ISOLASI DAN PEMISAHAN PROTEIN

Pendahuluan
Protein adalah molekul organik yang terbanyak di dalam sel. Lebih dari 50% berat kering sel terdiri atas protein. Selain itu, protein adalah biomolekul yang sesungguhnya, karena senyawa ini yang menjalankan berbagai fungsi dasar kehidupan, antara lain proses berkontraksi melakukan gerak, menjalankan berbagai proses metabolisme dalam bentuk enzim. Protein dapat pula berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan di dalam bagian-bagian sel sendiri. Protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta waktu yang tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri. Jadi secara tidak langsung protein mengatur perbanyakan diri sendiri dengan mengatur DNA, yang merupakan alat perekam informasi untuk protein, sehingga dengan demikian operasinya di bawah kendali protein. Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino, yang terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Ada suatu universalisme di dalam molekul protein. Protein apapun dan berasal dari makhluk apapun juga ternyata hanya tersusun dari 20 macam asam amino saja. Perbedaan protein yang satu dengan yang lain disebabkan oleh jumlah dan kedudukan asam-asam amino tersebut di dalam tiap-tiap molekul. Kedua puluh asam-amino itu mempunyai ciri umum sebagai berikut. Pertama, semuanya mempunyai konfigurasi L. Kedua, sama-sama mempunyai 1 gugus COOH dan 1 gugus NH2 yang terikat ke atom C . Perbedaan individual dari asam-asam amino ini disebabkan

oleh perbedaan rantai samping. Yang menyebabkan perbedaan kimia antara asam-asam amino tersebut, pada gilirannya akan menyebabkan perbedaan sifat kimia dan biologis dari molekul protein yang disusunnya. Rantai samping R ini tidak ikut membentuk ikatan peptida. Muatan suatu protein dalam suatu larutan ditentukan oleh gugus NH2 bebas di suatu ujung dan gugus COOH bebas di ujung yang lain serta jumlah rantai yang bermuatan. Molekul protein, melalui ikatan hidrogen, berinteraksi dengan molekul air membentuk mantel air. Karena molekulnya besar, di dalam air protein membentuk larutan koloid. Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sanat meningkatkan kelarutan suatu protein (salting in). Sifat ini, yaitu kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain itu, sifat lain, yaitu ukuran molekul yang berbeda sebagai akibat dari jumlah asam amino yang menyusun dan muatan yang tidak sama antar protein yang satu dengan yang lain karena perbedaan jenis asam amino yang menyusunnya, menjadi dasar dari pemisahan protein yang akan dilakukan pada praktikum berikut ini.

Tujuan Praktikum :
1. Mengenal reaksi umum berdasarkan adanya beberapa ikatan peptida pada suatu protein dan mampu menggunakannya untuk melacak protein dalam suatu bahan 2. Melakukan pemisahan suatu protein dari kelompok protein lain secara reversibel dengan menggunakan larutan garam divalen konsentrasi tinggi (salting out) dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut. 3. Melakukan pemisahan protein secara reversibel, dengan menggunakan bahan higroskopis dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut. 4. Melakukan pemisahan protein secara denaturasi ireversibel dengan menggunakan pereaksi alkaloid, menerangkan mekanisme kerjanya dan mampu menggunakan untuk melacak protein. 5. Memperlihatkan kemampuan logam berat dalam mengendapkan dan mendenaturasi protein dan menjelaskan masalah yang ditimbulkan oleh logam berat sebagai pencemar lingkungan.

6. Mengetahui cara pemisahan suatu protein dari protein lain ataupun senyawa lain, berdasarkan perbedaan berat molekul, dengan menggunakan cara kromatografi gel penyaring molekul sederhana.

Percobaan Protein

1.

Uji Biuret

Tujuan :
Memperlihatkan bahwa protein mempunyai ikatan peptida yang bereaksi positif dengan uji biuret. Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lain.

Dasar :
Ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein dan polipeptida, dalam larutan bersuasana alkali akan berwarna lembayung bila direaksikan dengan Cu++.

