Anda di halaman 1dari 10

1

Isolasi, Purifikasi, Kinetika, Dan Karakterisasi Enzim Invertase


Saccharomyces cerevisiae

Anggun Widya Ninggar (G84070034)1, Amelinda2, dan Waras Nurcholis3


Mahasiswa Praktikum1, Asisten Praktikum2, dan Dosen Praktikum3
Pengantar Penelitian Biokimia
Departemen Biokimia, FMIPA, IPB
2010

ABSTRAK
Invertase merupakan katalis pada hidrolisis sukrosa menghasilkan glukosa dan fruktosa (gula invert).
Praktikum ini bertujuan mengisolasi dan mempurifikasi enzim invertase dari ragi, menentukan aktivitas
dan kuantitas protein enzim invertase menggunakan assay Nelson dan metode Lowry, menentukan nilai
Km dan Vmaks dari enzim invretase melalui study kinetika, dan mengkarakterisasi enzim invertase
berdasarkan bobot molekul, pengaruh suhu, dan pengaruh pH. Assay Nelson berprinsip pada
pengukuran jumlah gula pereduksi. Pada metode ini aktivitas enzim invertase ditunjukkan oleh
bertambahnya produk reaksi (glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat (fruktosa/ satuan
waktu). Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen arsenomolibdat menghasilkan
warna biru. Hasil optimum karakterisasi enzim invertase amobil diperoleh pada kadar Na-alginat 5 gr,
konsentrasi substrat (sukrosa) 0,5 M, pH 4,5, dan suhu 30oC. Pengukuran aktifitas enzim invertase
dilakukan dengan metode spektrofotometri menggunakan reagen Nelson. Dari hasil pengukuran
diperoleh aktifitas enzim invertase terbesar pada fraksi I sebesar 1.2256 unit/menit, kadar protein
terbesar pada fraksi II sebesar 0,0255 mg/mL, fold enzim dan yield enzim berturut-turut adalah 931,49%
dan 90,14%. Sedangkan Nilai konstanta Michaelis, Vmaks = -1,0940 µmol/mL. menit dan Km = -1,8818
mM.

PENDAHULUAN pengaturan ekspresi gen lainnya (Koch, 1996;


Indonesia merupakan negara yang memiliki Ohto et al., 2001), partisi karbon asimilate (Lunn
sumber daya alam yang melimpah, baik hayati atau & Hatch 1997; Grof et al. 1998) serta
non-hayati. Tetapi masih banyak sumber daya pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Fung et
alam yang belum dimanfaatkan secara maksimal al, 2003).
oleh masyarakat, padahal sumber daya alam Enzim invertase banyak ditemukan pada
tersebut sangat berpotensi untuk dimanfaatkan ragi roti yang mengandung khamir Saccharomyces
lebih optimal lagi. Mikroorganisme merupakan ceriviseae. Invertase diproduksi oleh bakteri,
salah satu sumber daya alam yang bisa dirasakan fungi, tumbuhan tingkat tinggi, dan beberapa sel
manfaatnya dalam kehidupan. Beberapa macam hewan (Lee Huang et al. 2000). Tetapi banyak
mikroorganisme dapat menghasilkan enzim adalah penelitian dilakukan pada produksi invertase yang
khamir, fungi, dan bakteri. Diantaranya yang dihasilkan oleh khamir Saccharomyces cereviceae.
paling lazim adalah khamir Saccharomyces Khamir ini banyak terkandung pada ragi roti, dan
cerevisiae yang merupakan mikroorganisme paling secara komersil banyak dijual dipasaran. Yeast
komersial saat ini. Penggunaan S. cerevisiae merupakan mikroorganisme uniseluler berbentuk
sebagai pabrik etanol telah banyak dikembangkan ellips, bulat atau silindris, yang ukurannya 5-10
di beberapa negara, seperti Brasil, Afrika Selatan, kali lebih besar dari bakteri. Ragi ini banyak
dan Amerika Serikat. Khamir lebih banyak digunakan dalam pembuatan bir dan roti serta
digunakan untuk memproduksi alkohol secara dikenal pula sebagai suplemen makanan karena
komersial dibandingkan dengan bakteri (Narita kaya akan vitamin.
2005). Enzim invertase banyak digunakan dalam
Invertase, dikenal sebagai β- industri fermentasi karena berfungsi sebagai
fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26) katalis dalam hidrolisis sukrosa menjadi glukosa
merupakan sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa dan fruktosa (gula invert/gula pereduksi).
yang menghasilkan fruktosa dan glukosa (gula Kemampuan enzim dalam mengkatalisis reaksi
invert). Sukrosa merupakan produksi akhir kimia dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang
asimilasi karbon (C) pada proses fotosintesis yang meliputi pH, suhu, waktu inkubasi, dan konsentrasi
terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan bentuk substrat. Enzim invertase yang dihasilkan oleh
karbohidrat yang mudah ditransporta-sikan ke Saccharomycees ceriviceae mempunyai aktivitas
jaringan simpan atau sink tissues (Cheng et al. paling tinggi pada pH 4,5 dan temperatur 30ºC
1996). Selain berfungsi dalam penyediaan energi (Bergamasco et al. 2000).
dan kerangka karbon, sukrosa juga berperan dalam
2

Setiap enzim mempunyai nilai tetapan


Michaelis-Menten tertentu, dimana nilai Km dapat METODE PERCOBAAN
digunakan untuk memperkirakan jumlah substrat
yang diperlukan agar reaksi enzimatis berjalan Waktu dan Tempat
efisien. Dengan mengetahui nilai Km dan Vm suatu Praktikum dilakukan selama 6 minggu yaitu
enzim, maka dapat dilakukan optimalisasi 2 Maret - 27 April 2010. Tempat pelaksanaannya
penggunaan enzim tersebut sebagai biokatalisator di Laboratorium Pendidikan Departemen
reaksi pemecahan substrat menjadi produk. Laju Biokimia, FMIPA IPB.
reaksi meningkat saat suhu mencapai nilai
optimum dan berkurang saat suhunya maksimum. Alat dan Bahan
Sedangkan aktivitas enzim akan meningkat dengan Alat-alat yang digunakan dalam praktikum
meningkatnya kadar substrat (Lehinger 1982). ini antara lain mortar, sentrifus, refrigerator
Pemanfaatan enzim secara komersial terus Sorvall, rotor SS-34, pipet pasteur, bulb, tabung
dipelajari dan diterapkan yaitu pemanfaatan enzim sentrifus 50 mL, inkubator, gelas ukur, gelas piala
untuk proses enzimatik pada industri makanan, 100 dan 600 mL magnetic stirer, tabung reaksi
minuman, farmasi, dan biokimia. Salah satu bertutup, waterbath, vortex, spektrofotometer
contoh pemanfaatan tersebut adalah pematangan UV/VIS, stopwatch, dan mikropipet, pipet kaca,
buah-buahan hijau yang dipanen, pelayuan daging, pipet stirer, magnetic stirer, seperangkat peralatan
pengawetan keju, pencegahan kekeruhan bir, dan SDS-PAGE.
pembentukan tekstur gula. Sedangkan Bahan-bahan yang digunakan yaitu ragi
pemanfaatan enzim invertase banyak dilakukan (Saccharomyces cerevisiae), pasir/ glassbead,
dalam industri makanan dan minuman khususnya toluen, akuades, asam asetat1N, parafilm,
pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula, amonium sulfat, 4mM glukosa, 4 mM fruktosa,
dan produksi asam laktat dari fermentasi sirup tebu Reagen arsenomolibdat, bufer asetat 0.2 M pH 4.5,
(Acosta et al. 2000). bufer tris-HCl 0.05 M pH 7.3, reagen A (2%
Invertase juga digunakan untuk Na2CO3 dalam NaOH 0.1 N), reagen B (2.7%
memproduksi etanol dari sukrosa sebagai sumber sodium potasium tartrat), reagen C (1% CuSO4
karbon (Lee Huang 2000). Adanya isu sosial dan dalam H2O), reagen D (reagen folin Cioucalteou
fakta akan terbatasnya sumber bahan bakar fosil yang telah diencerkan dengan air sampai 1 N
telah menstimulasi upaya penggunaan dan dalam asam, harus dibuat fres), fraksi enzim
pengembangan bahan bakar alternatif yang invertase I, II, III, sukrosa 0.5M, H2O, reagen
renewable dan ramah lingkungan. Produksi etanol Folin Wu, larutan monomer, 4x running gel bufer
melalui fermentasi mikroba dianggap sebagai (1.5 M Tris-Cl pH 8.8), 4x stacking gel bufer (0.5
metode alternatif sumber energi bahan bakar fosil M Tris-Cl pH 6.8), 10% SDS, 10% amonium
dikarenakan keunggulannya, yaitu rendahnya persulfat, 2x treatment bufer (0.125M Tris-Cl, 4%
biaya produksi, persentase rendemen yang tinggi, SDS, 20% v/v gliserol, 0.2 M DDT, 0.02%
prosesnya relatif lebih cepat, penanganannya bromfenol blue, pH 6.8), tank bufer (0.025M Tris,
sederhana, dan produk samping yang relatif lebih 0.192M glisin, 0.1% SDS, pH 8.3), water saturated
sedikit serta aman bagi lingkungan (Narita 2005). n-butanol, TEMED, standar BM protein campuran
Secara umum enzim larut dalam air, (marker), larutan fikasasi (25% isopropanol, 10%
sehingga banyak enzim tidak ekonomis untuk asam asetat) dan larutan pewarna commassie blue
digunakan pada pengoperasian tipe batch dalam (0.06 commassie blue G-250, 10% asam asetat).
skala besar di industri, karena hanya dapat
digunakan satu kali proses dengan biaya yang Prosedur Percobaan
cukup mahal. Tetapi dalam tahun-tahun Isolasi Invertase Ragi
belakangan ini berbagai teknik telah ditemukan Ekstraksi invertase ragi. Ragi ditimbang
untuk memperbaiki kerja enzim, yaitu dengan cara 10 gram dan sejumlah glass bead (2-3 gram)
mengikatkan enzim pada bahan-bahan yang tidak dimasukkan ke dalam mortar. Setelah itu
larut dalam air, dimana bahanbahan tersebut dapat ditambahkan 10 mL toluen ke dalam mortar
dipisahkan dari produk dengan mudah. Hal itu tersebut, gerus sedikit demi sedikit hingga
memungkinkan penggunaan kembali bahan-bahan membentuk pasta yang halus, lalu ditambahkan 20
tak larut yang mengandung enzim tersebut. Teknik mL akuadessecara bertahap selama 30 menit,
ini disebut dengan amobilisasi enzim. Teknik dilanjutkan dengan penggerusan setiap
amobilisasi pada enzim merupakan suatu teknik penambahan. Seluruh isi mortar dipindahkan ke
yang dapat meningkatkan kemampuan hidup dalam tabung sentrifus 50 mL laulu sentrifugasi
enzim sehingga dapat digunakan kembali. Teknik selama 15 menit, 12000 rpm. Setelah itu, lapisan
tersebut merupakan metode terbaik untuk air dipindahkan dan ekstrak protein dikumpulakan,
mengurangi pengeluaran biaya dalam proses dicatat volumenya. Fraksi satu didapat dari aliquot
enzimatik secara kontinu khususnya dalam industri sebagai sampel dari ekstrak kasar, lalu diukur
makanan dan minuman (Bucke 1987). aktivitas dan kadar proteinnya.
3

Pemanasan ekstrak invertase ragi. Penentuan Kadar Protein dengan Metode


Ekstrak diinkubasi pada suhu 50oC selama 30 Lowry
menit lalu ekstrak didinginkan, disentrifugasi 15 Pembuatan kurva standard. Sepuluh
menit, 15000rpm. Volume supernatan diukur, lalu tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi
diambil 2 mL aliquot untuk uji aktivitas dan kadar standard BSA pada tabung 2 sampai 10 berturut-
protein ekstrak kasar pemanasan. turut adalah 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35,
Fraksinasi ekstrak invertase ragi. 0.40, dan 0.45 mL; H2O dari tabung 1 sampai 10
Fraksinasi pengendapan dibuat dengan amonium berturut-turut adalah 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30,
sulfat 20, 40, 60, dan 80% dengan menambahkan 0.25, 0.20, 0.15, 0.10, 0.05 mL; reagen ABC pada
garam amonium sulfat selama satu jam. Lalu semua tabung sebanyak 5 mL. Setelah itu, semua
disentrifugasi selama 30 menit, 30000 rpm. tabung dikocok dengan vorteks, diinkubasi 10
Supernatan yang didapat ditambahakan amonium menit pada suhu ruang. Penambahan reagen harus
sulfat lagi untuk fraksi pengendapan berikutnya. diatur dengan baik. Pada saat sepuluh menit
Hasilnya disimpan dalam suhu -20oC. Setelah itu, terakhir ditambahkan 0.5 mL reagen D ke tabung
endapan dilarutkan dengan buffer tris-HCl dengan pertama dan seterusnya. Kemudian dicampur
pH 7.3 lalu diukur volume total masing-masing dengan vorteks, diinkubasi selama 30 menit pada
fraksi, diambil 1-2 mL untuk uji kadar aktivitas. suhu ruang lalu dibaca serapannya pada panjang
gelombang 700 nm.
Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Assay Pengukuran kadar protein enzim
Nelson’s invertase. Sampel fraksi 1 dan 2 diencerkan
Pembutan kurva standar. Sepuluh tabung dengan air dalam perbandingan 1:4 dengan
disiapkan lalu diisi dengan komposisi glukosa 4 komposisi assay tabung 1 sebagai blanko berisi 0.5
mM pada tabung dua sampai delapan berturut-turut mL H2O; Tabung 2, 3, dan 4 berisi fraksi 1 dengan
adalah 0.02, 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.3 mL; jumlah 0.05, 0.20, 0.5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0
fruktosa 4 mM hanya pada tabung sembilan yaitu mL; tabung 5, 6, dan 7 berisi fraksi 2 dengan
0.2 mL; sukrosa 4 mM pada tabung sepuluh yaitu jumlah 0.05, 0.20, 0.5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0
0.2 mL; dan H2O pada tabung satu sampai sepuluh mL. Selanjutnya prosedur mengikuti metode
berturut-turut adalah 1, 0.98, 0.95, 0.90, 0.85, 0.80, Lowry seperti pembuatan kurva standard protein.
0.75, 0.70, 0.80, 0.80 mL. Setelah itu, masing- Perlakuan untuk fraksi 3 adalah fraksi 3
masing tabung ditambahkan 1 mL reagen disuspensikan pada buffer tris. Preparasi Buffer
Nelson’s, ditutup dengan alumunium foil lalu tris dan Fraksi 3 adalah dengan pengenceran air
didihkan selama 20 menit. Setelah 20 menit, 1:1. Enam buah tabung disiapkan, tabung 1, 2, dan
tabung didinginkan dan ditambahkan 1 mL reagen 3 sebagai blanko berisi buffer tris 0.05 M berturut-
arsenomolibdat, dikocok dengan vorteks, dibiarkan turut adalah 0.05, 0.2, 0,5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0
5 menit, lalu ditambahkan 7 mL H2O, dikocok lagi mL, sedangkan tabung 4, 5, dan 6 adalah sampel
dengan vorteks. Terakhir, baca serapannya pada yang berisi fraksi 3 berturut-turut adalah 0.05, 0.2,
panjang gelombang 510 nm dan dibuat kurva 0,5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0 mL. Selanjutnya
standard. prosedur mengikuti metode Lowry seperti
Uji aktivitas enzim invertase. Sembilan pembuatan kurva standard protein.
tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi
buffer asetat 0.2 M pH 4.5 pada tabung 1 sampai 7 Study Kinetika Enzim Invertase.
adalah 0.2 mL; H2O dari tabung 1 sampai 9 Pengaruh konsentrasi substrat pada
berturut-turut adalah 0.6, 0.55, 0.10, 0.55, 0.10, aktivitas invertase. Kurva Michaelis-Menten
0.55, 0.10, 1.0, 0.8 mL; Fraksi 1 pada tabung 2 dan dapat diperoleh dari data dengan proses
3 adalah 0.05 dan 0.50 mL; fraksi 2 pada tabung 4 eksperimen yaitu penyiapan duabelas tabung
dan 5 adalah 0.05 dan 0.50 mL; fraksi 3 pada reaksi yang kemudian diisi dengan komposisi
tabung 6 dan 7 adalah 0.05 dan 0.50 m; glukosa 4 buffer asetat 0.2 M pH 4.5 pada tabung 1 sampai
mM pada tabung 9 adalah 0.20 mL; sukrosa 0.5 M 10 sebanyak 0.20 mL; sukrosa 0.5 mM pada
pada tabung 1 sampai 7 adalah 0.2 mL. Setelah itu, tabung dua sampai sepuluh berturut-turut sebanyak
semua tabung diinkubasi 10 menit pada suhu 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10, 0.20, 0.40, 0.20, 0.40
ruang, ditambahkan 1 mL reagen Folin Wu, tabung mL, kemudian ditambahkan H2O sampai
ditutup, dan dididihkan selama 20 menit. Setelah volumenya 0.9 mL kecuali tabung 11 dan 12
20 menit, tabung didinginkan, ditambahkan reagen sebanyak 1.0 mL dan 0.8 mL; ditambahkan reagen
arsenomolibdat 1 mL, dikocok dengan vorteks, Nelson’s pada tabung 9 dan 10 sebanyak 1.0 mL;
lalu biarkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, enzim fraksi 3 sebanyak 0.1 mL pada tabung satu
tambahkan semua tabung dengan H2O 7 mL, sampai sepuluh dan glukosa 4 mL sebanyak 0.2
dikocok lagi dengan vorteks, dan dibaca mL pada tabung 12. Assay dimulai dengan
serapannya pada panjang gelombang 510 nm. penambahan enzim lalu diinkubasi selama 10
Setelah itu, ditentukan aktivitas spesifiknya. menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan
penambahan reagen folin Wu sebanyak 1.0 mL,
4

