MODUL 5

ANALISIS PROTEIN

Capaian Pembelajaran:
Mampu menjelaskan metode analisis kadar protein dalam bahan pangan

Penyajian:
5.1. Pendahuluan
Protein adalah polimer asam amino. Dua puluh jenis asam amino yang berbeda terjadi
secara alami dalam protein. Protein berbeda satu sama lain sesuai dengan jenis, jumlah
dan urutan asam amino yang membentuk tulang punggung polipeptida. Akibatnya
mereka memiliki struktur molekul, atribut nutrisi dan sifat fisiokimia yang berbeda.
Protein adalah unsur penting makanan karena sejumlah alasan berbeda. Mereka adalah
sumber energi utama, serta mengandung asam amino esensial, seperti lisin, triptofan,
metionin, leusin, isoleusin, dan valin, yang penting bagi kesehatan manusia, tetapi tidak
dapat disintesis oleh tubuh. Protein juga merupakan komponen struktural utama dari
banyak makanan alami, seringkali menentukan tekstur keseluruhannya, mis.,
Kelembutan daging atau produk ikan. Protein yang terisolasi sering digunakan dalam
makanan sebagai bahan karena sifat fungsionalnya yang unik, yaitu kemampuannya
untuk memberikan penampilan, tekstur, atau stabilitas yang diinginkan. Biasanya,
protein digunakan sebagai agen pembentuk gel, pengemulsi, agen pembusa dan
pengental. Banyak protein makanan adalah enzim yang mampu meningkatkan laju reaksi
biokimia tertentu. Reaksi-reaksi ini dapat memiliki efek yang menguntungkan atau
merugikan pada sifat keseluruhan makanan. Analis makanan tertarik untuk mengetahui
konsentrasi total, jenis, struktur molekul dan sifat fungsional protein dalam makanan.

5.2. Penentuan total protein

5.2.1. Metode Kjeldahl
Metode Kjeldahl dikembangkan pada tahun 1883 oleh pembuat bir bernama Johann
Kjeldahl. Suatu makanan dicerna dengan asam kuat sehingga melepaskan nitrogen yang
dapat ditentukan dengan teknik titrasi yang sesuai. Jumlah protein yang ada kemudian
dihitung dari konsentrasi nitrogen makanan. Pendekatan dasar yang sama masih
digunakan sampai sekarang, meskipun sejumlah perbaikan telah dilakukan untuk
mempercepat proses dan untuk mendapatkan pengukuran yang lebih akurat. Ini biasanya
1
dianggap sebagai metode standar untuk menentukan konsentrasi protein. Karena metode
Kjeldahl tidak mengukur kandungan protein secara langsung, faktor konversi (F)
diperlukan untuk mengubah konsentrasi nitrogen yang terukur menjadi konsentrasi
protein. Faktor konversi 6,25 (setara dengan 0,16 g nitrogen per gram protein) digunakan
untuk banyak aplikasi, namun, ini hanya nilai rata-rata, dan setiap protein memiliki
faktor konversi yang berbeda tergantung pada komposisi asam amino. Metode Kjeldahl
dapat dengan mudah dibagi menjadi tiga langkah: pencernaan, netralisasi dan titrasi.
Destruksi
Sampel makanan yang akan dianalisis ditimbang ke dalam labu pencernaan dan
kemudian dicerna dengan memanaskannya di hadapan asam sulfat (zat pengoksidasi
yang mencerna makanan), natrium sulfat anhidrat (untuk mempercepat reaksi dengan
menaikkan titik didih) dan katalis, seperti tembaga, selenium, titanium, atau merkuri
(untuk mempercepat reaksi). Pencernaan mengubah nitrogen dalam makanan (selain dari
yang dalam bentuk nitrat atau nitrit) menjadi amonia, dan bahan organik lainnya menjadi
CO2 dan H2O. Gas amonia tidak dibebaskan dalam larutan asam karena amonia dalam
bentuk ion amonium (NH4 +) yang mengikat ion sulfat (SO42-) yang tetap berada dalam
larutan:

N(pangan)  (NH4)2SO4 (1)

Distilasi
Setelah pencernaan selesai, labu pencernaan dihubungkan ke labu penerima dengan
sebuah tabung. Solusi dalam labu pencernaan kemudian dibuat basa dengan penambahan
natrium hidroksida, yang mengubah amonium sulfat menjadi gas amonia:

(NH4)2SO4 + 2 NaOH  2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2)

Gas amonia yang terbentuk dibebaskan dari larutan dan bergerak keluar dari labu
pencernaan dan masuk ke labu penerima - yang mengandung asam borat berlebih. PH
larutan yang rendah dalam labu penerima mengubah gas amonia menjadi ion amonium,
dan secara bersamaan mengubah asam borat menjadi ion borat:

NH3 + H3BO3 (asam borat)  NH4+ + H2BO3- (ion borat) (3)

2
Titrasi
Kandungan nitrogen kemudian diperkirakan dengan titrasi amonium borat yang dibentuk
dengan asam sulfat atau hidroklorat standar, menggunakan indikator yang sesuai untuk
menentukan titik akhir dari reaksi.

H2BO3- + H+  H3BO3 (4)

Konsentrasi ion hidrogen (dalam mol) yang diperlukan untuk mencapai titik akhir setara
dengan konsentrasi nitrogen yang ada dalam makanan asli (Persamaan 3). Persamaan
berikut dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi nitrogen sampel yang beratnya m
gram menggunakan larutan asam xl HCl untuk titrasi:

(5)

Dimana vs dan vb adalah volume titrasi sampel dan blangko, dan 14g adalah berat
molekul nitrogen N. Sampel blangko biasanya dijalankan pada saat yang sama dengan
bahan yang dianalisis untuk memperhitungkan sisa nitrogen yang mungkin ada dalam
reagen yang digunakan dalam analisis. Kandungan nitrogen yang diperoleh kemudian
dikonversi ke kadar protein menggunakan faktor konversi yang sesuai:

% Protein = F% N.

Kelebihan dan kekurangan

Kelebihan. Metode Kjeldahl banyak digunakan secara internasional dan masih
merupakan metode standar untuk perbandingan terhadap semua metode lainnya.
Keuniversalannya, presisi tinggi dan reproduktifitasnya yang baik menjadikannya
metode utama untuk estimasi protein dalam makanan.
Kekurangan. Metode ini tidak memberikan kadar protein sejati, padahal tidak semua
nitrogen dalam makanan dalam bentuk protein. Protein yang berbeda memerlukan faktor
koreksi yang berbeda karena mereka memiliki urutan asam amino yang berbeda.
Penggunaan asam sulfat pekat pada suhu tinggi menimbulkan bahaya yang cukup besar,
seperti halnya penggunaan beberapa katalis yang mungkin. Teknik ini memakan waktu
untuk dilakukan.

3
5.2.2. Metode Dumas
Teknik instrumensi otomatis telah dikembangkan yang mampu mengukur konsentrasi
protein sampel makanan dengan cepat. Teknik ini didasarkan pada metode yang pertama
kali dijelaskan oleh seorang ilmuwan bernama Dumas lebih dari satu setengah abad yang
lalu. Ini mulai bersaing dengan metode Kjeldahl sebagai metode standar analisis untuk
protein bahan makanan karena kecepatannya.
Prinsip kerja
Sampel dari massa yang diketahui dibakar dalam ruang bersuhu tinggi (sekitar 900oC)
dengan adanya oksigen. Ini mengarah pada pelepasan CO2, H2O dan N2. CO2 dan H2O
dihilangkan dengan melewatkan gas di atas kolom khusus yang menyerapnya.
Kandungan nitrogen kemudian diukur dengan melewatkan gas yang tersisa melalui
kolom yang memiliki detektor konduktivitas termal di ujungnya. Kolom membantu
memisahkan nitrogen dari sisa CO2 dan H2O yang mungkin tetap dalam aliran gas.
Instrumen dikalibrasi dengan menganalisis bahan yang murni dan memiliki konsentrasi
nitrogen yang diketahui, seperti EDTA (= 9,59% N). Dengan demikian sinyal dari
detektor konduktivitas termal dapat diubah menjadi kandungan nitrogen. Seperti dengan
metode Kjeldahl, penting untuk mengubah konsentrasi nitrogen dalam sampel menjadi
kandungan protein, menggunakan faktor konversi yang sesuai yang bergantung pada
urutan asam amino protein yang tepat.
Kelebihan dan kekurangan
Kelebihan: Ini jauh lebih cepat daripada metode Kjeldahl (di bawah 4 menit per
pengukuran, dibandingkan dengan 1-2 jam untuk Kjeldahl). Tidak perlu bahan kimia
atau katalis beracun. Banyak sampel dapat diukur secara otomatis. Mudah digunakan.
Kekurangan: Biaya awal yang tinggi. Itu tidak memberikan ukuran protein sejati, karena
semua nitrogen dalam makanan tidak dalam bentuk protein. Protein yang berbeda
memerlukan faktor koreksi yang berbeda karena mereka memiliki urutan asam amino
yang berbeda. Ukuran sampel yang kecil membuatnya sulit untuk mendapatkan sampel
yang representatif.

