Anda di halaman 1dari 9

PEMBAHASAN Pada percobaan kali ini tentang pemisahan albumin dan globulin dari serum darah dengan cara

elektroforesis kertas. Dengan tujuan memisahkan albumin dan globulin serum darah dengan metode fraksionasi dengan ammonium sulfat; memurnikan albumin dan globulin dengan menggunakan metode filtrasi gel; memisahkan komponen-komponen albumin dan globulin dengan menggunakan metode elektroforesis kertas. Serum adalah plasma darah (mengandung sekitar 90% air) tanpa fibrinogen. Serum darah terdiri dari protein (yang tidak digunakan untuk pembekuan darah) termasuk cairan elektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan semua substansi exogenous. Protein yang terdapat dalam serum terdiri dari albumin, -globulin, -globulin, dan -globulin. Protein globulin yang terdapat pada serum memiliki berbagai fungsi bioligik, Diantaranya -globulin yaitu transkobalamin yang mengangkut vitamin B12 dan transkortin yang mengangkut kortisol, globulin bertanggungjawab untuk transport besi bervalensi tiga dalam plasma, -globulin merupakan glikoprotein yang berperan pada reaksi imun sehingga disebut immunoglobulin (IgG). Sedangkan albumin berperan besar untuk ikatan protein obat. Prosedur pertama yaitu fraksionasi dengan ammonium sulfat. Serum darah 1 mL ditambahkan ammonium sulfat jenuh 1 mL pertetes sambil diaduk. Penambahan pertetes sambil diaduk ini bertujuan agar pencampurannya merata. Kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Disentrifugasi juga agar reaksinya lebih sempurna dimana sentrifugasi merupakan pemisahan berdasarkan kecepatan sedimentasi komponen protein akibat adanya gaya sentrifugal. Selanjutnya dipisahkan supernatan albumin dari endapan globulin dengan cara didekantasi. Kemudian endapan globulin dicuci dengan ammonium sulfat 50% dan kembali didekantasi. Pencucian ini bertujuan untuk melarutkan atau mengikat ammonium sulfat atau pengotor yang tidak berikatan dengan albumin. Endapan globulin yang didapat selanjutnya dilarutkan dengan 2 mL air. Pelarutan dengan air ini agar dapat dilakukan untuk proses selanjutnya yaitu desalting. Sehingga hasilnya adalah supernatant albumin dan larutan globulin. Prosedur pertama ini yaitu untuk memisahkan protein dengan cara pengendapan dengan penambahan larutan garam berkonsentrasi tinggi yang biasa disebut dengan salting out. Protein mempunyai struktur yang tidak stabil sehingga mudah mengalami denaturasi yang meliputi presipitasi dan koagulasi. Albumin merupakan protein yang larut dalam air sedangkan globulin mempunyai sifat sukar larut dalam air. Akan tetapi didalam serum yang mengandung kedua protein (albumin dan globulin) ini ditambahkan garam ammonium sulfat 50%, maka protein akan terdenaturasi atau daya larut globulin akan berkurang sehingga globulin akan terpisah sebagai endapan. Denaturasi protein ini dipengaruhi oleh adanya garam logam berat, pH, panas, perubahan tipe pelarut, dll. Pada denaturasi terjadi perubahan terhadap struktur sekunder, tersier, dan kuarterner molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan kovalen sehingga terkadang dapat berlangsung secara reversible dan dapat mengalami renaturasi atau penyusunan kembali molekul protein. Dimana globulin akan mengendap pada penambahan garam ammonium sulfat 50% sedangkan albumin akan larut pada penambahan ammonium sulfat 50%. Pengendapan dapat terjadi karena saat ammonium sulfat 50% ditambahkan pada larutan protein, ion-ion garam ammonium sulfat menarik molekul air dan albumin menjauh dari globulin. Hal ini disebabkan ion-ion pada garam ammonium sulfat memiliki muatan berat jenis yang lebih besar dibanding protein, sehingga ketika ditambahkan akan berikatan dengan molekul air dan albumin yang dapat memaksa globulin berinteraksi dan ketika penambahan ammonium sulfat dalam jumlah cukup menyebabkan globulin terpresipitasi.