tutup dengan alumunium foil dan dididihkan terlalu panas maka mikroorganisme penghasil
selama 20 menit. Setelah itu, baca serapannya pada enzim invertase akan mati, sehingga enzim tidak
panjang gelombang 510 nm. akan diperoleh.
Selanjutnya, pemisahan enzim dilakukan
Prediksi Bobot Molekul Enzim Invertase dengan cara disentrifuge dengan kecepatan 12000
Pembuatan gel. Semua komponen untuk rpm selama 15 menit. Hal ini berguna untuk
running gel dicampur kecuali ammonium persulfat memisahankan pecahan dinding dinding sel dari
dan TEMED yaitu jenis larutan 10%, 14 mL supernatannya. Prinsip dari metode sentrifuge ini,
akrilamid+6 mL air, 5 mL tris HCl 3 M pH 8.9, 0.4 yaitu proses pemisahan ekstrak enzim yang
mL 10% SDS, 14.4 mL air akuades kemudian didasarkan pada berat molekul dengan
diaduk dengan magnetik stirer, aerasi dengan menggunakan gaya sentrifugal. Sehingga nantinya
vakum. Setelah itu, ditambahkan 0.4 mL amonium berat molekul yang ringan akan berada diatas dan
persulfat, dan 0.02 mL TEMED campur dan tuang yang berat berada dibawah (Koolman, 2000).
dalam plat kaca kurang lebih 4 cm. N-butanol Setelah disentrifuge, supernatan didekantasi dari
dimasukkan. Setelah gel membeku selama 1-2 jam, residu/pecahan dinding-dinding sel, maka hasil
n-butanol dibuang dan dicuci dengan running gel yang diperoleh berupa ektrak kasar enzim
overlay. Kemudian ditambahkan 1 mL running gel invertase yang berwarna cokelat. Berdasarkan
overlay dan dibiarkan hingga stacking gel siap. komposisi tersebut maka jumlah ekstrak kasar
Setelah siap, dua sumur diset dalam gel, masing- enzim invertase yang diperoleh sebanyak 18.02
masing dengan standard BM protein campuran dan gram.
yang kedua dengan invertase fraksi 3. Ekstrak kasar enzim invertase hasil
Prosedur elektroforesis SDS-page. optimasi ditentukan aktivitasnya dengan
Sampel protein dididihkan selama 90 detik, menggunakan assay Nelson’s dan kandungan
kemudian sampel disimpan pada 0oC hingga siap proteinnya menggunakan metode Lowry, diukur
digunakan. Sampel protein dan standar diambil aktifitas secara spektroskopi. Assay Nelson
sekitar 5µL dan diletakkan ke dalam sumur gel. berprinsip pada pengukuran jumlah gula pereduksi.
Setelah itu, sistem elektroforesis dirakit dan Pada metode ini aktivitas enzim invertase
dihubungkan ke dengan power supply (50-100 ditunjukkan oleh bertambahnya produk reaksi
volt). (glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat
Prosedur pewarnaan standar. Gel disimpan (fruktosa/ satuan waktu). Metode Lowry
dalam larutan fiksasi pewarnaan cepat, lalu didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen
digoyang perlahan-lahan. Larutan fiksasi diganti arsenomolibdat menghasilkan warna biru (Hasanah
dengan larutan pewarnaan coomasive blue Putra 2010).
kemudian digoyang selama 2-24 jam hingga
protein terlihat. Setelah itu larutan pewarnaan Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Assay
diganti dengan larutan destaining II hingga Nelson’s
baground gell jernih kemudian disimpan dalam Pembuatan Kurva Standar Gula Invert.
asam asetat 7% atau ddH2O. Sepuluh tabung disiapkan lalu diisi dengan
komposisi glukosa 4 mM pada tabung dua sampai
HASIL DAN PEMBAHASAN delapan berturut-turut; fruktosa 4 mM hanya pada
tabung sembilan; sukrosa 4 mM pada tabung
Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Invertase
sepuluh; dan H2O pada tabung satu sampai
Ragi roti digunakan sebagai sumber enzim
sepuluh. Setelah itu, masing-masing tabung
invertase pada isolasi ekstrak kasar enzim
ditambahkan 1 mL reagen Nelson’s, ditutup
invertase karena ragi banyak mengandung khamir
dengan alumunium foil lalu didihkan selama 20
Saccharomyces cereviseae. Isolasi diawali dengan
menit untuk memperjelas warna yang terjadi.
mencampurkan ragi roti sebanyak 10 gram dan
Setelah 20 menit, tabung didinginkan dengan hasil
pelarut toluen sebanyak 10 mL lalu diaduk.
diperoleh berupa padatan berwarana biru sampai
Selanjutnya, campuran tersebut dihomogenasikan
biru kehijauan. Semakin tinggi konsentrasi gula
dengan menggunakan homogenizer supaya lebih
invert, maka warna hijau semakin dominan. Untuk
merata. Pemecahan sel dilakukan setelah proses
melarutkan padatan tersebut maka reagen
inkubasi. Hal ini dikarenakan enzim invertase
arsenomolibdat ditambahkan sebanyak 1 mL,
termasuk enzim yang berada di dalam sel
dikocok dengan vorteks, dibiarkan 5 menit. Warna
(intraseluler), maka perlu dilakukan proses
larutan yang diperoleh, yaitu semakin tinggi
pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim
konsentrasi gula invert maka warna larutan
di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih
semakin biru pekat. Supaya campuran lebih encer
banyak. Proses pemecahan sel ini dilakukan
dan bisa diukur absorbansinya,lalu ditambahkan 7
dengan cara keras, yaitu dengan glassbed dan
mL H2O, dikocok lagi dengan vorteks. Pengukuran
digerus selama 30 menit. Inkubasi ragi dilakukan
absorbansi dilakukan secara spektroskopi pada
selama 30 menit dengan suhu inkubasi sebesar
panjang gelombang (λ) sebesar 540 nm.
50oC. Suhu diatur sebesar 50oC karena jika suhu
5

