaitu mL H2O; Tabung 2, 3, dan 4 berisi fraksi 1 dengan
0.2 mL; sukrosa 4 mM pada tabung sepuluh yaitu jumlah 0.05, 0.20, 0.5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0
0.2 mL; dan H2O pada tabung satu sampai sepuluh mL; tabung 5, 6, dan 7 berisi fraksi 2 dengan
berturut-turut adalah 1, 0.98, 0.95, 0.90, 0.85, 0.80, jumlah 0.05, 0.20, 0.5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0
0.75, 0.70, 0.80, 0.80 mL. Setelah itu, masing- mL. Selanjutnya prosedur mengikuti metode
masing tabung ditambahkan 1 mL reagen Lowry seperti pembuatan kurva standard protein.
Nelson’s, ditutup dengan alumunium foil lalu Perlakuan untuk fraksi 3 adalah fraksi 3
didihkan selama 20 menit. Setelah 20 menit, disuspensikan pada buffer tris. Preparasi Buffer
tabung didinginkan dan ditambahkan 1 mL reagen tris dan Fraksi 3 adalah dengan pengenceran air
arsenomolibdat, dikocok dengan vorteks, dibiarkan 1:1. Enam buah tabung disiapkan, tabung 1, 2, dan
5 menit, lalu ditambahkan 7 mL H 2O, dikocok lagi 3 sebagai blanko berisi buffer tris 0.05 M berturut-
dengan vorteks. Terakhir, baca serapannya pada turut adalah 0.05, 0.2, 0,5 mL dan H 2O 0.45, 0.3, 0
panjang gelombang 510 nm dan dibuat kurva mL, sedangkan tabung 4, 5, dan 6 adalah sampel
standard. yang berisi fraksi 3 berturut-turut adalah 0.05, 0.2,
Uji aktivitas enzim invertase. Sembilan 0,5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0 mL. Selanjutnya
tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi prosedur mengikuti metode Lowry seperti
buffer asetat 0.2 M pH 4.5 pada tabung 1 sampai 7 pembuatan kurva standard protein.
adalah 0.2 mL; H2O dari tabung 1 sampai 9
berturut-turut adalah 0.6, 0.55, 0.10, 0.55, 0.10, Study Kinetika Enzim Invertase.
0.55, 0.10, 1.0, 0.8 mL; Fraksi 1 pada tabung 2 dan Pengaruh konsentrasi substrat pada
3 adalah 0.05 dan 0.50 mL; fraksi 2 pada tabung 4 aktivitas invertase. Kurva Michaelis-Menten
dan 5 adalah 0.05 dan 0.50 mL; fraksi 3 pada dapat diperoleh dari data dengan proses
tabung 6 dan 7 adalah 0.05 dan 0.50 m; glukosa 4 eksperimen yaitu penyiapan duabelas tabung
mM pada tabung 9 adalah 0.20 mL; sukrosa 0.5 M reaksi yang kemudian diisi dengan komposisi
pada tabung 1 sampai 7 adalah 0.2 mL. Setelah itu, buffer asetat 0.2 M pH 4.5 pada tabung 1 sampai
semua tabung diinkubasi 10 menit pada suhu 10 sebanyak 0.20 mL; sukrosa 0.5 mM pada
ruang, ditambahkan 1 mL reagen Folin Wu, tabung tabung dua sampai sepuluh berturut-turut sebanyak
ditutup, dan dididihkan selama 20 menit. Setelah 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10, 0.20, 0.40, 0.20, 0.40
4

mL, kemudian ditambahkan H2O sampai Selanjutnya, campuran tersebut dihomogenasikan


volumenya 0.9 mL kecuali tabung 11 dan 12 dengan menggunakan homogenizer supaya lebih
sebanyak 1.0 mL dan 0.8 mL; ditambahkan reagen merata. Pemecahan sel dilakukan setelah proses
Nelson’s pada tabung 9 dan 10 sebanyak 1.0 mL; inkubasi. Hal ini dikarenakan enzim invertase
enzim fraksi 3 sebanyak 0.1 mL pada tabung satu termasuk enzim yang berada di dalam sel
sampai sepuluh dan glukosa 4 mL sebanyak 0.2 (intraseluler), maka perlu dilakukan proses
mL pada tabung 12. Assay dimulai dengan pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim
penambahan enzim lalu diinkubasi selama 10 di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih
menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan banyak. Proses pemecahan sel ini dilakukan
penambahan reagen folin Wu sebanyak 1.0 mL, dengan cara keras, yaitu dengan glassbed dan
tutup dengan alumunium foil dan dididihkan digerus selama 30 menit. Inkubasi ragi dilakukan
selama 20 menit. Setelah itu, baca serapannya pada selama 30 menit dengan suhu inkubasi sebesar
panjang gelombang 510 nm. 50oC. Suhu diatur sebesar 50oC karena jika suhu
terlalu panas maka mikroorganisme penghasil
Prediksi Bobot Molekul Enzim Invertase enzim invertase akan mati, sehingga enzim tidak
Pembuatan gel. Semua komponen untuk akan diperoleh.
running gel dicampur kecuali ammonium persulfat Selanjutnya, pemisahan enzim dilakukan
dan TEMED yaitu jenis larutan 10%, 14 mL dengan cara disentrifuge dengan kecepatan 12000
akrilamid+6 mL air, 5 mL tris HCl 3 M pH 8.9, 0.4 rpm selama 15 menit. Hal ini berguna untuk
mL 10% SDS, 14.4 mL air akuades kemudian memisahankan pecahan dinding dinding sel dari
diaduk dengan magnetik stirer, aerasi dengan supernatannya. Prinsip dari metode sentrifuge ini,
vakum. Setelah itu, ditambahkan 0.4 mL amonium yaitu proses pemisahan ekstrak enzim yang
persulfat, dan 0.02 mL TEMED campur dan tuang didasarkan pada berat molekul dengan
dalam plat kaca kurang lebih 4 cm. N-butanol menggunakan gaya sentrifugal. Sehingga nantinya
dimasukkan. Setelah gel membeku selama 1-2 jam, berat molekul yang ringan akan berada diatas dan
n-butanol dibuang dan dicuci dengan running gel yang berat berada dibawah (Koolman, 2000).
overlay. Kemudian ditambahkan 1 mL running gel Setelah disentrifuge, supernatan didekantasi dari
overlay dan dibiarkan hingga stacking gel siap. residu/pecahan dinding-dinding sel, maka hasil
Setelah siap, dua sumur diset dalam gel, masing- yang diperoleh berupa ektrak kasar enzim
masing dengan standard BM protein campuran dan invertase yang berwarna cokelat. Berdasarkan
yang kedua dengan invertase fraksi 3. komposisi tersebut maka jumlah ekstrak kasar
Prosedur elektroforesis SDS-page. enzim invertase yang diperoleh sebanyak 18.02
Sampel protein dididihkan selama 90 detik, gram.
kemudian sampel disimpan pada 0oC hingga siap Ekstrak kasar enzim invertase hasil
digunakan. Sampel protein dan standar diambil optimasi ditentukan aktivitasnya dengan
sekitar 5µL dan diletakkan ke dalam sumur gel. menggunakan assay Nelson’s dan kandungan
Setelah itu, sistem elektroforesis dirakit dan proteinnya menggunakan metode Lowry, diukur
dihubungkan ke dengan power supply (50-100 aktifitas secara spektroskopi. Assay Nelson
volt). berprinsip pada pengukuran jumlah gula pereduksi.
Prosedur pewarnaan standar. Gel disimpan Pada metode ini aktivitas enzim invertase
dalam larutan fiksasi pewarnaan cepat, lalu ditunjukkan oleh bertambahnya produk reaksi
digoyang perlahan-lahan. Larutan fiksasi diganti (glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat
dengan larutan pewarnaan coomasive blue (fruktosa/ satuan waktu). Metode Lowry
kemudian digoyang selama 2-24 jam hingga didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen
protein terlihat. Setelah itu larutan pewarnaan arsenomolibdat menghasilkan warna biru (Hasanah
diganti dengan larutan destaining II hingga Putra 2010).
baground gell jernih kemudian disimpan dalam
asam asetat 7% atau ddH2O. Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Assay
Nelson’s
HASIL DAN PEMBAHASAN Pembuatan Kurva Standar Gula Invert.
Sepuluh tabung disiapkan lalu diisi dengan
Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Invertase
komposisi glukosa 4 mM pada tabung dua sampai
Ragi roti digunakan sebagai sumber enzim
delapan berturut-turut; fruktosa 4 mM hanya pada
invertase pada isolasi ekstrak kasar enzim
tabung sembilan; sukrosa 4 mM pada tabung
invertase karena ragi banyak mengandung khamir
sepuluh; dan H2O pada tabung satu sampai
Saccharomyces cereviseae. Isolasi diawali dengan
sepuluh. Setelah itu, masing-masing tabung
mencampurkan ragi roti sebanyak 10 gram dan
ditambahkan 1 mL reagen Nelson’s, ditutup
pelarut toluen sebanyak 10 mL lalu diaduk.
dengan alumunium foil lalu didihkan selama 20
5