5.2.3. Metode spektroskopi UV-visible

Sejumlah metode telah dirancang untuk mengukur konsentrasi protein, yang didasarkan
pada spektroskopi UV-terlihat. Metode-metode ini menggunakan kemampuan alami
protein untuk menyerap (atau menyebarkan) cahaya di wilayah UV-terlihat dari

4
spektrum elektromagnetik, atau mereka secara kimia atau fisik memodifikasi protein
untuk membuatnya menyerap (atau menyebarkan) cahaya di wilayah ini. Prinsip dasar di
balik masing-masing tes ini serupa. Pertama-tama kurva kalibrasi absorbansi (atau
kekeruhan) versus konsentrasi protein disiapkan menggunakan serangkaian larutan
protein dengan konsentrasi yang diketahui. Absorbansi (atau kekeruhan) larutan yang
dianalisis kemudian diukur pada panjang gelombang yang sama, dan konsentrasi
proteinnya ditentukan dari kurva kalibrasi. Perbedaan utama antara tes adalah kelompok
kimia yang bertanggung jawab untuk penyerapan atau hamburan radiasi, misalnya,
ikatan peptida, kelompok samping aromatik, kelompok dasar dan protein agregat.

5.2.3.1. Pengukuran pada Panjang gelombang 280nm

Tryptophan dan tyrosine menyerap sinar ultraviolet dengan kuat pada 280 nm.
Kandungan triptofan dan tirosin dari banyak protein tetap cukup konstan, sehingga
penyerapan larutan protein pada 280nm dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi
mereka. Kelebihan dari metode ini adalah prosedurnya sederhana untuk dilakukan, tidak
merusak, dan tidak diperlukan pereaksi khusus. Kerugian utama adalah asam nukleat
juga menyerap kuat pada 280 nm dan karena itu dapat mengganggu pengukuran protein
jika mereka hadir dalam konsentrasi yang cukup. Meski begitu, metode telah
dikembangkan untuk mengatasi masalah ini, misalnya, dengan mengukur absorbansi
pada dua panjang gelombang yang berbeda

5.2.3.2. Metode Biuret

Warna ungu dihasilkan ketika ion tembaga (Cu 2+) berinteraksi dengan ikatan peptida
dalam kondisi alkali. Pereaksi biuret, yang mengandung semua bahan kimia yang
diperlukan untuk melakukan analisis, dapat dibeli secara komersial. Ini dicampur dengan
larutan protein dan kemudian dibiarkan selama 15-30 menit sebelum absorbansi dibaca
pada 540 nm. Keuntungan utama dari teknik ini adalah bahwa tidak ada gangguan dari
bahan yang menyerap pada panjang gelombang yang lebih rendah, dan teknik ini kurang
sensitif terhadap jenis protein karena menggunakan penyerapan yang melibatkan ikatan
peptida yang umum untuk semua protein, daripada kelompok samping tertentu. Namun,
ia memiliki sensitivitas yang relatif rendah dibandingkan dengan metode UV-visible
lainnya.

5
5.2.3.3. Metode Lowry
Metode Lowry menggabungkan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (pereaksi fenol-
Ciocalteau fenol) yang bereaksi dengan tirosin dan residu triptofan dalam protein. Ini
memberikan warna kebiruan yang dapat dibaca di suatu tempat antara 500 - 750 nm
tergantung pada sensitivitas yang diperlukan. Ada puncak kecil sekitar 500 nm yang
dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi protein tinggi dan puncak besar sekitar
750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi protein rendah. Metode ini
lebih sensitif terhadap konsentrasi protein yang rendah daripada metode biuret.

5.2.3.4. Metode Pengecatan (Dye Binding)

Kelebihan yang diketahui dari pewarna (anionik) bermuatan negatif ditambahkan ke
larutan protein yang pH-nya disesuaikan sehingga protein bermuatan positif (mis. <Titik
isoelektrik). Protein membentuk kompleks tidak larut dengan pewarna karena tarikan
elektrostatik antara molekul, tetapi pewarna yang tidak terikat tetap larut. Zat warna
anionik berikatan dengan gugus kationik dari residu asam amino basa (histidin, arganin
dan lisin) dan untuk membebaskan gugus terminal amino. Jumlah pewarna tidak terikat
yang tersisa dalam larutan setelah kompleks pewarna-protein yang tidak larut telah
dihilangkan (mis., Dengan sentrifugasi) ditentukan dengan mengukur absorbansi. Jumlah
protein yang ada dalam larutan asli sebanding dengan jumlah pewarna yang terikat
padanya:

dyeterikat = dyeawal - dyebebas.

5.2.3.5. Metode turbidimetri

Molekul protein yang biasanya larut dalam larutan dapat dibuat untuk mengendap
dengan penambahan bahan kimia tertentu, mis., Asam trikloroasetat. Pengendapan
protein menyebabkan larutan menjadi keruh. Dengan demikian konsentrasi protein dapat
ditentukan dengan mengukur tingkat kekeruhan.
Kelebihan dan kekurangan spektroskopi UV-Visible
Kelebihan: Teknik UV-terlihat cukup cepat dan mudah dilakukan, dan sensitif terhadap
protein konsentrasi rendah.
Kekurangan: Untuk sebagian besar teknik yang terlihat oleh UV, perlu menggunakan
larutan encer dan transparan, yang tidak mengandung zat pencemar yang menyerap atau
menyebarkan cahaya pada panjang gelombang yang sama dengan protein yang

6
dianalisis. Kebutuhan akan solusi transparan berarti bahwa sebagian besar makanan
harus menjalani persiapan sampel dalam jumlah yang signifikan sebelum dapat
dianalisis, misalnya, homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, yang dapat
memakan waktu dan melelahkan. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk mengekstraksi
protein secara kuantitatif dari jenis makanan tertentu, terutama setelah mereka diproses
sehingga protein menjadi teragregasi atau terikat secara kovalen dengan zat lain. Selain
itu absorbansi tergantung pada jenis protein yang dianalisis (protein yang berbeda
memiliki urutan asam amino yang berbeda).

5.2.4. Teknik Instrumentasi Lainnya

Ada berbagai macam metode instrumental yang tersedia untuk menentukan kandungan
protein total bahan makanan. Ini dapat dibagi menjadi tiga kategori yang berbeda sesuai
dengan prinsip fisikokimia: (i) pengukuran sifat fisik curah, (ii) pengukuran adsorpsi
radiasi, dan (iii) pengukuran pembaisan radiasi. Setiap metode instrumental memiliki
kelebihan dan kekurangan sendiri, dan jenis makanan yang dapat diuji.

5.2.4.1. Pengukuran sifat fisik curah

 Densitas: Densitas protein lebih besar daripada sebagian besar komponen
makanan lainnya, sehingga ada peningkatan kepadatan makanan karena
kandungan proteinnya meningkat. Dengan demikian kandungan protein dari
makanan dapat ditentukan dengan mengukur kepadatannya.
 Indeks bias: Indeks bias suatu larutan berair meningkat dengan meningkatnya
konsentrasi protein dan oleh karena itu pengukuran RI dapat digunakan untuk
menentukan kandungan protein.