Kurva standar gula invert seperti pada aktifitas enzim terjadi pada range pH 3,0 - 5,0
gambar 1 dibuat dengan mengalurkan absorbansi dengan aktivitas maksimum terjadi disekitar pH
(A) terhadap konsentrasi larutan gula invert (M). 4,5. Diatas skala tersebut aktivitas enzim
Nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan mengalami penurunan. Semakin basa kondisi
semakin besarnya konsentrasi larutan gula invert hidrolisis menyebabkan semakin rendahnya harga
sehingga diperoleh persamaan garis antara aktivitas enzim invertase.
konsentrasi dan absorbansi yaitu y = 0,515x+ Perubahan pH dapat menyebabkan
0,00372 dengan r2 = 0,985. Persamaan tersebut turunnya aktivitas enzim akibat perubahan ionisasi
akan digunakan untuk menghitung konsentrasi gugus-gugus fungsionilnya karena gugus ionik
gula invert yang terbentuk. berperan penting dalam menjaga konformasi sisi
aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat
Gambar 1. Kurva standar aktivitas invertase ragi menjadi produk. Perubahan pH juga dapat
dengan assay Nelson’s menyebabkan enzim terdenaturasi sehingga
menyebabkan penurunan katalitik enzim.
Nilai R2 dari kurva diatas adalah 0.985, hal ini Denaturasi enzim dakibatkan karena terjadinya
menunjukkan bahwa kelinearan kurva standar pemutusan ikatan penstabil struktur (seperti ikatan
baik karena hampir mendekati +1, yang mana titik- ionik, hidrogen, hidrofobik) yang menghubungkan
titik pada kurva standar melewati garis lerengnya. antar polimer protein. Pemutusan tersebut dapat
Perbedaan pH berpengaruh terhadap 2 jenis, terjadi pada protein kwartener, tersier ataupun
yaitu struktur enzim dan gugus fungsional enzim. sekunder. Pada protein kwartener terjadi
Suatu enzim dapat menghasilkan produk yang pemutusan ikatan penstabil struktur karena
maksimal pada pH optimumnya. Aktivitas bentuknya yang merupakan gabungan antara
maksimum invertase yaitu pada pH 4,5 dengan globular satu dengan globular lainyya sehingga
aktivitas sebesar 1.2256 unit pada fraksi 1, 0.9568 dapat terjadi pemutus an ikatan tersebut pada
unit pada fraksi 2, dan 1.1232 unit pada fraksi 3. protein tersier satu dengan protein tersier lainnya
Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah dan terjadi seterusnya, pada protein tersier
yang menyebabkan pembentukan 2 µmol gula membentuk protein sekunder (Awwalurrizki
pereduksi per menitnya. Hasil pH optimum ini &Putra 2009).
sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh
Bergamasco et al. (2003), yang melaporkan bahwa
Tabel 1 Data unit enzim invertase dan unit aktivitas dalam fraksi (Total unit).
[glukosa] unit enzim
Tabun Rata- Total
Larutan A FP rata-rata
g invertase rata unit
µmol

B lanko 1 0 - - - - - -

2 0,114 2,1567 2,1561 1,2256 12 67,284 37,006


Fraksi 1
3 1,523 2,95 0,295 1,2 6,7284

103,334
4 0,851 1,645 1,645 0,9568 24 56,834
Fraksi 2 4

5 1,387 2,686 0,2686 2,4 10,3334

6 1,013 1,959 1,959 1,1232 24 60,6528 33,359


Fraksi 3
7 1,484 2,874 0,2874 2,4 6,0653

Standar 8 -0,063 -0,129 - - - - -


glukosa 9 0,268 0,513 - - - - -

Pada percobaan ini menunjukkan bahwa


unit aktivitas tertinggi ada pada fraksi dua sebesar
6

56.824, sedangkan unit enzim invertase tertinggi total merupakan pengukuran kandungan nitrogen
adalah pada fraksi 1 dimana fraksi satu merupakan (N) dalam sampel. Oleh karena itu, terdapat
ekstrak kasar enzim invertase dan fraksi 3 senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan
merupakan fraksi yang dimurnikan pada enzin terkalkulasi. Namun, interferensi ini relatif kecil
invertase. dan dapat diabaikan.

Penentuan Kadar Protein dengan Metode


Lowry Gambar 2 Kurva standar BSA.
Pembuatan kurva standard. Sepuluh
tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi Metode Lowry-Folin hanya dapat
standard BSA pada tabung 2 sampai 10; H2O dari mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat
tabung 1 sampai 10; reagen C (campuran dari mengukur molekul peptida panjang (Alexander &
reagen A dan B) pada semua tabung. Fungsi dari Griffiths 1992). Prinsip kerja metode Lowry
reagen ini adalah unuk membentuk kompleks adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+
Biuret. Setelah itu, semua tabung dikocok dengan oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat
vorteks, diinkubasi 10 menit pada suhu ruang. dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan
Penambahan reagen harus diatur dengan baik. fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E)
Pada saat sepuluh menit terakhir ditambahkan 0.5 membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap
mL reagen D ke tabung pertama dan seterusnya. cahaya. Protein merupakan polimer heterogen
Kemudian dicampur dengan vorteks, diinkubasi molekul-molekul asam amino. Protein yang
selama 30 menit pada suhu ruang lalu dibaca terkandung dalam kedelai merupakan protein
serapannya pada panjang gelombang 700 nm. globuler. Dalam protein globuler, rantairantai
Kurva standar pada gambar 2 dibuat dengan samping hidrofil dan polar berada di bagian luar
mengalurkan absorbansi sebagai ordinat (sumbu- dan rantai samping hidrofob dan nonpolar berada
Y) dan konsentrasi larutan BSA sebagai absis di bagian dalam.
(sumbu-X). Nilai absorbansi mengalami kenaikan Pada percobaan ini didapat kadar protein
dengan semakin bertambahnya konsentrasi larutan paling tinggi adalah pada fraksi II yaitu sebesar
BSA sehingga diperoleh persamaan garis, yaitu 0,0225 mg/mL sedangkan paling kecil adalah pada
y=0,0323x + 2,2497x10-3 dan faktor korelasi fraksi III sebesar 0,0015 mg/mL. Hal ini
sebesar 0,9416. Persamaan yang diperoleh dikarenakan pada fraksi III sudah dilakukan
digunakan untuk menentukan kandungan protein. perlakuan terus-menerus atau paling banyak
Kandungan protein yang diukur dalam sehingga kadar proteinnya paling kecil. Sementara
penelitian ini adalah protein terlarut dan protein itu kandungan protein Total pada fraksi II juga
total. Protein terlarut merupakan oligopeptida dan tertinggi (1,0328) dan fraksi III paling rendah
mudah diserap oleh sistem pencernaan. Protein (0,0608).