menit untuk memperjelas warna yang terjadi. baik karena hampir mendekati +1, yang mana titik-
Setelah 20 menit, tabung didinginkan dengan hasil titik pada kurva standar melewati garis lerengnya.
diperoleh berupa padatan berwarana biru sampai Perbedaan pH berpengaruh terhadap 2 jenis,
biru kehijauan. Semakin tinggi konsentrasi gula yaitu struktur enzim dan gugus fungsional enzim.
invert, maka warna hijau semakin dominan. Untuk Suatu enzim dapat menghasilkan produk yang
melarutkan padatan tersebut maka reagen maksimal pada pH optimumnya. Aktivitas
arsenomolibdat ditambahkan sebanyak 1 mL, maksimum invertase yaitu pada pH 4,5 dengan
dikocok dengan vorteks, dibiarkan 5 menit. Warna aktivitas sebesar 1.2256 unit pada fraksi 1, 0.9568
larutan yang diperoleh, yaitu semakin tinggi unit pada fraksi 2, dan 1.1232 unit pada fraksi 3.
konsentrasi gula invert maka warna larutan Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah
semakin biru pekat. Supaya campuran lebih encer yang menyebabkan pembentukan 2 µmol gula
dan bisa diukur absorbansinya,lalu ditambahkan 7 pereduksi per menitnya. Hasil pH optimum ini
mL H2O, dikocok lagi dengan vorteks. Pengukuran sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh
absorbansi dilakukan secara spektroskopi pada Bergamasco et al. (2003), yang melaporkan bahwa
panjang gelombang (λ) sebesar 540 nm. aktifitas enzim terjadi pada range pH 3,0 - 5,0
Kurva standar gula invert seperti pada dengan aktivitas maksimum terjadi disekitar pH
gambar 1 dibuat dengan mengalurkan absorbansi 4,5. Diatas skala tersebut aktivitas enzim
(A) terhadap konsentrasi larutan gula invert (M). mengalami penurunan. Semakin basa kondisi
Nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan hidrolisis menyebabkan semakin rendahnya harga
semakin besarnya konsentrasi larutan gula invert aktivitas enzim invertase.
sehingga diperoleh persamaan garis antara Perubahan pH dapat menyebabkan
konsentrasi dan absorbansi yaitu y = 0,515x+ turunnya aktivitas enzim akibat perubahan ionisasi
0,00372 dengan r2 = 0,985. Persamaan tersebut gugus-gugus fungsionilnya karena gugus ionik
akan digunakan untuk menghitung konsentrasi berperan penting dalam menjaga konformasi sisi
gula invert yang terbentuk. aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat
0.7 menjadi produk. Perubahan pH juga dapat
0.6 menyebabkan enzim terdenaturasi sehingga
f(x) = 0.51 x + 0 menyebabkan penurunan katalitik enzim.
0.5 R² = 0.98 Denaturasi enzim dakibatkan karena terjadinya
Absorban

0.4
pemutusan ikatan penstabil struktur (seperti ikatan
0.3
ionik, hidrogen, hidrofobik) yang menghubungkan
0.2
antar polimer protein. Pemutusan tersebut dapat
0.1 terjadi pada protein kwartener, tersier ataupun
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 sekunder. Pada protein kwartener terjadi
[glukosa] µmol pemutusan ikatan penstabil struktur karena
bentuknya yang merupakan gabungan antara
Gambar 1. Kurva standar aktivitas invertase ragi globular satu dengan globular lainyya sehingga
dengan assay Nelson’s dapat terjadi pemutus an ikatan tersebut pada
protein tersier satu dengan protein tersier lainnya
Nilai R2 dari kurva diatas adalah 0.985, hal ini dan terjadi seterusnya, pada protein tersier
menunjukkan bahwa kelinearan kurva standar membentuk protein sekunder (Awwalurrizki
&Putra 2009).
Tabel 1 Data unit enzim invertase dan unit aktivitas dalam fraksi (Total unit).
[glukosa] unit enzim Rata- Total
Larutan Tabung A FP rata-rata
µmol invertase rata unit
B lanko 1 0 - - - - - -
2 0,114 2,1567 2,1561 1,2256 12 67,284 37,006
Fraksi 1
3 1,523 2,95 0,295 1,2 6,7284
103,334
4 0,851 1,645 1,645 0,9568 24 56,834
Fraksi 2 4
5 1,387 2,686 0,2686 2,4 10,3334
6 1,013 1,959 1,959 1,1232 24 60,6528 33,359
Fraksi 3
7 1,484 2,874 0,2874 2,4 6,0653
Standar 8 -0,063 -0,129 - - - - -
6

glukosa 9 0,268 0,513 - - - - -


Pada percobaan ini menunjukkan bahwa
unit aktivitas tertinggi ada pada fraksi dua sebesar
56.824, sedangkan unit enzim invertase tertinggi
0.5
adalah pada fraksi 1 dimana fraksi satu merupakan
ekstrak kasar enzim invertase dan fraksi 3 0.4 f(x) = 0 x + 0.05
merupakan fraksi yang dimurnikan pada enzin R² = 0.87