5.2.4.2. Pengukuran adsorpsi radiasi

 UV-visible Konsentrasi protein dapat ditentukan dengan mengukur absorbansi
radiasi yang terlihat ultraviolet (lihat di atas).
 Inframerah: Teknik inframerah dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi
protein dalam sampel makanan. Protein menyerap IR secara alami karena getaran
karakteristik (peregangan dan pembengkokan) kelompok kimia tertentu di
sepanjang tulang punggung polipeptida. Pengukuran absorbansi radiasi pada
panjang gelombang tertentu dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi protein
dalam sampel. IR sangat berguna untuk analisis konten protein secara cepat dan
7
 online. Ini juga memerlukan sedikit persiapan sampel dan tidak merusak.
Kerugian utamanya adalah biaya awal yang tinggi dan kebutuhan untuk kalibrasi
yang luas.
 Resonansi Magnetik Nuklir (NMR): Spektroskopi NMR dapat digunakan untuk
menentukan konsentrasi total protein makanan. Kandungan protein ditentukan
dengan mengukur area di bawah puncak dalam spektrum pergeseran kimia NMR
yang sesuai dengan fraksi protein.

5.2.4.3. Pengukuran radiasi

 Pancaran cahaya (light scattering): Konsentrasi agregat protein dalam larutan air
dapat ditentukan dengan menggunakan teknik hamburan cahaya karena
kekeruhan larutan berbanding lurus dengan konsentrasi agregat yang ada.
 Pancaran Ultrasonik (ultrasonic scattering): Konsentrasi agregat protein juga
dapat ditentukan dengan menggunakan teknik hamburan ultrasonik karena
kecepatan ultrasonik dan penyerapan ultrasound terkait dengan konsentrasi
agregat protein yang ada.
Kelebihan dan kekurangan
Kelebihan: Sejumlah metode instrumental ini lebih unggul dibandingkan teknik-teknik
lain yang disebutkan di atas karena sifatnya yang tidak merusak, memerlukan sedikit
atau tidak ada persiapan sampel, dan pengukurannya cepat dan tepat.
Kekurangan utama dari teknik-teknik yang bergantung pada pengukuran sifat fisik
makanan adalah bahwa harus disiapkan kurva kalibrasi antara sifat fisik dan kandungan
protein total, dan ini mungkin tergantung pada jenis protein yang ada dan matriks
makanan itu. Selain itu, teknik yang didasarkan pada pengukuran sifat fisikokimia hanya
dapat digunakan untuk menganalisis makanan dengan komposisi yang relatif sederhana.
Dalam makanan yang mengandung banyak komponen berbeda yang konsentrasinya
mungkin bervariasi, sulit dilakukan pengukuran kadar protein karena komponen lainnya
dapat mempengaruhi analisis.