Prosedur selanjutnya yang kedua yaitu proses desalting. Kolom disiapkan dalam keadaan bersih dan kering. Kemudian didalam kolom dilapisi dengan larutan natrium klorida1%. Selanjutnya kolom diisi dengan sedikit kapas dan matriks spadex G-25 setinggi 12 cm lewat dinding kolom dan dielusi dengan natrium klorida 1 %. Penambahan kapas bertujuan untuk menahan matriks keluar dari kolom. Digunakan matriks spadex G-25 karena Matriks diatur hingga kompak dengan tetesan yang konstan. Kemudian sampel albumin dimasukkan kedalam kolom yang sudah berisi kapas, matriks dan larutan natrium klorida sedikit diatas matriksnya. Eluat ditampung kedalam 8 fraksi (tabung reaksi), tiap fraksi berisi 1 mL. tiap fraksi diteteskan pada kertas saring, lalu nodanya diwarnai dengan bromfenol biru. Fraksi dengan noda terpekat selanjutnya dipakai untuk proses elektroforesis.
Pada kolom filtrasi gel, pengembangan endapan isoelektrik bisa menjadi gangguan. Agregat dapat menyumbat kolom, atau diendapkan dan terjebak. Mereka tetap di belakang hingga garam dihapus dari campuran protein asli menangkap dan pelarutan kembali endapan. Penghilangan garam dri gel filtrasi hanya mungkin tidak bekerja di bawah kondisi ini. Presipitasi isoelektrik protein berkelarutan rendah dapat ditingkatkan dengan masuknya zat terlarut yang berkelarutan lebih tinggi. Jadi pelarut organik atau polietilen glikol bersama-sama dengan penyesuaian pH dapat menghasilkan endapan yang diinginkan. Salah satu contoh dari metode dalam pemurnian ragi fosfofruktokinase. Peningkatan kelarutan (pada pH tertentu dan suhu tertentu) dengan peningkatan konsentrasi garam dikenal sebagai "salting in". Kebalikan dari proses ini, dengan pengenceran atau dialisis, adalah lebih mungkin berguna dalam pemurnian enzim. Sebuah penggaraman khas dalam kurva untuk protein murni, sedangkan stepness dari respon terhadap garam mungkin cukup untuk mendorong pengendapan dengan pengenceran. Point Catatan Praktek Presipitat isoelektrik kebanyakan agregat protein yang berbeda dan mungkin termasuk partikulat fragmen dan kompleks protein asam nukleat. Jika komposisi awal larutan berubah, sebuah enzim yang diinginkan mungkin tidak memperlihatkan perilaku kelarutan yang sama. Endapan isoelektrik biasanya terjadi dengan menurunkan pH di bawah pH fisiologis, pastikan enzim stabil pada pH yang dibutuhkan. Menjaga suhu rendah akan meningkatkan kemungkinan stabilitas dan penurunan kelarutan. Namun, jika menyesuaikan pH di 0 oC, jangan lupa untuk standarisasi pH meter pada suhu ini, dengan menggunakan buffer standar es dingin. Singkatnya, penggaraman dalam rentang dapat dimanfaatkan dalam pemurnian dalam dua cara yang berbeda. Pertama, agregasi dapat terjadi dengan pengenceran atau dialisis, dan jika enzim yang diperlukan hadir dalam pemurnian agregat berguna akan telah dicapai. Kedua, curah isoelektrik dapat digunakan, mengeksploitasi variasi kelarutan dengan pH, tanpa mengubah kekuatan ion. Dalam situasi baik, adalah enzim yang diperlukan tetap dalam larutan, dengan tingkat pemurnian dicapai biasanya minimal sejak proporsi yang relatif kecil dari total protein yang mungkin dalam endapan. Dalam hal ini, apa yang terjadi hanya membersihkan ekstrak

