pewarnaan gram

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsiatnupun

membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan.
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang bayak digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi guna pencirian don identifiknsi bakteri. Pewarnaan gram memilahkan
bakteri menjadi kelompok Gram positif dam Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna ungu
karena bnkteri tersebut mengiknt kompleks zat warna kristal ungu-iodium, sednngkan bakteri
Gram negntif berwnrna merah karena mengikat zat warna sekunder yang berwarna merah.
Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur dinding sel bakteri don
perbedaan kandungan asam ribonukleat antnara bakteri Gram positif don Gram negatif.
Pewarnaan dengan zat warna yang mengandung yodium menyebabkan amilopektin
berwarna biru atau keunguan, sedangkan glikogen berwarna merah kecoklatan atau merah
keunguan. Dengan melakukan pewarnaan sangat memungkinkan kita untuk melihat bakteri
dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dengan morfologi
yang soma.
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus
(bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah
melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan
gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram
negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (textbook,
2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat di
identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah organism yang dibentuk dalam
kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut
dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008).
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan
identifikasi data apakah gram positif atau gram negative sehingga diperlukan adanya praktikum
ini dilakukan agar mengetahui jalanya mekanisme pewarnaan gram. Pewarnaan Gram atau
metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan
untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai
larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan
pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938)
yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan
bakteri Klebsiella pneumonia. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan
menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif
(berwarna merah).

Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat)
warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak
mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir
pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol
dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena
itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding
sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua
genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya
sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang
umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti
pewarnaan sederhana atau Gram.
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram
positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri
gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.
Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan sederhana
yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis yang sudah di
fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara
sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan
differensial digunakan untuk bakteri.
Menurut Pratiwi (2009), stain merupakan gram-gram yang tersusun atas ion positif dan
negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor (chromofor). Pewarnaan pada
dasarnya adalah prosdur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang dapat
menonjolkan strktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna ungu tua
dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat Kristal violet setelah
dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat warna air
tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh perbedaan
struktur kimiawi dinding selnya.(wapedia,2010)
Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap,
maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dngan zat warna yang berlainan,
yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol
maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang tampak
ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat
warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan
(bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 1984)

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada
muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,
maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red,
dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO.
Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian
sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel.
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif
menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
1. Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
2. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk
melunturkan zat warna utama.
3. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok, salah satu di
antaranya, bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna ungu Kristal dan karenanya
tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu Kristal ketika
dicucci dengan alkohol dan waktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin,
tampak bewarna merah (Zubaidah,2006).
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan
Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.
Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada
struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram
negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian
alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.
Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram
positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Stuktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu :
1. Struktur dasar (dimiliki hamper semua jenis bakteri )
Meliputi : dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribasom, DNA, dan granula
penyimpanan.
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola gas dan endospora
Sthaplyococcus adalah bakteri gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang
berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua
jenis warna staphlycoccus yaitu : sthapylococcus aureus yang berwarna kuning dan
sthapylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karateristik yang dimiliki sthapylococcus
aureus diantaranya hemolytic pada darah segar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat
tumbuh paa suhu erkisar antara 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl padakonsentrasi
tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selin itu, biasanya s. aeureus
merupakan pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru,
radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan
endocarditis) serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins
menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan super antigens ke dalam aliran
darah (kenneath, 2008)
Menurut kenneath (2008), Escherichia coli termasuk dalam family Enterobacteraceae
yang termasuk gram negative dan berbentuk batangyang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah
besar di dalam usus manusia, yaitu membatu sistem pencernaan manusia dan
melindunginya darbakteri pantogen, akn tetap pada strain baru dari e. coli merupakan pathogen
berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (
hus). Peranan yanag menguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indicator
pada percemaraan air serta mendeteksi patoge pada feses manusia yang disebabkan oleh
salmonella typi.( mikrolibrary, 2008). Endospora adalah organism yang dibentuk dalam kondisi
yang stress dan kurang nutrisi, yang memiliki kemunginan untuk tetap berlanjut dilingkungan
sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram
positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
- lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung
asam tekoat.

Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

- Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai
lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam
tekoat.
-

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
Tidak peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin