3.3.

1 Pembuatan Media
a) Media Padat Nutrient Agar
Nutrient Agar (NA) ditimbang sebanyak 28 gram, dilarutkan dalam 1
liter aquades menggunakan erlenmeyer. Kemudian dihomogenkan
dengan magnetic stirrer di atas hot plate sampai mendidih, kemudian
disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit dan
dibiarkan sampai media cukup dingin. Selanjutnya media Nutrient Agar
dituang ke dalam cawan petri sebanyak 20 mL, dan ke dalam tabung
reaksi (sebagai Agar miring) sebanyak 10 mL, didiamkan sampai
memadat. Media ini digunakan untuk kultur awal, kultur stok, isolasi dan
inokulasi bakteri.

b) Media cair Nutrient Broth (NB)

Nutrient Broth (NB) ditimbang sebanyak 8 gram lalu dilarutkan
dalam 1 liter aquades menggunakan erlenmeyer. Kemudian
dihomogenkan dengan magnetic stirrer di atas hot plate sampai mendidih.
Media yang telah homogen kemudian disterilkan menggunakan autoklaf
pada suhu 121 ºC selama 15 menit.

c) Media Sulfide Indole motility (SIM)

Sebanyak 30 g serbuk media SIM dilarutkan dengan 1 liter
aquades, dipanaskan hingga melarut dan dihomogenkan, setelah itu
dimasukkan ke tabung reaksi sebanyak 10 mL, disterilkan dengan autoklaf
selama 15 menit pada suhu 121⁰C tekanan 15 lbs.

d) Media Metil Red-Voges Proskauer (MR-VP)

Sebanyak 17 g serbuk media MR-VP dilarutkan dalam 1 liter
aquades kemudian dihomogenkan, lalu dimasukkan ke dalam tabung
reaksi sebanyak 10 mL, kemudian disterilkan dengan autoklaf selama 15
menit pada suhu 121⁰C tekanan 15 lbs.
 e) Media Simon Citrate agar
Media ditimbang sebanyak 22,5 g kemudian dilarutkan dalam 1 liter
aquades. Selanjutnya Media dihomogenkan pada hot plate stirrer
menggunakan magnetic stirrer lalu disterilkan dengan autoklaf. Setelah
homogen media dituang pada tabung reaksi sebanyak 10 ml dan
disterilkan kembali dalam autoclave.

f) Media Urea broth

Bubuk medium urea broth ditimbang sebanyak 10 gram kemudian
dilarutkan dalam 1 liter aquades kemudian dipanaskan dan dihomogenkan
pada hot plate stirrer menggunakan magnetic stirrer. Selanjutnya
disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121⁰C tekanan 15
lbs.

g) Media Triptofan Broth

Bubuk medium Triptofan Broth ditimbang sebanyak 20 gram
kemudian dilarutkan dalam 1 liter aquades lalu dipanaskan dan
dihomogenkan. Selanjutnya disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit
pada suhu 121⁰C tekanan 15 lbs.

Teknik pemisahan ini disebut sebagai teknik isolasi bakteri yang

selanjutnya dapat diidentifikasi guna mengetahui jenis, kultural, morfologi,
fisiologi karakteristik serta spesiesnya. Identifikasi bakteri dapat dilakukan
secara fenotip melalui pengamatan morfologi maupun karakter fisiologis
bakteri, sedangkan secara genotip dapat dilakukan melalui identifikasi
secara molekuler.

Mananase adalah enzim yang berfungsi untuk mengkatalisis proses

hidrolisis manan yang merupakan senyawa polisakarida. Degradasi
manan oleh bakteri, fungi, cendawan dan tanaman memerlukan variasi
enzim seperti ß-Mananase (EC 3.2.1.78) yang dapat menghidrolisis ß-1,4-
D manopiranosil pada kerangka utama polimer manan seperti pada
galaktomanan dan glukomanan untuk menghasilkan rantai pendek
manooligosakarida. Selanjutnya senyawa tersebut dihidrolisis oleh kerja
enzim ß-manosidase (EC 3.2.1.25) dan a-galaktosidase (EC 3.2.1.22)
menghasilkan manosa dan galaktosa (Duffaud et al. 1997).
Enzim Mananase merupakan kelompok enzim glikosida hidrolase
yang dapat mendegradasi manan dan heteromanan. Enzim glikosida
hidrolase (E.C 3.2.1) merupakan kelompok enzim yang telah diketahui
dapat menghidrolisis ikatan glikosidik pada oligo-dan polisakarida. Untuk
menghidrolisis substrat yang mempunyai struktur kompleks maka
dibutuhkan kombinasi berbagai macam enzim untuk dapat mendegradasi
menjadi senyawa manooligosakarida. Enzim yang termasuk dalam
kelompok glikosida hidrolase mempunyai sumber yang berbeda-beda
yaitu bakteri, kapang maupun jamur sehingga enzim tersebut dapat
diklasifikasikan menjadi kelas yang berbeda menurut urutan sekuen asam
amino dan struktur tiga dimensi molekul enzimnya (Dhawan et al. 2007).

Gambar 3. Pemotongan heteromanan oleh komplek enzim mananase

(Kurakake et al. 2001).