Prosedur selanjutnya yang ketiga yaitu proses elektroforesis kertas. Kertas saring yaitu selulosa asetat diberi garis dan ditotolkan 3 totolan (A=albumin; G=globulin; S=serum darah) menggunakan pensil ditengahnya secara melebar. Sampel ditotolkan pada masingmasing jenis totolan. Kertas yang sudah mengandung noda ini ditempatkan kealat elektroforesis yang didalamnya mengandung buffer. Kemudian alat elektroforesis diatur dan dinyalakan. Didiamkan selama 22 jam. Selanjutnya kertas diangkat dan diwarnai dengan bromfenol biru, dikeringkan dan noda dicuci dengan asam asetat. Pergerakan noda diidentifikasi. Elektroforesis merupakan metode pemisahan komponen protein didalam medan listrik yang elektroda dari protein bergerak ke muatan yang berlawanan. Pada dasarnya proses elektroforesis menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap pergerakan partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan, dalam hal ini termasuk protein. Molekul atau partikel tersebut akan bergerak (terjadi pemisahan) berdasarkan ukuran berat atau muatan listrik yang

dikandung pada protein. Proses elektroforesis pada praktikum ini pemberian garis pada kertas saring menggunakan pensil. Pensil ini bersifat inert atau tidak mudah bereaksi, sehingga noda pensil yang terbentuk tidaka akan bergerak atau tidak akan mempengaruhi proses elektroforesis. Menggunakan kertas selulosa asetat sebagai media tempat bermigrasinya partikel. Kertas selulosa asetat harus dijaga agar tetap bersih, misalnya terbebas dari sentuhan tangan karena dapat meninggalkan lemak dan mengganggu aliran listriknya. Selain kertas selulosa asetat, media lain yang digunakan adalah larutan bufer. Larutan bufer yang berfungsi sebagai jembatan konduksi antara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran listrik. Selain itu bufer dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat. Analisis elektroforesis kertas menggunakan indicator brom fenol biru, agar pemisahan zat warna dapat diamati dengan jelas. Berikut struktur kimia dari brom fenol biru : www.chemicalbook.com Gambar 4. bromfenol biru Molekul-molekul yang akan di pisahkan (running) tersebut diteteskan pada masing-masing kertas selulosa asetat dengan jarak tertentu, kemudian ditempatkan pada alat elektroforesis dan ditambahkan larutan bufer selanjutnya di running. Sebelum di running beberapa molekul sudah terpisah terlebih dahulu, hal ini mungkin disebabkan tetesan molekul tersebut terlalu besar atau pekat atau penambahan larutan bufer terlalu banyak, sehingga larutan tersebut berdifusi dengan cepat ke kertas selulosa asetat dan menyebabkan pigmennya pun ikut berdifusi. Proses running harus dilakukan searah dengan serat kertas agar proses migrasinya berjalan dengan sempurna menuju ke suatu elektroda. Berdasarkan hasil pengamatan, semua molekul yang dianalisis pada praktikum ini memiliki muatan negatif yang ditandai oleh pergerakan ion menuju kutub positif. Gambar. pergerakan elektroda menuju muatan yang berlawanan Perbedaan molekul yang di running tersebut terletak dari pemisahan warna dan jarak pergerakannya dari titik awal. Indikator bromfenol biru, diteteskan pada masing-masing noda. Brom phenol blue menunjukkan pemisahan warna menjadi biru tua. Terdapat beberapa kesalahan yang terjadi pada metode elektroforesis kertas ini. Hal-hal yang dapat mempengaruhi dalam proses elektroforesis kertas yaitu pergerakan noda dengan pembuatan spot sangat mempengaruhi hasil elektoforesis karena akan mengganggu pemisahan zona-zona. Spot yang terlalu besar akan menyebabkan hasil running menjadi tidak beraturan. Ukuran spot terlalu kecil makan hasil running akan sulit diamati. Proses running elektroforesis memerlukan medium untuk menghantarkan listrik. Medium yang digunakan adalah buffer bromfenol biru. Bufer ini akan membasahi kertas dan menyebabkan kertas dapat menghantarkan listrik selama proses running. Spot bergerak dengan arah menuju kutub positif atau negatif. Selain itu, pada saat proses pencelupan kertas ke bufer elektroforesis harus dilakukan secara bersamaan, jika kedua ujung tidak bersamaan tercelup ke bufer maka hasil running akan cenderung bergerak menjauhi kertas yang terbasahi oleh bufer lebih banyak. Proses pemberian arus listrik yang tidak konstan juga akan membuat hasil kurang valid. Selain itu, kecepatan gerakan molekul juga berbanding lurus dengan besarnya voltase yang digunakan.

Serum darah Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas Belum Diperiksa

Struktur 3D hemoglobin, sebuah protein globular.

Di dalam darah, serum (bahasa Inggris: blood serum) adalah komponen yang bukan berupa sel darah, juga bukan faktor koagulasi; serum adalah plasma darah tanpafibrinogen, (bahasa Latin: serum) [1] berarti bagian tetap cair dari susu yang membeku pada proses pembuatan keju. Serum terdiri dari semua protein (yang tidak digunakan untuk pembekuan darah) termasuk cairan elektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan semua substansiexogenous. Rumusan umum yaitu: serum = plasma - fibrinogen - protein faktor koagulasi. Studi yang mempelajari serum disebut serologi. Serum digunakan dalam berbagaiuji diagnostik termasuk untuk menentukan golongan darah. Daftar isi [sembunyikan] 1 Serum protein o 1.1 Serum albumin o 1.2 Serum globulin o 1.3 Serum lipoprotein o 1.4 Serum wewenang 2 Rujukan [sunting]Serum protein Serum protein (bahasa Inggris: globular protein, spheroprotein) merupakan salah satu dari tiga jenis protein di dalam tubuh yang terbentuk dari asam amino berupa larutan koloidal di dalam plasma darah. Protein (bahasa Yunani: - proteios) berarti utama (bahasa Inggris:first rank). Serum protein tidak mengandung fibrin (bukan merupakan fibrous protein) sehingga dapat terlarut. Total serum protein dalam darah sekitar 7,2 - 8 g/dl[2] atau sekitar 7% dari volume darah keseluruhan dengan berbagai kegunaan:  Sirkulasi molekul lipida, hormon, vitamin dan zat besi  Enzim, komponen komplemen, protease inhibitor dan kinin precursor  Regulasi aktivitas, fungsional non seluler dalam sistem kekebalan. Total serum protein dapat melonjak karena: infeksi kronis (termasuk tuberkolosis, Adrenal cortical hypofunction , disfungsi hati, Collagen Vascular Disease (Rheumatoid Arthritis, Systemic Lupus, Scleroderma), gejala hipersensitivitas, Sarcoidosis, dehidrasi (diabetic acidosis, chronic diarrhea, dll.), Respiratory distress, Hemolisis,Cryoglobulinemia, Alcoholism, Leukemia dan menurun antara lain disebabkan oleh: Malnutrition dan malabsorption (insufficient intake and/or digestion of proteins), Liver disease (insufficient production of proteins), Diare(loss of protein through the GI tract), Severe burns (loss of protein through the skin), Hormone Imbalances that favor breakdown of tissue, Loss through the urine in severe kidney disease (proteinuria), Kehamilan (dilution of protein due to extra fluid held in the vascular system) Kadar Protein darah % Kegunaan normal level Serum albumin 3.5-5.0 g/dl 60% memelihara tekanan pengusung molekul lain osmosis dan

Immunoglobulin 1.0-1.5 g/dl Fibrinogen 0.2-0.45 g/dl

18% membentuk sistem kekebalan tubuh 4% koagulasi darah

alfa-1 fetoprotein Protein <1% mengatur ekspresi genetik wewenang Terdapat dua jenis protein yang utama di dalam serum, yaitu albumin dan globulin. Albumin dibuat di dalam hati, merupakan protein yang paling menonjol dan bermuatan negatif yang terkuat guna mengikat molekul kecil untuk diedarkan melalui darah. Albumin juga berguna untuk menjaga tekanan osmosis darah.[3] Beberapa jenis globulin diproduksi di dalam hati, sementara yang lain diproduksi di dalam sistem kekebalan. Semua jenis serum protein yang lain diproduksi di dalam hati. Arti kata globulin menunjukkan sekelompok protein heterogen dengan berat molekul tertentu yang cukup tinggi, dengan kecepatan terlarut (en:solubility rate) dan laju migrasi elektroforetik (en:electrophoretic migration rate) yang lebih rendah daripada albumin. Rasio normal di dalam darah sekitar 2 hingga 3,5 g/dl.

