Gram Staining

I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula
diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa,
salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah
satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri.
Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk
sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode
empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram
positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka,
metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian
gram (1884).
Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena
menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena
pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga
bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.
Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel
selapis. Karena bakteri Gram positif bakteri yang dapat menahan kompleks
pewarnaan primer ungu Kristal iodium sampai akhir prosedur dan sel bakteri
berwarna biru gelap atau ungu. Sedangkan baktri gram negatif merupakan bakteri
yang kehilangan kompleks ungu Kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol
namun kemudian terwarnai dengan pewarnaan tandingan, yaitu safranin sehingga
sel-sel tampak berwarna merah muda pada akhir pewarnaan dan mempunyai
dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel kegunaannya yaitu,
untuk melihat atau mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan memberikan sifat
reaksi pewarnaan bakteri yang dapat diketahui dengan melihat apakah termasuk
gram negatif (berwarna merah) atau gram positif (berwarna biru).
 B. Tujuan

C. Manfaat
Manfaat dari praktikumm ini ialah mengetahui morfologi dari sel, yaitu
jenis gram, bentuk sel dam penataan sel.
II. DASAR TEORI
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat
terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.
Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan
diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal,
pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan
gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel
bakteri (Umsl, 2008).
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu
di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif
(zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat
pewarna- Na+). Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol
disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma
sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan
bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin blue
adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam
ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat
pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja.
Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna.
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan
Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan
pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang
akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah
memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan
pewarna yodium, setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95%
selama 30 detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta
warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk
senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah
apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci
dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri
gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram
dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan
karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur
pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan
larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol.
Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di
tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram
positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium
dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan
terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada
bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella,
Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll.
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua
kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama
disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas.
Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna
dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat
warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat
mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna
pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat
pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan
iodium, alkohol dan safranin.
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding
sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka
pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri
menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi
selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan
kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan
peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi
berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan
sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri
atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B
(cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C(Aseton, Alcohol), Gram D (merah)
(Safranin, Alcohol, Aquades). Pewarnaan ZN digunakan untuk mengidentifikasi infeksi
yang disebabkan oleh bakteri tahan asam, conttohnya adalah Micobacteriom tuberculosis,
Micobacterium leprae, Mycobacterium atypical seperti Mycobacterium avium
intraseluler / Mycobacterium avium complex yang tumbuh pada 41C yang menyerang
sistem imun, Mycobacterium marinum dan Mycobacterium ulcerans yang tumbuh pada
31C dan menginfeksi kulit, Nocardia, Legionella mycdatci, Rhodococcus, Tsukamurella,
Gordonia / Gordona, Cryptosporidium, Isospora, Cyclospora, Sarcocytis, dll. Contoh
bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan ZN tetapi cocok pada Kinyoun
adalah Nycordia, Rhodococcus, Tsukamurella, dan Gordonia. Hasil pewarnaan ZN akan
mengidentifikasikan : 1. Bakteri tahan asam Bakteri tahan asam baru akan
terkarakterisasi setelah pewarnaan setelah pemberian asam‐ alkohol. Hasilnya berwarna
merah. 2. Bakteri tidak tahan asam Hasilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi
pada pewarnaan pertama oleh asam‐alkohol, jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa
counter stain. Sifat tahan asam pada bakteri tahan asam disebabkan karena dinding selnya
terdiri atas peptidoglikan, arabinogalaktan, dan lipid (50%‐nya tersusun atas asam
mikolat). Asam mikolat merupakan asam lemak ranai panjang yang terdiri atas 34‐90
karbon. Pewarnaan ZN terdiri dari ZN‐A (merah) (Basic fusion, Alcohol, Fenol,
Aquades), ZN‐B (tidak berwarna) (HCl, Etil alcohol), dan ZN‐C (biru) (Methylen blue,
Aquades).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:
pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan
asam), pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan
spora, pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri
(pewarnaan Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan
pewarnaan negative.
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai
latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang
keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar
kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
 Skema dinding sel bakteri gram positif