Absorban
0.3
invertase.
0.2
Penentuan Kadar Protein dengan Metode 0.1
Lowry
Pembuatan kurva standard. Sepuluh 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi
µgram protein
standard BSA pada tabung 2 sampai 10; H 2O dari
tabung 1 sampai 10; reagen C (campuran dari Gambar 2 Kurva standar BSA.
reagen A dan B) pada semua tabung. Fungsi dari
reagen ini adalah unuk membentuk kompleks Metode Lowry-Folin hanya dapat
Biuret. Setelah itu, semua tabung dikocok dengan mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat
vorteks, diinkubasi 10 menit pada suhu ruang. mengukur molekul peptida panjang (Alexander &
Penambahan reagen harus diatur dengan baik. Griffiths 1992). Prinsip kerja metode Lowry
Pada saat sepuluh menit terakhir ditambahkan 0.5 adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+
mL reagen D ke tabung pertama dan seterusnya. oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat
Kemudian dicampur dengan vorteks, diinkubasi dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan
selama 30 menit pada suhu ruang lalu dibaca fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E)
serapannya pada panjang gelombang 700 nm. membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap
Kurva standar pada gambar 2 dibuat dengan cahaya. Protein merupakan polimer heterogen
mengalurkan absorbansi sebagai ordinat (sumbu- molekul-molekul asam amino. Protein yang
Y) dan konsentrasi larutan BSA sebagai absis terkandung dalam kedelai merupakan protein
(sumbu-X). Nilai absorbansi mengalami kenaikan globuler. Dalam protein globuler, rantairantai
dengan semakin bertambahnya konsentrasi larutan samping hidrofil dan polar berada di bagian luar
BSA sehingga diperoleh persamaan garis, yaitu dan rantai samping hidrofob dan nonpolar berada
y=0,0323x + 2,2497x10-3 dan faktor korelasi di bagian dalam.
sebesar 0,9416. Persamaan yang diperoleh Pada percobaan ini didapat kadar protein
digunakan untuk menentukan kandungan protein. paling tinggi adalah pada fraksi II yaitu sebesar
Kandungan protein yang diukur dalam 0,0225 mg/mL sedangkan paling kecil adalah pada
penelitian ini adalah protein terlarut dan protein fraksi III sebesar 0,0015 mg/mL. Hal ini
total. Protein terlarut merupakan oligopeptida dan dikarenakan pada fraksi III sudah dilakukan
mudah diserap oleh sistem pencernaan. Protein perlakuan terus-menerus atau paling banyak
total merupakan pengukuran kandungan nitrogen sehingga kadar proteinnya paling kecil. Sementara
(N) dalam sampel. Oleh karena itu, terdapat itu kandungan protein Total pada fraksi II juga
senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan tertinggi (1,0328) dan fraksi III paling rendah
terkalkulasi. Namun, interferensi ini relatif kecil (0,0608).
dan dapat diabaikan.

Tabel 2 Data jumlah protein, total protein, dan aktivitas spesifik enzim invertase.
Laruta protein [protein] Rata- Total Rata- Aktivitas
Tabung A
n (µg) (mg/mL) rata protein rata Spesifik
Blanko 1 0 - -
2 -0,007 -0,286 -0,0057 0,6975
Fraksi
3 0,12 3,646 0,0182 0,0155 0,1744 0,3139 80,387
1
4 0,208 6,369 0,0127 0,0698
5 0,037 1,076 0,0215 2,295
Fraksi
6 0,048 1,416 0,0071 0,0255 0,574 1,0328 37,522
2
7 0,775 23,924 0,0478 0,2295
Fraksi 8 -0,011 -0,41 -0,0082 0,0015 0,135 0,0608 748,8
7