Ilustrasi skema gel protein hasil elektroforesis, lihat pula [1] Elektroforesis protein serum (en:serum protein electrophoresis, SPEP) adalah uji laboratoriumuntuk menentukan jenis globulin (alfa-1, alfa-2, beta dan gamma) dan albumin. Cara yang digunakan adalah pengambilan serum darah dari bekuan darah, kemudian diletakkan di atas medium yang dibubuhi agarose gel, kemudian dipaparkan ke arus listrik. Protein serum total atauprotein plasma total atau protein total adalah hasil uji laboratorium yang mengukur jumlah protein pada plasma darah atau serum darah. [4] [sunting]Serum albumin Serum albumin, sering disebut albumin adalah protein dengan jumlah terbanyak di dalamtubuh. Albumin sangat penting demi memelihara tekanan osmosis untuk distribusi fluida tubuh antara intravascular compartment dan jaringan tubuh. Albumin juga berfungsi sebagai pengusung plasma dengan secara tidak langsung mengikat beberapa hormon steroid hydrophobic dan protein pengusung bagi hemin dan asam lemak dalam sirkulasinya. BSA, fraksi V dari serum albumin berguna untuk meluruhkan beberapa substansi dari sirkulasi darah melalui jaringan hati, antara lain bilirubin, tiroksin, taurolithocholic acid, chenodeoxycholic acid, digitoksin dan juga heme peptida dari cytochrome C.[5] 60% dari protein di dalam plasma darah, jumlah serum yang melebihi batas normal dapat membahayakan manusia. Prealbumin (bahasa Inggris: transthyretin) ditengarai sebagai pengusung hormon tiroksin dari dalam darah menuju ke otak.[6] [sunting]Serum globulin Serum globulin adalah istilah umum yang digunakan untuk protein yang tidak larut, baik di dalam air maupun di dalam larutan garam konsentrasi tinggi, tetapi larut dalam larutan garam konsentrasi sedang.[1] Globulin (bahasa Latin: globulus,

bola kecil (bahasa Inggris: small globe)) mempunyai rasio 35% dari protein plasma, berguna untuk sirkulasi ion, hormon dan asam lemak dalam sistem kekebalan. Beberapa jenis globulin mengikat hemoglobin, beberapa yang lain mengusung zat besi, berfungsi untuk melawan infeksi[4], dan bertindak sebagai faktor koagulasi.[1] Globulin terdiri dari:[7]  lakto globulin  tiroglobulin [8][3]  serum globulin, terbagi terbagi menurut laju migrasi elektroforesik menjadi:  alfa globulin (protein yang mengusung tiroksin dan retinol/vitamin A).  alfa-1 globulin  alfa-1 antitripsin (bahasa Inggris: Transcortin, corticosteroidbinding globulin, CBG) disebut juga acute phase reactant[1] atauserpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase), member 6.  alfa-1 antisimotripsin  orosomukoid (asam glikoprotein)  serum amiloid A  alfa-1 lipoprotein (HDL)  alfa-2 globulin  alfa-2 makro globulin (protease inhibitor)  haptoglobin  protein C (inhibitor of activated coagulation factors FVIII and FV)  seruloplasmin (pengusung zat tembaga)  alfa-2 lipoprotein (VLDL)  beta globulin  beta-1 globulin  transferin  hemopeksin  plasminogen  properdin  faktor komplemen H  beta-2 globulin  faktor komplemen C3 dan C4  C-reactive protein  beta-2 lipoprotein alias LDL  beta-2 mikro globulin  beberap jenis IgA dan IgM  gamma globulin (protein dengan muatan negatif yang terlemah yang berfungsi sebagai antibodi)  IgM, IgA, IgG  makro globulin  transkobalamin [sunting]Serum lipoprotein Serum lipoprotein adalah senyawa biokimiawi yang mengandung protein dan lemak. Lemak atau produk turunannya dapat terikat secarakovalen maupun non kovalen dengan protein. Lipoprotein dapat protein struktural, antigen, adesin, toksin, high berbentuk enzim, transporter, density lipoprotein dan low density lipoprotein yang memungkinkan lemak terusung di dalam darah, dan protein transmembran yang