Tabel 2 Data jumlah protein, total protein, dan aktivitas spesifik enzim invertase.
Laruta protein [protein] Rata- Total Rata- Aktivitas
Tabung A
n (µg) (mg/mL) rata protein rata Spesifik

Blanko 1 0 - -

2 -0,007 -0,286 -0,0057 0,6975


Fraksi 0,015
3 0,12 3,646 0,0182 0,1744 0,3139 80,387
1 5
4 0,208 6,369 0,0127 0,0698

5 0,037 1,076 0,0215 2,295


Fraksi 0,025
6 0,048 1,416 0,0071 0,574 1,0328 37,522
2 5
7 0,775 23,924 0,0478 0,2295

Fraksi 8 -0,011 -0,41 -0,0082 0,001 0,135 0,0608 748,8


3 5
9 -0,004 -0,1935 -0,00096 0,0338
7

10 0,027 0,766 0,0015 0,0135

Dari hasil keseluruhan aktivitas spesifik dari persamaan regresi y=1,720x – 0,914,
fraksi III paling besar (748,8) dibandingkan fraksi maka diperoleh Vmaks = -1,0940 µgram/ menit dan
yang lain. Dari konsentrasi tersebut didapat yield Km = -1,8818 mM
enzim sebesar 90,14%, sedangkan fold enzimnya Aktivitas enzim invertase yang mula-mula
sebesar 931,49%. Yield enzim merupakan meningkat secara signifikan sejalan dengan
perbandingan antara total unit dalam fraksi yang meningkatnya konsentrasi substrat, tetapi tidak
dimurnikan dengan total unit dalam ekstrak kasar, signifikan setelah konsentrasi substrat ditingkatkan
sedangkan fold enzim merupakan perbandingan lagi. Hal ini terjadi karena suatu reaksi enzimatis
antara aktivitas spesifik dari fraksi yang akan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi
dimurnikan dengan aktivitas spesifik ekstrak kasar. substrat [S], akan tetapi setelah [S] meningkat
lebih lanjut akan sampai pada kecepatan yang
Penentuan kinetika enzim tetap. Pada kondisi dimana kecepatan reaksi
Penentuan kinetika enzim invertase (Vmaks enzimatis tidak dapat bertambah lagi dengan
dan Km) didasarkan atas plot grafik hubungan bertambahnya [S] disebut kecepatan maksimum
antara konsentrasi substrat [S] dan aktivitas enzim (Vmaks) (Wiesman, 1989).
(V) (Fayyaz et al. 1995; Dinu 2001). Larutan
substrat sukrosa dibuat dengan konsentrasi antara
0.02-0.4 dengan interval 0.02 dan 0.1 dalam Gambar 3 Kurva hubungan antara kecepatan dan
konsentrasi substrat (Michaelis Menten)
larutan buffer asetat 0,2 M pH 4.5 lalu dilakukan
pengujian aktivitas enzim sesuai prosedurnya.
Setelah itu ditentukan aktivitas enzim (µmol gula Gambar 4 Kurva hubungan antara 1/V dan 1/S
pereduksi/ menit) pada masing-masing konsentrasi (Lineweaver burk)
substrat.
Penentuan Vmaks akan menghasilkan
Selanjutnya dibuat tabel V dan [S] dan gambaran tentang sifat-sifat kinetika enzim lain, ½
dikonversi menjadi 1/V dan 1/[S] serta dibuat plot Vmaks, yaitu suatu konsentrasi substrat yang
grafik hubungan antara 1/V dan 1/[S]. Lalu separuh lokasi aktifnya telah terisi atau bila
ditentukan nilai Vmaks dan Km yang didasarkan kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai
atas persamaan kurva Lineweaver-Burk (Whitaker, setengah dari kecepatan maksimum, yang dikenal
1996), dengan cara: dengan Km (tetapan Michaelis-Menten). Nilai Km
- Bahwa dari persamaan: 1/V = 1/Vmaks + Km/ digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga
Vmaks.(1/[S]) berhubungan dengan tetapan keseimbangan
- Bila 1/V = Y dan 1/[S] = X, maka rumusnya disosiasi kompleks E-S menjasi E dan S. Fayyaz
dapat ditulis menjadi: Y = a + bX, sehingga: (1995) menambahkan bila nilai Km kecil berarti
a = 1/Vmaks dan b = Km/Vmaks kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap
- Dengan demikian, bila harga 1/Vmaks diketahui substrat tinggi, sedangkan bila nilai Km besa
maka nilai Vmaks didapat, begitu pula nilai Km afinitasnya menjadi rendah. Harga Km enzim
akan juga didapat dari persamaan b = Km/Vmaks. sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat,
Aktivitas enzim invertase pada beberapa keadaan lingkungan dan kekuatan ion. Pada
konsentrasi substrat (Tabel 3) menunjukkan bahwa percobaan kali ini didapat Vm negatif artinya
konsentrasinya mula-mula meningkat secara reaksi berjalan sangat lamabat atau mungkin tidak
signifikan sejalan dengan meningkatnya berjalan sama sekali. Hal ini karena kurva yang
konsentrasi substrat. Penentuan Vmaks dan Km dihasilkan tidak hiperbolik yang disebabkan saat
didasarkan atas persamaan garis regresi grafik penambahan enzim ke tabung kurang tepat dengan
hubungan antara 1/[S] dan 1/V (Tabel 3), interval waktunya.
seperti disajikan pada Gambar 4. Selanjutnya
Tabel 3 Data kecepatan da konsentrasi substrat sukrosa