9 -0,004 -0,1935 -0,00096 0,0338


3
10 0,027 0,766 0,0015 0,0135
Dari hasil keseluruhan aktivitas spesifik lagi. Hal ini terjadi karena suatu reaksi enzimatis
fraksi III paling besar (748,8) dibandingkan fraksi akan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi
yang lain. Dari konsentrasi tersebut didapat yield substrat [S], akan tetapi setelah [S] meningkat
enzim sebesar 90,14%, sedangkan fold enzimnya lebih lanjut akan sampai pada kecepatan yang
sebesar 931,49%. Yield enzim merupakan tetap. Pada kondisi dimana kecepatan reaksi
perbandingan antara total unit dalam fraksi yang enzimatis tidak dapat bertambah lagi dengan
dimurnikan dengan total unit dalam ekstrak kasar, bertambahnya [S] disebut kecepatan maksimum
sedangkan fold enzim merupakan perbandingan (Vmaks) (Wiesman, 1989).
antara aktivitas spesifik dari fraksi yang
dimurnikan dengan aktivitas spesifik ekstrak kasar.
0.18
0.16
Penentuan kinetika enzim f(x) = 0.58 x + 0
0.14 R² = 0.98
Penentuan kinetika enzim invertase (Vmaks 0.12
dan Km) didasarkan atas plot grafik hubungan 0.1
V 0.08
antara konsentrasi substrat [S] dan aktivitas enzim
0.06
(V) (Fayyaz et al. 1995; Dinu 2001). Larutan 0.04
substrat sukrosa dibuat dengan konsentrasi antara 0.02
0.02-0.4 dengan interval 0.02 dan 0.1 dalam 0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
larutan buffer asetat 0,2 M pH 4.5 lalu dilakukan
S
pengujian aktivitas enzim sesuai prosedurnya.
Setelah itu ditentukan aktivitas enzim (µmol gula Gambar 3 Kurva hubungan antara kecepatan dan
pereduksi/ menit) pada masing-masing konsentrasi konsentrasi substrat (Michaelis Menten)
substrat.
140
Selanjutnya dibuat tabel V dan [S] dan
120
dikonversi menjadi 1/V dan 1/[S] serta dibuat plot f(x) = 1.72 x − 0.91
100
grafik hubungan antara 1/V dan 1/[S]. Lalu R² = 0.98
80
ditentukan nilai Vmaks dan Km yang didasarkan
1/V 60
atas persamaan kurva Lineweaver-Burk (Whitaker,
1996), dengan cara: 40
- Bahwa dari persamaan: 1/V = 1/Vmaks + Km/ 20
Vmaks.(1/[S]) 0
- Bila 1/V = Y dan 1/[S] = X, maka rumusnya 0 10 20 30 40 50 60 70 80
1/S
dapat ditulis menjadi: Y = a + bX, sehingga:
Gambar 4 Kurva hubungan antara 1/V dan 1/S
a = 1/Vmaks dan b = Km/Vmaks
(Lineweaver burk)
- Dengan demikian, bila harga 1/Vmaks diketahui
maka nilai Vmaks didapat, begitu pula nilai Km
Penentuan Vmaks akan menghasilkan
akan juga didapat dari persamaan b = Km/Vmaks.
gambaran tentang sifat-sifat kinetika enzim lain, ½
Aktivitas enzim invertase pada beberapa
Vmaks, yaitu suatu konsentrasi substrat yang
konsentrasi substrat (Tabel 3) menunjukkan bahwa
separuh lokasi aktifnya telah terisi atau bila
konsentrasinya mula-mula meningkat secara
kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai
signifikan sejalan dengan meningkatnya
setengah dari kecepatan maksimum, yang dikenal
konsentrasi substrat. Penentuan Vmaks dan Km
dengan Km (tetapan Michaelis-Menten). Nilai Km
didasarkan atas persamaan garis regresi grafik
digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga
hubungan antara 1/[S] dan 1/V (Tabel 3),
berhubungan dengan tetapan keseimbangan
seperti disajikan pada Gambar 4. Selanjutnya disosiasi kompleks E-S menjasi E dan S. Fayyaz
dari persamaan regresi y=1,720x – 0,914, (1995) menambahkan bila nilai Km kecil berarti
maka diperoleh Vmaks = -1,0940 µgram/ menit dan kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap
Km = -1,8818 mM substrat tinggi, sedangkan bila nilai Km besa
Aktivitas enzim invertase yang mula-mula afinitasnya menjadi rendah. Harga Km enzim
meningkat secara signifikan sejalan dengan sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat,
meningkatnya konsentrasi substrat, tetapi tidak keadaan lingkungan dan kekuatan ion. Pada
signifikan setelah konsentrasi substrat ditingkatkan percobaan kali ini didapat Vm negatif artinya
8