terdapat pada mitokondria (terdapat juga pada kloroplas tanaman), serta lipoprotein bakterial.[9] Lipoprotein di dalam tubuh manusia terbagi menjadi 5 golongan utama:  kilomikron (bahasa Inggris: chylomicron)  VLDL  LDL  IDL  HDL [sunting]Serum wewenang Serum wewenang (bahasa Inggris: Regulatory protein) yang hanya berjumlah 1% dari protein plasma, terdiri dari enzim, proenzim danhormon. Riset terakhir mengenai protein plasma darah tertuju pada analisa proteomika dari serum/plasma guna mencari jejak bio (bahasa Inggris: biomarker) yang dimulai semenjak tahun 1970 dengan elektroforesis gel 2 dimensi[10] dan pada akhir-akhir ini dengan spektrometri massa.[11][12] Terdapat dua jenis protein wewenang:[13] 1. protein yang memengaruhi kontraksi otot, misalnya troponin dan tropomiosin, yang mengatur interaksi antara miosin dan aktin.Kalsium merupakan komponen yang krusial pada reaksi ini. 2. protein tertentu yang mengikat deret wewenang (bahasa Inggris: regulatory sequence) dari DNA, dan berfungsi untuk mengaturekspresi genetik. Protein ini menggerakkan proses diferensiasi seluler dan morfogenesis menuju pada penciptaan jenis sel yang baru pada makhluk multicellular. Pada tahap ini, jenis sel yang berbeda dapat memiliki profil ekspresi genetik yang berbeda-beda dalam deret genome yang sama.

Rujukan 1. ^ a b c d (Inggris) "Serum globulin". Farlex free dictionary. Diakses pada 15 Februari 2010. 2. ^ (Inggris) "Serum protein". Jeremy E. Kaslow. Diakses pada 20 Februari 2010. 3. ^ a b (Inggris) "Blood - Biology page". John W. Kimball. Diakses pada 14 Februari 2010. 4. ^ a b (Inggris) "Total Serum Protein". WebMD. Diakses pada 20 Februari 2010. 5. ^ (Inggris)"Albumin bovine, Agarose, Affinity matrix" (pdf). Sigma-Aldrich. Diakses pada 26 Februari 2010. 6. ^ (Inggris)"Anti-Transthyretin" (pdf). Sigma-Aldrich. Diakses pada 26 Februari 2010. 7. ^ (Inggris) "Medical Subject Headings". National Library of Medicine. Diakses pada 20 Februari 2010. 8. ^ (Inggris) "Globulins". Cornell University. Diakses pada 20 Februari 2010. 9. ^ (Inggris)"Database of Bacterial Lipoprotein". Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council dan Centre for Biotechnology, Anna University. Diakses pada 21 Februari 2010. 10. ^ (Inggris) Anderson NL and Anderson NG (1977). "High Resolution TwoDimensional Electrophoresis of Human Plasma Proteins".Proceeding of the National Academy of Sciences 74: 54215425. doi:10.1073/pnas.74.12.5421. PMID 271964. 11. ^ (Inggris) Adkins JN et al. (2002). "Toward a human blood serum proteome: analysis by multidimensional separation coupled with mass spectrometry". Molecular

and Cellular Proteomics 1: 947955. doi:10.1074/mcp.M200066MCP200. PMID 12543931. 12. ^ (Inggris) Jacobs JM et al. (2005). "Utilizing human blood plasma for proteomic biomarker discovery". Journal of Proteome Research 4: 1073 1085. doi:10.1021/pr0500657. PMID 16083256. 13. ^ (Inggris) "Regulatory proteins". Farlex free dictionary. Diakses pada 18 Februari 2010.