Bahan dan Pereaksi :

1. Larutan albumin atau putih telur 2. Air liur 3. Larutan pati 1% 4. NaOH 10% 5. Larutan CuSO4 0,1%

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 4 tabung reaksi yang bersih. Mempipetkan ke dalam tabung reaksi, seperti pada tabel 1. Tabel 1. Prosedur Reaksi biuret

Tabung Larutan albumin (putih telur) Air liur Larutan pati Air suling NaOH 10% Larutan CuSO4 * Warna lembayung

1 1 mL 1 mL 1 tetes Ya

2 1 mL 1 mL 1 tetes Tidak

3 1 mL 1 mL 1 tetes Tidak

4 1 mL 1 mL 1 tetes Tidak

* Bila belum terbentuk warna lembayung, CuSO4 dapat ditambahkan lagi, sampai 10 tetes.

Kesimpulan :
Dari hasil percobaan diatas, dapat disimpulkan bahwa larutan yang bereaksi positif dengan menghasilkan warna ungu melalui uji biuret adalah larutan albumin. Uji biuret positif terhadap larutan yang mengandung mengandung protein, namun negatif pada larutan yang tidak mengandung protein.

Jawaban Pertanyaan :
1. Ya, uji ini akan positif terhadap asam amino yang mengandung protein dengan memiliki ikatan peptida. 2. Asam amino yang menyusun protein antara lain : Glisin, Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Fenilalanin, Metionin, Prolin, Triptofan, Serin, Treonin, Tirosin, Asparagin, Glutamin, Sistein, Aspartat, Glutamat, Arginin, Lisin, Histidin. 3. Pengelompokan asam amino : Simple dan Conjugated. 4. Asam Amino esensial adalah asam amino yang dibutuhkan oleh tubuh tapi tidak diproduksi oleh tubuh. Contohnya : Arginin, Histidin, Isoleusin, Methionin, Phenylalanine, Threonin, Triptofan, Valin, Leusin. Sedangkan asam amino non esensial adalah asam amino yang tidak begitu dibutuhkan oleh tubuh. Contohnya : Hydroxiproline, Hydroxilisine, Glysine, Proline, Serin, Tyrosin, Aspargin, Glutamat, Glisin, Cystein, Alanine.

2. Pengendapan Protein Dengan Larutan Garam Konsentrasi Tinggi (Salting Out)

Tujuan :
Memperlihatkan bahwa sebgai makromolekul yang larut dalam bentuk larutan koloid, protein dapat dopisahkan satu dari yang lain, dengan menggunakan larutan garam divalent konsentrasi tinggi.

Dasar :
Untuk larutan dalam air, suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air dengan cara membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata diantara molekul-molekul air. Adanya muatan listrik pada molekul terlarut sangat membantu kelarutan, karena muatan yang sama saling menjauhi, sehingga agregasi molekul tidak terjadi. Protein merupakan makromolekul karena memiliki BM (berat molekul) besar. Pada umumnya,protein mudah larut dalam air karena protein mempunyai kedua sifat berikut. Gugus -CO- dan NH- yang ada pada iktan peptida dapat berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hidrogen, sedangkan berbagai rantai samping, yang diantaranya ada yang hidrofilik,bahkan juga bermuatan, sangat mudah berinteraksi dengan molekul air. Selain itu, muatan listrik yang sama dalam 2 partikel molekul protein yang sama, akan bertolakan, sehingga membantu meningkatkan kelarutan protein (salting in). Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul protein, sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap . Larutan garam berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam berkonsentrasi tinggi akan menetralkan muatan listrik, sehingga kelarutan akan makin berkurang. Oleh karena pengendapan dengan cara ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein, sedangkan molekul protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia, maka perubahan

tersebut bersifat reversible. Kelarutan dan fungsi protein pada umumnya akan pulih kembali bila dikembalikan ke keadaan semula. Larutan garam divalent lebih efisien dalam mengendapkan protein, karena di dalam air garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 3 ion, yang masing-masing berinteraksi sempurna dengan air. Sebagai contoh, globulin dapat diendapkan oleh (NH4)2SO4 setengah jenuh, sedangkan NaCl baru dapat mengendapkan protein tersebut bila berada dalam larutan jenuh. Albumin, yang baru akan mengendap oleh (NH 4)2SO4 jenuh, tidak dapat diendapkan oleh NaCl jenuh, kecuali dengan penambahan asam mineral dalam jumlah yang sangat kecil. Pada gambar 2.1 diperlihatkan mekanisme terjadinya pengendapan protein oleh garam dalam konsentrasi tinggi. H H O R
-

O O H O H O RC C H

H N

C R+

H N

O + (NH 4)2SO4 O

NH3+

Protein terlarut

NH3+ COOCOONH3+ NH3+ NH3+

COOCOO-

Protein beragregasi / mengendap

Gambar 1.

Pengendapan Protein Dengan Cara Salting Out

Bahan dan Pereaksi :

1. Serum sapi 2. Larutan ammonium sulfat (NH4)2SO4 jenuh 3. Larutan NaOH 10% 4. Larutan CuSO4 0,1%

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Melakukan prosedur seperti yang tertera dalam tabel 2 : Tabel 2. Percobaan salting out

1 Serum sapi 1 ml Amonium sulfat jenuh : tetes demi tetes 1 ml Endapan : ada / tidak ada Ada endapan Pisahkan endapan dengan menyaring Lakukan uji biuret terhadap: Filtrat Endapan +

Tabung

Kesimpulan :
Protein dapat diendapkan dengan menggunakan garam konsentrasi tinggi melalui proses salting out. Dengan penambahan ammonium sulfat yang jenuh akan mengendapkan serum sapi sehingga larutan menjadi bersifat reversibel. Hal ini dikarenakan garam berdivalent tinggi lebih kuat menarik mantel air daripada protein dalam serum.

Jawaban Pertanyaan :
1. Protein yang mengendap pada penambahan satu volume amonium sulfat jenuh ke dalam satu volume serum adalah protein Albumin.

2. Yang tidak dapat diendapkan pada percobaan tersebut adalah Globulin.

3.

Fungsi Albumin adalah mengikat Ligand, albumin disintesis di hati. Fungsi Protein

dalam darah = sebagai transport dan storage. Contoh : CO2 dan O2 dalam darah / eritrosit. 4. Alkaptonuria, defisiensi enzim homogentisic acid dioxygenase.Ditandai dengan perubahan warna urine yang menjadi gelap kalau didiamkan.

3. Pemisahan Protein Dengan Etanol Absolut

Tujuan :
Memperlihatkan, bahwa sebagai makromolekul yang larut, protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.

Dasar :
Etanol absolut bersifat sangat kuat menarik air (higroskopis). Penambahan etanol absolut pada suatu larutan protein, akan menyebabkan molekul air yang berinteraksi dengan molekul protein melalui ikatan hidrogen ditarik oleh etanol. Akibatnya molekul-molekul protein beragregasi satu sama lain sehingga mengendap. Bila agregat partikel protein tersebut dibiarkan bersentuhan dengan etanol untuk waktu yang lama endapan yang terbentuk tidak dapat dilarutkan lagi sehingga denaturasi yang terjadi irreversibel. Dengan menggunakan etanol berbagai konsentrasi dan suhu yang rendah, Cohn pada tahun empat puluhan telah berhasil memisahkan protein serum dalam 5 fraksi, dan fraksi V yang diperoleh sebagian besar terdiri atas albumin.

Bahan dan Pereaksi :

1) Serum 2) Larutan albumin telur 3) Etanol absolut 4) Larutan NaOH encer 5) Larutan CuSO4

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Lakukan prosedur yang tertera pada tabel 3 :

Tabel 3. Percobaan Pengendapan Protein Dengan Etanol Absolut

1 Serum 1 ml Larutan albumin telur Etanol absolut 1 ml Endapan: ada/tidak ada Ada endapan Pisahkan endapan dengan menyaring Uji biuret terhadap: Filtrat Endapan +

Tabung

2 1 ml 1 ml Ada endapan

Kesimpulan :
Protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut. Kemudian dipisahkan antara endapan dan supernatan, lalu dites biuret tetap memberikan hasil positif. Demikian juga serum dan etanol absolut, ditandai dengan warna ungu.