Tabun
A [sukrosa] µmol V 1/V [S] 1/[S]
g

1 0 0 0 0 0 0

2 0,046 0,082 0,0082 121,95 0,0143 69,93


8

3 0,107 0,201 0,0201 49,75 0,0386 34,97

4 0,111 0,208 0,0208 48,08 0,0429 23,31

5 0,191 0,364 0,0364 27,47 0,0571 17,51

6 0,241 0,461 0,0461 21,69 0,0714 14,01

7 0,501 0,996 0,0996 10,35 0,1429 6,99

8 0,826 1,596 0,1596 6,27 0,2857 3,50

Stacking gel mempunyai fungsi untuk


Prediksi bobot molekul enzim invertase mengumpulkan sampel yang akan dipisahkan
Prinsip dasar SDS-PAGE adalah sehingga memungkinkan cuplikan untuk bergerak
makromolekul bermuatan akan bermigrasi dalam bersama-sama dan membentuk suatu pita cuplikan
medan listrik dengan laju yang ditentukan oleh yang pekat. Resolving gel mempunyai fungsi
ukuran dan muatannya. Sebelum protein untuk terjadinya pemisahan yang lebih baik
dijalankan dalam medan listrik, protein terlebih sehingga memungkinkan terjadi perbedaan gerak
dahulu akan didenaturasi dengan perubahan yang jelas terlihat antara spesies dengan molekul
kondisi yang tajam misalnya panas, adanya agen besar dan spesies dengan molekul yang lebih kecil.
pereduksi, penambahan deterjen dan lain-lain, Fungsi buffer elektroforesis untuk
kemudian akan dibungkus dengan deterjen anionik mempertahankan pH di dalam reservoir dan gel
yaitu SDS. Muatan asli molekul protein akan serta sebagai elektrolit pembawa aliran listrik.
ditimpa oleh molekul SDS yang bermuatan Oleh karena itu pemilihan buffer harus memenuhi
negatif. Adanya 2-merkaptoetanol dapat kriteria antara lain: pemilihan buffer didasarkan
membantu denaturasi protein dengan cara pada tidak adanya interkasi yang terjadi antara
mereduksi semua ikatan disulfide. buffer dengan makromolekul yang dipisahkan, pH
SDS dilakukukan pada pH netral. Pada yang digunakan tidak mengakibatkan denaturasi
metode ini digunakan SDS dan β-merkaptoetanol. protein (kisaran yang digunakan untuk protein
SDS bersama β-merkaptoetanol dan pemanasan biasanya 4.5-9.0, kekuatan ionik dan konsentrasi
menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi buffer harus diperhitungkan dengan tepat
protein menjadi konfigurasi random coil. Hal ini (kekuatan ionik biasanya berkisar 0.05-0.15).
disebabkan oleh pecahnya ikatan disulfida yang Sistem buffer kontinyu adalah gel yang
selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus digunakan dalam satu slab terdiri dari dua gel yaitu
sulfhidril. Denaturasi protein adalah suatu keadaan stacking gel dan separating gel. Buffer dan
dimana terjadi perubahan konformsi protein. konsentrasi akrilamid yang digunakan pada kedua
Perubahan ini meliputi proses destruksi ikatan gel tersebut berbeda. Pada stacking gel digunakan
pada struktur sekunder sehingga konformasi buffer dengan pH 6.8 dan konsentrasi akrilamid
protein asli berubah tetapi ikatan kovalen pada rendah. Sedangkan pada separating gel digunakan
polipeptida tidak mengalami kerusakan. SDS buffer dengan pH 8.8 dan konsentrasi akrilamid
merupakan deterjen anionik, memiliki gugus ion tinggi. Sehingga protein akan terkonsentrasi pada
sulfat dan rantai alkil lipfoilik yang menyebabkan stacking gel dan akan mengalami resolusi yang
peptida dan protein tidak saling berikatan yang tinggi pada separating gel. Hal ini menghasilkan
dinamakan denaturasi. SDS mengelilingi peptida pemisahan yang baik dan pita tajam.
atau protein sehingga bermuatan negatif, kemudain Pewarnaan berfungsi untuk memperjelas
semua peptida dan protein dalam campuran akan pita protein hasil pemisahan dengan elektroforesis.
bermigrasi menuju anoda yang pergerakannya Pewarna yang digunakan harus dapat bereaksi
tidak dipengaruhi oleh bentuk. Hal ini disebabkan dengan molekul sampel yang dipisahkan, tetapi
karena adanya denaturasi yang mengakibatkan tidak bereaksi dengan gel elektroforesis. Ikatan
bentuk molekul seragam yaitu berbentuk rantai antara pewarna dan gel bukan ikatan kovalen
lurus yang kemudian diselimuti oleh SDS sehingga sehingga mudah dilepaskan oleh pencucian yang
bermuatan negatif. Pergerakan protein merupakan intensif dan penyinaran.
fungsi dari berat molekulnya, dimana kompleks
SDS-protein yang lebih besar mempunyai

mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan


kompleks yang lebih kecil.
9

tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer,


tetapi juga sangat sensitif terhadap perbedaan
muatan dan berat molekul yang cukup kecil
(Bachrudin, 1999). Protein yang dialirkan dalam
medium yang menagndung medan listrik maka
senyawa-senyawa yang bermuatan akan bergerak
dalam larutan sebagai akibat dari sifat polaritas
yang berlawanan, maka mobilitas suatu molekul
meupakan fungsi dari bentuk, ukuran molekul, dan
besar tipe muatan.
Penggunaan SDS dan merkaptoetanol
disertai dengan pemanasan akan memecah struktur
Gambar 5 Hasil elektroforesis SDS PAGE tiga dimensi dari protein, terutama ikatan disulfida
menjadi subunit-subunit polipeptida secara
Adapun pengamatan yang sudah diujikan, individual. SDS juga membungkus rantai protein
tampak jelas terlihat laju migrasi dan berbedaan yang tidak terikat dengan muatan negatif yang
gerak yang jelas terlihat antara spesies dengan sama membentuk kompleks SDS-protein.
molekul besar dan spesies dengan molekul yang Kompleks SDS protein mempunyai densitas
lebih kecil, dan dengan menggunakan pewarnaan muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya
tampak terlihat jelas proses pemisahan pita protein berdasarkan ukuran protein. Jadi kompleks SDS-
hasil elektroforesis. protein yang lebih besar mempunyai mobilitas
Sampel yang dimasukan ke dalam sumur yang lebih rendah dibandingkan dengan kompleks
pada stacking gel akan terkonsentrasi atau SDS-protein yang lebih kecil.
tertumpuk dan tidak mengalami pemisahan
meskipun dibawah pengaruh medan listrik, hal ini SIMPULAN
disebabkan karena pori gel berukuran besar (4% Berdasarkan hasil percobaan diperoleh
akrilamid). Mobilitas ion pada stacikng gel secara kesimpulan bahwa aktivitas optimum invertase
berurutan adalah ion klorida, protein kemudian ion dalam mendegradasi sukrosa menjadi gula invert
glisin. Ketika pergerakan mencapai separating gel, adalah pada kondisi pH 4,5. Berbagai pengujian
konsentrasi glisin meningkat akibat peningkatan seperti aktivitas, kadar, kinetika dan bobot
pH sehingga mobilitasnya menurun akibat adanya molekulnya, dari aktivitasnya ternyata fraksi I
ukuran pori yang semakin kecil. Dengan demikian memiliki konsentrasi dan aktivitasnya lebih besar
pergerakan ion pada separating gel secara dari yang lain (1.2256 unit/menit), hal ini
berurutan adalah ion klorida, ion glisin, dan disebabkan pada fraksi I masih fresh. Sedangkan
protein. pengamatan kadar protein memiliki konsentrasi
Hasil running dari masing-masing larutan sampel yang dihitung dengan bantuan
sampelnya diekstrak dari sel-sel mikroorganisme. kurva standar yang tertinggi ialah dari fraksi II
Dua macam konsentrasi ini dipilih untuk sebesar 0,0255 mg/mL. Dengan data mengenai
membedakan antara populasi mikroorganisme aktvitas dan kadar pada fraksi II memperkuat
yang resisten dengan yang tidak resisten. Pola Pita literatur yang menyatakan bahwa konsentrasi
protein hasil running dengan menggunakan gel enzim dapat mempengaruhi aktivitas enzim,
polyakrilamid seperti terlihat pada Gambar 2. ditandai dengan semakin banyaknya substrat yang
Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berubah menjadi produk melalui proses enzimatis.
berat molekul dari campuran polypeptida (Hames Besarnya fold enzim dan yield enzim berturut-turut
& Rickwood 1990). Marker protein yang adalah 931,49% dan 90,14%, sedangkan Vmaks =
digunakan memiliki rentang berat molekul 212 -1,0940 µmol/mL.menit dan Km = -1,8818 mM.
kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat Dan untuk mengetahui bobot molekulnya
sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan menggunakan elektroforesis dengan metode SDS-
berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan PAGE dimana protein akan bermigrasi dengan
dan intensitas warna yang lebih besar dialiri arus listrik, dan yang memiliki molekul
dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap besar akan tetap diam.
variaetas disebut protein mayor. Pada hasil
elektroforesis di atas terdapat beberapa buah DAFTAR PUSTAKA
protein mayor pada. Berat molekul dari protein Acosta N, Beldarrain A, Alonso Y. 2000.
mayor ini berkisar 148,7 kDa, 121,6 kDa, dan 105 Characterization of recombinant invertase
kDa. expressed in methylotropic yeasts
Alasan elektroforesis digunakan dalam Biotechnology and Applied Biochemistry 32:
penelitian ini karena memiliki peran sangat penting 179-187
dalam proses pemisahan molekul-molekul biologi,
khususnya protein. Karena disamping metode
10