reaksi berjalan sangat lamabat atau mungkin tidak penambahan enzim ke tabung kurang tepat dengan
berjalan sama sekali. Hal ini karena kurva yang interval waktunya.
dihasilkan tidak hiperbolik yang disebabkan saat
Tabel 3 Data kecepatan da konsentrasi substrat sukrosa
Tabun
A [sukrosa] µmol V 1/V [S] 1/[S]
g
1 0 0 0 0 0 0
2 0,046 0,082 0,0082 121,95 0,0143 69,93
3 0,107 0,201 0,0201 49,75 0,0386 34,97
4 0,111 0,208 0,0208 48,08 0,0429 23,31
5 0,191 0,364 0,0364 27,47 0,0571 17,51
6 0,241 0,461 0,0461 21,69 0,0714 14,01
7 0,501 0,996 0,0996 10,35 0,1429 6,99
8 0,826 1,596 0,1596 6,27 0,2857 3,50
fungsi dari berat molekulnya, dimana kompleks
Prediksi bobot molekul enzim invertase SDS-protein yang lebih besar mempunyai
Prinsip dasar SDS-PAGE adalah
makromolekul bermuatan akan bermigrasi dalam
medan listrik dengan laju yang ditentukan oleh mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan
ukuran dan muatannya. Sebelum protein kompleks yang lebih kecil.
dijalankan dalam medan listrik, protein terlebih Stacking gel mempunyai fungsi untuk
dahulu akan didenaturasi dengan perubahan mengumpulkan sampel yang akan dipisahkan
kondisi yang tajam misalnya panas, adanya agen sehingga memungkinkan cuplikan untuk bergerak
pereduksi, penambahan deterjen dan lain-lain, bersama-sama dan membentuk suatu pita cuplikan
kemudian akan dibungkus dengan deterjen anionik yang pekat. Resolving gel mempunyai fungsi
yaitu SDS. Muatan asli molekul protein akan untuk terjadinya pemisahan yang lebih baik
ditimpa oleh molekul SDS yang bermuatan sehingga memungkinkan terjadi perbedaan gerak
negatif. Adanya 2-merkaptoetanol dapat yang jelas terlihat antara spesies dengan molekul
membantu denaturasi protein dengan cara besar dan spesies dengan molekul yang lebih kecil.
mereduksi semua ikatan disulfide. Fungsi buffer elektroforesis untuk
SDS dilakukukan pada pH netral. Pada mempertahankan pH di dalam reservoir dan gel
metode ini digunakan SDS dan β-merkaptoetanol. serta sebagai elektrolit pembawa aliran listrik.
SDS bersama β-merkaptoetanol dan pemanasan Oleh karena itu pemilihan buffer harus memenuhi
menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi kriteria antara lain: pemilihan buffer didasarkan
protein menjadi konfigurasi random coil. Hal ini pada tidak adanya interkasi yang terjadi antara
disebabkan oleh pecahnya ikatan disulfida yang buffer dengan makromolekul yang dipisahkan, pH
selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus yang digunakan tidak mengakibatkan denaturasi
sulfhidril. Denaturasi protein adalah suatu keadaan protein (kisaran yang digunakan untuk protein
dimana terjadi perubahan konformsi protein. biasanya 4.5-9.0, kekuatan ionik dan konsentrasi
Perubahan ini meliputi proses destruksi ikatan buffer harus diperhitungkan dengan tepat
pada struktur sekunder sehingga konformasi (kekuatan ionik biasanya berkisar 0.05-0.15).
protein asli berubah tetapi ikatan kovalen pada Sistem buffer kontinyu adalah gel yang
polipeptida tidak mengalami kerusakan. SDS digunakan dalam satu slab terdiri dari dua gel yaitu
merupakan deterjen anionik, memiliki gugus ion stacking gel dan separating gel. Buffer dan
sulfat dan rantai alkil lipfoilik yang menyebabkan konsentrasi akrilamid yang digunakan pada kedua
peptida dan protein tidak saling berikatan yang gel tersebut berbeda. Pada stacking gel digunakan
dinamakan denaturasi. SDS mengelilingi peptida buffer dengan pH 6.8 dan konsentrasi akrilamid
atau protein sehingga bermuatan negatif, kemudain rendah. Sedangkan pada separating gel digunakan
semua peptida dan protein dalam campuran akan buffer dengan pH 8.8 dan konsentrasi akrilamid
bermigrasi menuju anoda yang pergerakannya tinggi. Sehingga protein akan terkonsentrasi pada
tidak dipengaruhi oleh bentuk. Hal ini disebabkan stacking gel dan akan mengalami resolusi yang
karena adanya denaturasi yang mengakibatkan tinggi pada separating gel. Hal ini menghasilkan
bentuk molekul seragam yaitu berbentuk rantai pemisahan yang baik dan pita tajam.
lurus yang kemudian diselimuti oleh SDS sehingga Pewarnaan berfungsi untuk memperjelas
bermuatan negatif. Pergerakan protein merupakan pita protein hasil pemisahan dengan elektroforesis.
9

Pewarna yang digunakan harus dapat bereaksi protein mayor pada. Berat molekul dari protein
dengan molekul sampel yang dipisahkan, tetapi mayor ini berkisar 148,7 kDa, 121,6 kDa, dan 105
tidak bereaksi dengan gel elektroforesis. Ikatan kDa.
antara pewarna dan gel bukan ikatan kovalen Alasan elektroforesis digunakan dalam
sehingga mudah dilepaskan oleh pencucian yang penelitian ini karena memiliki peran sangat penting
intensif dan penyinaran. dalam proses pemisahan molekul-molekul biologi,
khususnya protein. Karena disamping metode
tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer,
tetapi juga sangat sensitif terhadap perbedaan
muatan dan berat molekul yang cukup kecil
(Bachrudin, 1999). Protein yang dialirkan dalam
medium yang menagndung medan listrik maka
senyawa-senyawa yang bermuatan akan bergerak
dalam larutan sebagai akibat dari sifat polaritas
yang berlawanan, maka mobilitas suatu molekul
meupakan fungsi dari bentuk, ukuran molekul, dan
besar tipe muatan.
Gambar 5 Hasil elektroforesis SDS PAGE Penggunaan SDS dan merkaptoetanol
disertai dengan pemanasan akan memecah struktur
Adapun pengamatan yang sudah diujikan, tiga dimensi dari protein, terutama ikatan disulfida
tampak jelas terlihat laju migrasi dan berbedaan menjadi subunit-subunit polipeptida secara
gerak yang jelas terlihat antara spesies dengan individual. SDS juga membungkus rantai protein
molekul besar dan spesies dengan molekul yang yang tidak terikat dengan muatan negatif yang
lebih kecil, dan dengan menggunakan pewarnaan sama membentuk kompleks SDS-protein.
tampak terlihat jelas proses pemisahan pita protein Kompleks SDS protein mempunyai densitas
hasil elektroforesis. muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya
Sampel yang dimasukan ke dalam sumur berdasarkan ukuran protein. Jadi kompleks SDS-
pada stacking gel akan terkonsentrasi atau protein yang lebih besar mempunyai mobilitas
tertumpuk dan tidak mengalami pemisahan yang lebih rendah dibandingkan dengan kompleks
meskipun dibawah pengaruh medan listrik, hal ini SDS-protein yang lebih kecil.
disebabkan karena pori gel berukuran besar (4%
akrilamid). Mobilitas ion pada stacikng gel secara SIMPULAN
berurutan adalah ion klorida, protein kemudian ion Berdasarkan hasil percobaan diperoleh
glisin. Ketika pergerakan mencapai separating gel, kesimpulan bahwa aktivitas optimum invertase
konsentrasi glisin meningkat akibat peningkatan dalam mendegradasi sukrosa menjadi gula invert
pH sehingga mobilitasnya menurun akibat adanya adalah pada kondisi pH 4,5. Berbagai pengujian
ukuran pori yang semakin kecil. Dengan demikian seperti aktivitas, kadar, kinetika dan bobot
pergerakan ion pada separating gel secara molekulnya, dari aktivitasnya ternyata fraksi I
berurutan adalah ion klorida, ion glisin, dan memiliki konsentrasi dan aktivitasnya lebih besar
protein. dari yang lain (1.2256 unit/menit), hal ini
Hasil running dari masing-masing disebabkan pada fraksi I masih fresh. Sedangkan
sampelnya diekstrak dari sel-sel mikroorganisme. pengamatan kadar protein memiliki konsentrasi
Dua macam konsentrasi ini dipilih untuk larutan sampel yang dihitung dengan bantuan
membedakan antara populasi mikroorganisme kurva standar yang tertinggi ialah dari fraksi II
yang resisten dengan yang tidak resisten. Pola Pita sebesar 0,0255 mg/mL. Dengan data mengenai
protein hasil running dengan menggunakan gel aktvitas dan kadar pada fraksi II memperkuat
polyakrilamid seperti terlihat pada Gambar 2. literatur yang menyatakan bahwa konsentrasi
Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi enzim dapat mempengaruhi aktivitas enzim,
berat molekul dari campuran polypeptida (Hames ditandai dengan semakin banyaknya substrat yang
& Rickwood 1990). Marker protein yang berubah menjadi produk melalui proses enzimatis.
digunakan memiliki rentang berat molekul 212 Besarnya fold enzim dan yield enzim berturut-turut
kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat adalah 931,49% dan 90,14%, sedangkan Vmaks =
sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan -1,0940 µmol/mL.menit dan Km = -1,8818 mM.
berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan Dan untuk mengetahui bobot molekulnya
dan intensitas warna yang lebih besar menggunakan elektroforesis dengan metode SDS-
dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap PAGE dimana protein akan bermigrasi dengan
variaetas disebut protein mayor. Pada hasil dialiri arus listrik, dan yang memiliki molekul
elektroforesis di atas terdapat beberapa buah besar akan tetap diam.
10