Jawaban Pertanyaan :

4. Pengendapan Protein Secara Denaturasi Ireversibel

A. Pengendapan Alkaloid
Tujuan :
Memisahkan protein dengan memisahkannya dengan senyawa yang bereaksi dengan protein tersebut

Dengan

Pereaksi

Dasar :
Pereaksi alkaloid adalah asam-asam organik yang dapat mengendapkan alkaloid serta protein. Pengendapan terjadi karena alkaloid dan protein mengandung nitrogen trivalen. Asam trikloroasetat (TCA=tricgloracetic acid ) sering dipakai untuk deproteinisasi (penyingkiran protein) dari suatu bahan. Asam sulfasalisilat sering dipakai unatuk melacak ada tidaknya protein dalam urin patologis.

Bahan dan Pereaksi :

1. Serum 2. Asam triklosasetat (TCA: trichlos acetic acid) 10% 3. Asam sulfasalisilat 3%

Cara Kerja dan Hasil :

Siapkan dua tabung reaksi yang bersih dan kering. Lakukan prosedur yang tertera dalam tabel 4.

Tabel 4.A. Pengendapan Protein Dengan Menggunakan Pereaksi Alkaloid

Tabung Serum TCA 10% As. Sulfasalisilat Endapan ada / tidak ada

1 1 ml 1 ml Ada

2 1 ml 1ml Ada

Kesimpulan :
Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa serum merupakan protein yang mengandung nitrogen trivalent yang apabila bereaksi dengan TCA atau asam sulfasalisilat akan mengendap.

Jawaban Pertanyaan :
1. P 2. Urin normal tidak mengandung protein. 3. Proteinuria terlacak pada keadaan : Cystinuria. Ekskresi sistin dalam urine meningkat (bisa mencapai 30 x nilai normalnya). Ekskresi Lysine, Arginine dan amino dari Maple Syrup Urine Disease. Kadar Leusin, Isoleusin, Valine dan asam ketonya dalam plasma dan urin meninggi. Defek pada keadaan tidak adanya atau berkurangnya aktivitas enzim dekarboksilase asam - keto. Terapinya : penggantian protein dalam makanan dengan campuran asam amino yang tidak mengandung Leusin, Isoleusin dan Valin. Gangguan reabsorpsi asam

 Sistinosis ( = Cystine Storage Disease ). Merupakan gangguan dalam jaringan dan organ terutama sistem R.E. Biasa disertai amino asiduria dan pasien biasanya meninggal karena gagal ginjal akut.

B.

Pengendapan protein dengan logam berat

Tujuan :
Memperlihatkan, bahwa logam berat mengendapkan protein secara denaturasi ireversibel.

Dasar :
Protein bermuatan negatif membentuk garam dengan kation logam berat menjadikan protein terdenaturasi dan mengendap.

Bahan dan Pereaksi :

1. Putih telur 2. larutan H9CL2 1%

3. Larutan Pb-asetat

Cara kerja dan Hasil :

Siapkan dua buah tabung reaksi, lakukan prosedur yang tertera dalam tabel 4. Tabel 4.B. Pengendapan Protein Dengan logam Berat

Tabung Putih telur H9CL2 Pb-asetat Endapan ada/tidak ada

1 1 ml Tetes demi tetes Ada

2 1 ml Tetes demi tetes Ada

Kesimpulan :
Protein apabila bereaksi dengan logam berat maka akan mengendap.

Jawaban Pertanyaan :
1. Ya, pada tiap kali penambahan logam berat selalu diikuti oleh penambahan endapan protein. Hal ini dikarenakan logam berat mempunyai sifta pendenaturasi protein dan kandungan kation logam berat akan bereaksi dengan molekul yang bermuatan negatif yang dapat memicu pembentukan endapan pada protein. 2. Masing-masing dibutuhkan 5 tetes untuk proses pengendapan kedua kation. 3. Logam berat yang menjadi pencemar utama lingkungan adalah Pb dan sumber pencemaran berasal dari asap kendaraan bermotor. Logam berat ini dapat membahayakan sirkulasi pernafasan, sehingga terjadi infeksi saluran pernafasan. Cystinuria. Ekskresi sistin dalam urine meningkat (bisa mencapai 30 x nilai normalnya). Ekskresi Lysine, Arginine dan amino dari Maple Syrup Urine Disease 4. Hal yang dapat dilakukan bila terjadi keracunan logam berat yang akut adalah dengan meminum susu untuk menetralisirnya. Gangguan reabsorpsi asam