Skema dinding sel bakteri gram negative

III. METODE PERCOBAAN

 Alat :
1. Tray untuk meletakkan slide
2. Slide gelas (object glass & cover glass)
3. Loop / ose
4. Lampu spirtus / Bunsen
5. Mikroskop
 Bahan yang digunakan :
1. Kultur mikroorganisme (gram positif, gram negative, dan teast)
2. Satu set bahan pewarnaan gram: Crystal violet, iodine, alcohol 95%, &
safranin.
3. Aquades
 Prosedur percobaan
1. Persiapan fixed shear
a. Memanaskan slide (object glass) dengan cara melewatkannya
beberapa kali pada nyala api kemudian membiarkannya hingga
dingin.
b. Melewatkan kawat loop yang sudah dilewatkan nyala api ke dalam
aqudest steril sehingga sebagian kecil dari kawat loop penuh
dengan air, kemudian meletakkannya pada slide. Mengambil
sejumlah kecil kultur dari loop yang steril yang akan diamati
dengan meletakkannnya dan mencampurkan pada slide. Sterilkan
loop.
c. Menyebarkan kultur untuk membentuk lapisan tipis.
d. Mensterilkan loop & mengembalikannya ke tempat semula.
e. Mengeringkan slide di tempat terbuka. Fix shear dengan
melewatkan slide secara tepat sebanyak 3 kali melalui nyala api
(shear pada bagian atas). Dinginkan slide.
f. Stain bagian kultur yang ada.
2. Pewarnaan gram stain
a. Meneteskan crystal violet pada lapisan kultur yang ada. Diamkan
selama 1 menit.
 b. Mengalirkan air secara perlahan-lahan pada slide untuk
mencucinya, kemudian kering anginkan.
c. Meneteskan iodine di atas slide dan diamkan selama 1 menit.
d. Menyuci slide dengan air, kemudian mengeringkannya.
e. Menambah alcohol 95% tetes demi tetes hingga alcohol yang turun
berwarna jernih, kemudian membilas dengan air dan kering
anginkan.
f. Meneteskan safranin dan diamkan selama 45 detik, kemudian bilas
dengan air dan kering anginkan.
g. Mengamati sel yang telah diwarna dengan menggunakan
mikroskop dan menggambarkannya pada laporan.
IV. SKEMA KERJA
V. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Hasil Percobaan
2. Pembahasan
Dalam praktikum kali ini, bakteri yang kami amati adalah
Ralstonia eutropha dan Staphylococus aureus. Kedua bakteri tersebut
akan kami amati berdasarkan perbedaannya dalam pewarnaan gram.
Sebelum memulai praktikum, meja praktikum yang berada dalam
Laminar flow disterilkan dengan penyemprotan etanol. Kemudian kami
mensterilkan object glass dengan cara melewatkannya beberapa kali pada
nyala api. Demikian pula dengan kawat ose yang kami pijarkan dalam
nyala api.
Object glass yang telah kami panaskan kemudian kami teteskan air
di atasnya. Dengan kawat ose yang telah kami pijarkan, kami mengambil
bakteri Staphylococus aureus dari kultur dan memindahkannya ke atas
object glass.
Kemudian object glass kami kering anginkan dalam laminar flow
hingga kering. Pengerjaan pewarnaan berikutnya dilakukan di ruang
terbuka.
 Pewarna pertama yang kami tambahkan adalah crystal violet yang
merpakan primary stain, dan kemudian kami diamkan selama 1 menit.
Setelah itu, object glass kami bilas dengan aquadest. Kemudian kami
tambahkan iodine untuk membentuk kompleks dengan crystal violet agar
warna yang teramati lebih kuat. Kemudian didiamkan selama 1 menit.
Kemudian kami tambahkan alcohol sebagai decolorizing agent.
Setelah alkohol yang turun tidak lagi berwarna, kami tambahkan safranin
sebagai counter stain dan didiamkan selama 45 detik.
Setelah itu object glass kami amati di bawah mikroskop dan kami
peroleh gambar sebagai berikut:

Berdasarkan gambar diatas, dapat diamati bentuk koloni adalah

serupa anggur dan berwarna ungu.Warna ungu yang teramati adalah hasil
dari pewarnaan gram yang kami lakukan. Pada saat penambaham pewarna
crystal violet bakteri tersebut menyerap warna ungu dari pewarna tersebut.
Karena bakteri ini termasuk dalam bakteri gram positif, maka ketika
ditambahkan alkohol, protein yang terdapat pada dinding sel akan terlarut
dan menahan pewarna crystal violet di dalamnya. Sehingga ketika
ditambahkan alkohol sebagai decolorizing agent, pewarna tersebut tidak
ikut larut.
Bakteri kedua yang kami amati adalah Ralstonia
eutropha.Pemindahan kami lakukan sama seperti dengan cara diatas.
Pewarna pertama yang kami tambahkan adalah crystal violet yang
merpakan primary stain, dan kemudian kami diamkan selama 1 menit.
Setelah itu, object glass kami bilas dengan aquadest. Kemudian kami
tambahkan iodine untuk membentuk kompleks dengan crystal violet agar
warna yang teramati lebih kuat. Kemudian didiamkan selama 1 menit.
Kemudian kami tambahkan alcohol sebagai decolorizing agent.
Setelah alkohol yang turun tidak lagi berwarna, kami tambahkan safranin
sebagai counter stain dan didiamkan selama 45 detik.
 Setelah itu object glass kami amati di bawah mikroskop dan kami
peroleh gambar sebagai berikut:

Berdasarkan gambar diatas, dapat diamati bentuk koloni adalah

serupa batang. Warna yang kami harapkan adalah warna merah karena
bekteri Ralstonia eutropha adalah bakteri gram negative. Namun yang
teramati adalah warna abu-abu. Hal ini dikarenakan pada saat penambahan
pewarna crystal violet bakteri tersebut menyerap warna ungu dari pewarna
tersebut. Karena bakteri ini termasuk dalam bakteri gram negative , maka
ketika ditambahkan alkohol, lemak yang terdapat pada dinding sel akan
terlarut sehingga pori-pori pada dinding sel membesar dan alkohol akan
melarutkan pewarna crystal violet di dalamnya. Dan ketika diberi pewarna
safranin, maka pewarna safranin yang berwarna merah akan dengan
mudah masuk ke dalam sel.
Perbedaan yang terjadi antara warna teoritis dan warna hasil
percobaan dikarenakan waktu kontak yang kurang lama dengan pewarna
safranin sehingga warna yang teramati di mikroskop tampak pudar.

VI. KESIMPULAN DAN SARAN

VII. DAFTAR PUSTAKA