Grof CP, Huber JL, McNeil SD, Lunn LE,


DAFTAR PUSTAKA Campbell JA. 1998. A modified assay
Acosta N, Beldarrain A, Alonso Y. 2000. method show leaf sucrose phosphate synthase
Characterization of recombinant invertase activity is correlated with leaf sucrose
expressed in methylotropic yeasts content across a range of sugarcane varieties.
Biotechnology and Applied Biochemistry 32: Aust. J. PlantPhysiol 25 : 499-502.
179-187
Hames, B.D & Rickwood.1990. A Practical
Alexander RR, Griffiths JM. 1992. Basic Approach: Gel elektrophoresis protein.
Biochemical Methods. New York: Wiley- Huntington: Robert E Krieger Publishing
Liss. Company

Awwalurrizki N, Putra SR. 2009. Hidrolisis Hasanah EN, Putra SR. 2009. Karakterisasi
Sukrosa dengan enzim invertase untuk ekdtrak kasar enzim invertase yang
produksi etanol menggunakan Zymomonas dimobilisasi dengan Na-Alginat [skripsi].
mobilis [skripsi]. Surabaya: Fakultas Surabaya: Fakultas matematika dan Ilmu
matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, pengetahuan Alam, Institut Teknologi
Institut Teknologi Sepuluh Nopember Sepuluh Nopember.

Bachrudin. Z. 1999. Petunjuk Laboratorium: Kim J.Y., Mahe A, Brangeon J, Prioul JL. 2000.
Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein. Amaize vacuolar invertase , IVR2, is induced
PAU Bioteknologi: UGM Yogyakarta by water stress. Organ/tissue specificity and
diurnal modulation of expression. Plant
Bergamasco R., Bassetti FJ, Moraes FF, Zanin Physiol 124:71-84.
GM. 2000. Characterization of free and
immobilized invertase regarding activity and Koch, K. E. (1996) Carbohydrate modulated gene
energy of activation. Brazilian Journal of expression in plants. Annu. Rev. Plant
Chemical Engineering 17: 873-880 Physiol.Plant Mol. Bio. 47:509-540.

Bergamasco R, Akgol S, Bulut A, Denizli A, Koolman J, Rohm KH. 1994. Atlas Berwarna Dan
Yakub A.M. 2003. Covalent immobilization Teks Biokimia. Wanandi SI; penerjemah.
of inverase onto a reactive film composed of Terjemahan dari: Color Atlas Of
2- hydroxyethyl methacrylate and glycidyl Biochemistry. Jakarta: Hipokrates.
methacrylate. Biochemical Engineering
Journal 14:117- 126 Lee WC, Huang CT. 2000. Modelling of mobilis
ATTC 10988 grown on the media containing
Bucke C. 1987. Cell immobilization in calcium glucose and fructose. Biochemical
Alginate. Methods in Enzymology 135: 175- Engineering Journal 4: 217-227
189
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid
Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose ke-1. Maggy Thenawidjaja; penerjemah.
phosphate synthase expression at the cell and Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry.
tissue leve1 is coordinated with sucrose sink- Erlangga: Jakarta
tosource transitions in maize leaf. Plant
Physiol 111 : 1021-1029. Lunn JE, Hatch MD. 1997. The role of sucrose
phosphate synthase in the control
Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acid photosynthate partitioning in Zea mays
and pectins by polygalacturonase from leaves. Aust. J. Plant Physiol 24 : 1-8.
Aspergillus niger. Roum Biotechnol 6 (5) :
397-402. Narita V. 2005. Saccharomyces cerevisiae
Superjamur yang Memiliki Sejarah Luar
Fayyaz A, Asbi BA, Ghazali HM, Che-Man YB, Biasa. Jakarta: Pustaka Utama.
Jinap S. 1995. Kinetics of papaya
pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 : Ohto M, Onai K, Furkawa Y, Aoki E, Araki T,
129-135. Nakamura A. 2001. Effect of sugar on
vegetative development and floral transition
Fung RW, Kamper GL, Gardner RC, MacRae E. in Arabidopsis Plant Physiol. 127 : 252-261.
2003. Differential expression within an SPS
gene family. Plant Sci 164:450-470
11

Wiseman A. 1989. Handbook of Enzyme Howard.


Biotechnology. 2nd. Edition. New York: Ellis