Alexander RR, Griffiths JM. 1992. Basic content across a range of sugarcane varieties.
Biochemical Methods. New York: Wiley- Aust. J. PlantPhysiol 25 : 499-502.
Liss.
Hames, B.D & Rickwood.1990. A Practical
Awwalurrizki N, Putra SR. 2009. Hidrolisis Approach: Gel elektrophoresis protein.
Sukrosa dengan enzim invertase untuk Huntington: Robert E Krieger Publishing
produksi etanol menggunakan Zymomonas Company
mobilis [skripsi]. Surabaya: Fakultas
matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Hasanah EN, Putra SR. 2009. Karakterisasi
Institut Teknologi Sepuluh Nopember ekdtrak kasar enzim invertase yang
dimobilisasi dengan Na-Alginat [skripsi].
Bachrudin. Z. 1999. Petunjuk Laboratorium: Surabaya: Fakultas matematika dan Ilmu
Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein. pengetahuan Alam, Institut Teknologi
PAU Bioteknologi: UGM Yogyakarta Sepuluh Nopember.

Bergamasco R., Bassetti FJ, Moraes FF, Zanin Kim J.Y., Mahe A, Brangeon J, Prioul JL. 2000.
GM. 2000. Characterization of free and Amaize vacuolar invertase , IVR2, is induced
immobilized invertase regarding activity and by water stress. Organ/tissue specificity and
energy of activation. Brazilian Journal of diurnal modulation of expression. Plant
Chemical Engineering 17: 873-880 Physiol 124:71-84.

Bergamasco R, Akgol S, Bulut A, Denizli A, Koch, K. E. (1996) Carbohydrate modulated gene


Yakub A.M. 2003. Covalent immobilization expression in plants. Annu. Rev. Plant
of inverase onto a reactive film composed of Physiol.Plant Mol. Bio. 47:509-540.
2- hydroxyethyl methacrylate and glycidyl
methacrylate. Biochemical Engineering Koolman J, Rohm KH. 1994. Atlas Berwarna Dan
Journal 14:117- 126 Teks Biokimia. Wanandi SI; penerjemah.
Terjemahan dari: Color Atlas Of
Bucke C. 1987. Cell immobilization in calcium Biochemistry. Jakarta: Hipokrates.
Alginate. Methods in Enzymology 135: 175-
189 Lee WC, Huang CT. 2000. Modelling of mobilis
ATTC 10988 grown on the media containing
Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose glucose and fructose. Biochemical
phosphate synthase expression at the cell and Engineering Journal 4: 217-227
tissue leve1 is coordinated with sucrose sink-
tosource transitions in maize leaf. Plant Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid
Physiol 111 : 1021-1029. ke-1. Maggy Thenawidjaja; penerjemah.
Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry.
Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acid Erlangga: Jakarta
and pectins by polygalacturonase from
Aspergillus niger. Roum Biotechnol 6 (5) : Lunn JE, Hatch MD. 1997. The role of sucrose
397-402. phosphate synthase in the control
photosynthate partitioning in Zea mays
Fayyaz A, Asbi BA, Ghazali HM, Che-Man YB, leaves. Aust. J. Plant Physiol 24 : 1-8.
Jinap S. 1995. Kinetics of papaya
pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 : Narita V. 2005. Saccharomyces cerevisiae
129-135. Superjamur yang Memiliki Sejarah Luar
Biasa. Jakarta: Pustaka Utama.
Fung RW, Kamper GL, Gardner RC, MacRae E.
2003. Differential expression within an SPS Ohto M, Onai K, Furkawa Y, Aoki E, Araki T,
gene family. Plant Sci 164:450-470 Nakamura A. 2001. Effect of sugar on
vegetative development and floral transition
Grof CP, Huber JL, McNeil SD, Lunn LE, in Arabidopsis Plant Physiol. 127 : 252-261.
Campbell JA. 1998. A modified assay
method show leaf sucrose phosphate synthase Wiseman A. 1989. Handbook of Enzyme
activity is correlated with leaf sucrose Biotechnology. 2nd. Edition. New York: Ellis
Howard.