Bakteri manolitik adalah jenis bakteri yang memproduksi enzim ß-

mananase dan mampu memecah senyawa mannan. Enzim ß- mananase
merupakan enzim yang menghidrolisis mannan menjadi manosa dan
manno-oligosakarida (Yopi et al. 2006; Sumardi et al. 2006; Wizna 2008).
Enzim pemecah mannan banyak berperan dalam industri seperti
pengolahan pangan, pakan ternak, deterjen, tekstil, dan kertas. Enzim ini
dapat dihasilkan oleh mikroorganisme yang umumnya terdapat di tanah,
kompos, atau rumen hewan (Hilge et al., 1998).
Mikroba yang banyak ditemukan sebagai penghasil enzim ß-
mananase adalah kelompok bakteri, diantaranya Bacillus subtilis NM-39
(Mendoza et al., 1994), Thermotoga neopalitana 5068 (Duffaud et al.,
1997), Geobacillus stearothermophilus L-07 (Sumardi et al., 2006);
Bacillus subtilis WY34 (Jiang et al., 2006); Paenibacillus sp. D23 (Chandra
et al., 2011), dan Bacillus sp. SM-1.4 (Hernentis et al., 2013).
Isolasi mikroorganisme dilakukan untuk mendapatkan isolat tunggal
selulolitik. Isolat selulolitik diperoleh dari sumber isolasi dengan
menumbuhkan sampel dalam media selektif yang mengandung substrat
manan. Sampel dengan media selektif kemudian diinkubasikan selama 2-
3 hari pada suhu tertentu. Isolat selulolitik ditentukan dengan pengamatan
zona bening. Adanya zona bening disekitar koloni mikroba menandakan
bahwa terjadi proses hidrolisis substrat manan oleh enzim mananase yang
dihasilkan koloni tersebut (Sigres & Sutrisno, 2015).
Zona bening diukur berdasarkan indeks selulolitik (IM) yang
merupakan perbandingan antara diameter zona bening dengan diameter
koloni. Zona bening yang dihasilkan berbanding lurus dengan aktivitas
enzim yang dihasilkan oleh isolat. Zona bening semakin terlihat jelas
dengan penambahan congo red (Downie et al., 1994). Congo red akan
berikatan dengan polisakarida manan yang memiliki ikatan ß-1.4-D-
manopiranosil dalam media agar sehingga media akan berwarna merah.
Sebaliknya hasil hidrolisis enzim mananase berupa monosakarida (tidak
memiliki ikatan ß-1.4-D-Manopiranosil) dan oligosakarida (memiliki sedikit
ikatan ß-1.4-D-Manopiranosil) yang ada disekitar koloni akan berwarna
bening setelah pembilasan dengan NaCl 1% (Sumardi, 2007).
Proses hidrolisis selulosa dapat dilakukan dengan menggunakan asam
dan suhu tinggi. Proses ini relatif Mahal karena membutuhkan energi yang
besar serta dapat mengakibatkan degradasi produk monosakarida yang
dihasilkan sehingga produk yang dihasilkan rendah. Selain itu, Riyanti
(2008) melaporkan efisiensi proses hidrolisis dengan asam masih rendah
karena proses yang dilakukan cukup panjang dan membutuhkan
banyak tahapan. Kekurangan lain dari proses ini antara lain yaitu
penanganan limbah asam yang tidak mudah. Hidrolisis selulosa dengan
menggunakan enzim selulase mulai dikembangkan pada tahun 1980-
an (Coral et al., 2002). Hidrolisis secara enzimatik melibatkan proses yang
lebih ramah lingkungan, efisien, dan murah karena tidak memerlukan
energi tinggi.

Enzim selulase adalah suatu sistem enzim yang terdiri atas tiga tipe enzim
utama yaitu kompleks endo-β-1,4-glukanase (CMCase, Cx selulase
endoselulase, atau carboxymethyl cellulase), kompleks ekso-β-1,4-
glukanase (aviselase, selobiohidrolase, C1 selulase), dan β-1,4-
glukosidase atau selobiase (Crueger and Crueger, 1984). Pemanfaatan
enzim selulase yang diekstraksi dari bakteri sangatlah luas. Selain dalam
bidang pangan dan industri, pemanfaatan enzim selulase dari bakteri
dapat memberikan solusi dalam masalah pencemaran yakni mengurangi
jumlah limbah selulosa seperti timbunan daun di area pembuangan akhir,
limbah pertanian, rumput laut di tepi pantai serta dapat menjadi nilai
tambah terhadap pemanfaatan limbah menjadi olahan pupuk organik. Hal
ini dikarenakan limbah organik merupakan bagian dari masalah
lingkungan yang berpotensi menjadi faktor pencemar lingkungan apabila
dibiarkan dan tidak dikelola dengan baik dan benar. Kesuluruhan bahan
tersebut dapat dimodifikasi untuk memproduksi berbagai bahan yang
berguna untuk sektor pertanian dan biogas, dengan menggunakan enzim
selulose. Beberapa penerapan produk organik yang bermanfaat untuk
pertanian diantaranya MOL (Local Microorganism), POC (pupuk organic
Cair), pupuk organic padat dan bokasi serta pestisida organik.