5.2.5. Perbandingan metode analisis protein

Sebagai ahli pangan seringkali kira harus memilih teknik tertentu untuk mengukur
konsentrasi protein suatu bahan pangan. Bagaimana kita memutuskan teknik mana yang
paling tepat untuk aplikasi yang memenuhi kebutuhan analisis? Hal pertama yang harus
ditentukan adalah untuk apa informasi itu akan digunakan. Jika analisis akan dilakukan
8
untuk tujuan legalitas, mis., Persyaratan hukum atau pelabelan, maka penting untuk
menggunakan metode yang diakui secara resmi. Metode Kjeldahl dan metode Dumas,
telah secara resmi disetujui untuk digunakan menganalisis pangan. Sebaliknya, hanya
sejumlah kecil aplikasi spektroskopi UV-visible telah diakui secara resmi.
Untuk tujuan pengendalian mutu, seringkali lebih bermanfaat untuk memilih pengukuran
kadar protein yang cepat dan sederhana dan oleh karena itu teknik IR paling cocok.
Untuk studi mendasar di laboratorium, di mana protein murni sering dianalisis, teknik
spektroskopi UV-visible sering lebih disukai karena metode tersebut memberikan
pengukuran cepat dan dapat diandalkan, dan sensitif terhadap konsentrasi protein yang
rendah.
Faktor lain juga patut dipertimbangkan adalah persiapan sampel yang diperlukan,
sensitivitas dan kecepatannya. Metode Kjeldahl, Dumas dan IR membutuhkan persiapan
sampel yang sangat sedikit. Setelah sampel makanan yang representatif dipilih, biasanya
dapat langsung diuji. Di sisi lain, berbagai metode UV-visible membutuhkan persiapan
sampel yang lebih panjang sebelum analisis. Protein harus diekstraksi dari makanan
menjadi larutan transparan encer, yang biasanya melibatkan proses homogenisasi yang
memakan waktu, ekstraksi pelarut, filtrasi dan sentrifugasi. Selain itu, mungkin sulit
untuk sepenuhnya mengisolasi beberapa protein dari makanan karena sangat terikat pada
komponen lain. Berbagai teknik juga memiliki sensitivitas yang berbeda, yaitu,
konsentrasi protein terendah yang dapat mereka dideteksi. Metode UV-visible adalah
yang paling sensitif, mampu mendeteksi konsentrasi protein serendah 0,001% berat.
Sensitivitas metode Dumas, Kjeldahl dan IR adalah sekitar 0,1% berat. Waktu yang
diperlukan per analisis, dan jumlah sampel yang dapat dijalankan secara bersamaan, juga
merupakan faktor penting untuk dipertimbangkan ketika memutuskan teknik analisis
mana yang akan digunakan. Teknik IR mampu melakukan analisis cepat (<1 menit)
konsentrasi protein setelah dikalibrasi. Metode Dumas instrumental modern sepenuhnya
otomatis dan dapat mengukur konsentrasi protein sampel dalam waktu kurang dari 5
menit, dibandingkan dengan metode Kjeldahl yang membutuhkan waktu antara 30 menit
dan 2 jam untuk dilakukan. Berbagai metode UV-visible berkisar antara beberapa menit
hingga satu jam (tergantung pada jenis pewarna yang digunakan dan berapa lama waktu
yang diperlukan untuk bereaksi), meskipun itu memiliki keuntungan bahwa banyak
sampel dapat dijalankan secara bersamaan. Namun demikian, biasanya diperlukan untuk
melakukan persiapan sampel yang luas sebelum analisis untuk mendapatkan solusi yang
9
transparan. Faktor-faktor lain yang mungkin penting ketika memilih teknik yang sesuai
adalah: peralatan yang tersedia, kemudahan operasi, akurasi yang diinginkan, dan apakah
teknik tersebut tidak merusak.

DAFTAR PUSTAKA
Nielsen, S. S. 2010. Food analysis 4th ed. Springer. New York. DOI 10.1007/978-1-
4419-1478-1.
Pomeranz, Y dan C. E. Meloan. 1987. Food Analysis Theory and Practice. 2 nd ed. AVI.
New York.
Pomeranz, Y dan C. E. Meloan. 1994. Food Analysis Theory and Practice. 3rd. ed.
Springer, Boston. DOI: https://doi.org.10.1007/978-1-4615-6998-5.
Sudarmadji, S., B. Maryono dan Suhardi. 1984. Analisis Bahan Makanan dan Pertanian
(edisi ke-3). Liberty, Yogyakarta.

Test Formatif
1. Metode analisis protein dalam bahan pangan adalah sebagai berikut, kecuali:
A. Metode Kjeldahl
B. Metode Dumas
C. Metode Lane dan Eynon
D. Metode Biuret
2. Metode analisis kadar protein dalam bahan makanan yang menggunakan suhu 900C
adalah:
A. Metode Kjeldahl
B. Metode Dumas
C. A dan B benar
D. A dan B salah
3. Tahap-tahap analisis pada metode Kjeldahl adalah:
A. Destruksi, titrarsi, distilasi
B. Titrasi, distilasi, destruksi
C. Destruksi, distilasi, titrasi
D. Distilasi, destruksi, titrasi
4. Metode analisis yang menggunakan pereaksi biuret dengan pereaksi fenol yang dapat
bereaksi dengan tirosin dan triptofan adalah:

10
 A. Metode Lowry
B. Metode Biuret
C. Metode Fenol
D. Metode Dumas
5. Hasil reaksi ion tembaga berinteraksi dengan ikatan peptide dalam kondisi alkali
menghasilkan warna …… pada metode Biuret
A. Biru
B. Oranye
C. Hijau
D. Ungu

11