PRAKTIKUM V

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN MIKROASSAI (BRADFORD)

A. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dalam larutan uji berdasarkan
metode Bradford.

B. Landasan Teori
Protein merupakan komponen penting yang bertindak sebagai building block pada
hampir semua makhluk hidup. Protein terdiri atas sejumlah unsur kimia, antara lain 50%
karbon, 7% hydrogen, 23% oksigen, 16% nitrogen, 3% belerang, dan 3% fosfor. Hidrolisis
protein oleh asam atau enzim dapat menghasilkan asama-asam amino. Sejauh ini, telah
diketahui terdapat 20 jenis asam amino.13
Pengukuran kadar protein umumnya dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara
kuatitafif dan kuantitatif. Contoh metode yang termasuk dalam kategori kualitatif antara lain
reaksi Xantoprotein, Hopkins-Cole, Millon, dan sakaguchi, sedangkan yang termasuk dalam
kategori kuantitatif antara lain metode Kjeldahl, Lowry, dan Bradford. Pada percobaain ini
dilakukan pengukuran kadar protein dalam suatu larutan dengan metode Bradford. Metode
Bradford merupakan metode analisa kadar protein yang didasarkan pada pengukuran absorbansi
protein dalam suatu larutan yang telah ditambahkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB)
(Gambar 3).13

Gambar 3. Metode Bradford dengan menggunakan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB)

Pengikatan antara protein dan pewarna tersebut menyebabkan perubahan warna CBB
yang berwarna merah dalam kondisi asam menjadi biru. Selama proses pengikatan kompleks
protein dan pewarna, terjadi pemberian elektron bebas dari perwarna CBB merah ke protein yang
mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (tirosin, triptofan, dan
fenilalanin) atau bersifat basa (arginin, histidin, dan leusin). Hal tersebut menyebabkan lapisan
hidrofobik protein berikatan dengan bagian non-polar pewarna melalui gaya van der waals yang
berujung pada mendekatnya posisi positif protein ke bagian yang bermuatan negatif dari pewarna
CBB (Gambar 4).14

Gambar 4. Kompleks pengikatan antara protein dan pewarna Coommassie Briliant Blue

Pengikatan protein menyebabkan perubahan warna dari merah kecoklatan (reagen

coomassie dalam keadaan bebas) dengan (Amax = 465 nm) menjadi biru dengan (Amax = 595
nm). Perubahan menjadi warna biru tersebut terus bersifat stabil karena terjadinya penstabilan
anion dari pewarna biru commassie oleh kation dari pewarna merah coomassie (Gambar 5).

Gambar 5. Perubahan warna pewarna coommassie dari merah ke biru

Terdapat dua jenis assay protein dengan metode Bradford ini, yaitu standard assay
yang cocok digunakan untuk pengukuran kadar protein dengan kisaran 10--100µg, dan
microassay yang dapat mendeteksi protein dengan kisaran 1--10µg. Metode Bradford memiliki
ketelitian yang cukup tinggi, cepat, dan efisien dengan pengikatan protein dan pewarna terjadi
setelah kurang lebih 2 menit, serta stabilitas warna yang dapat berlangsung selama kurang lebih
1 jam.

C. Alat dan Bahan

 Alat:
1. Alat spektrofotometer
2. Peralatan gelas
3. Pipet mikro
Bahan:
1. Zat warna biru (Bio-Rad Lab) yang dilarutkan dalam asam fosfat dan methanol
2. Larutan standar albumin sapi (BSA) (25µg/mL)
3. Larutan uji: serum (U1 dan U2)

D. Cara Kerja
1. Menyiapkan tabung reaksi dan memipetkan sebagai berikut (Duplo):
Standar Uji 1 Uji 2
1 2 3 4 5 6
Tabung 10
0 2,5 5 15 20
µg/m
µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
L
Standar BSA
- 0,1mL 0,2mL 0,4mL 0,6mL 0,8mL
(25 µg/mL)
Larutan uji
- - - - - - 0,8mL 0,8mL
protein
0,8 0,7 0,6 0,4
Akuades 0,2 mL -
mL mL mL mL
Larutan 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
0,2 mL
warna mL mL mL mL mL mL mL
2. Menggunakan kuvet 1mL, dilakukan pembacaan serapan pada panjang gelombang 595nm
dengan tabung 1 sebagai blanko.
3. Analisa hasil

E. Hasil Pengamatan
Tabel 8. Kadar BSA dan Absorbansi pada λ 595 nm
 Kadar BSA Absorbansi Absorbansi
(µg/mL) Rata-rata
I II
0 0 0 0
2,5 0.132 0.095 0.1135
5 0.244 0.23 0.237
10 0.469 0.477 0.473
15 0.613 0.565 0.589
20 0.718 0.705 0.7115

Dari data diatas, didapat kurva standard persamaan garis linear sebagai berikut:

Kurva Standar BSA Metode Bradford

0.8
0.7 20, 0.7115
0.6
y = 0.036x + 0.0393
Absorbansi

0.5 R² = 0.9748
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 5 10 15 20 25
Kadar BSA (μg/mL)

Keterangan: y = besar serapan yang dibaca pada spektrofotometer

x = kadar larutan standar BSA (µg/mL)
Dari kurva standar, didapatkan persamaan garis: y = = 0.036x + 0.0393
Sehingga, didapatkan nilai x = (y – 0,0393)/ 0,036

Tabel 9. Kadar Protein Larutan Uji pada λ 595 nm

Absorbansi Absorbansi
Larutan Uji
I II Rata-rata
U1 0.077 0.084 0.0805
U2 0.16 0.166 0.163

Maka kadar protein pada larutan uji berdasarkan persamaan garis linear pada kurva standar
sebagai berikut;
U1 = (0,0805-0,0393)/ 0,036= 1,144µg/mL
 U2 = (0,163-0,0393)/ 0,036= 3,436µg/mL

F. Pembahasan
Empat metode yang umum digunakan dalam menentukan konsentrasi protein dalam
suatu larutan adalah:
1. Mengukur sifat intrinsic protein yang menyerap sinar UV
2. Uji Lowry dengan menghasilkan kompleks senyawa protein-warna yang terlihat
perubahannya)
3. Uji Smith copper/Bicinchoninic
4. Uji Bradford
Dari keempat uji tersebut, uji Bradford merupakan uji yang sering digunakan dalam
lab-lab biokimia. Hal tersebut dikarenakan nilai ketelitian dari uji tersebut cukup tinggi akibat
koefisien penghentian kompleks larutan BSA berjalan konstan selama rentang konsentrasi
flip-10. Rentang linier sampel protein dari 0--20 µg/mL) menunjukkan bahwa semakin tinggi
konsentrasi, maka semakin banyak protein yang terikat oleh pewarna CBB tersebut.
Keuntungan lain dari uji Bradford adalah uji tersebut lebih cepat karena langkah-langkah
pencampuan reagen dapat diulang dalam beberapa menit sehingga dapat mengefektifkan
waktu percobaan. Metode tersebut juga cukup akurat untuk sampel menentukan kadar protein
dari fraksi sel dan menentukan konsentrasi protein untuk elektroforesis gel. Sensitifitas uji
Bradford berkisar antara 1--100 µg/mL.
Kelemahan utama uji Bradford adalah kekhususan reagennya yang dapat
mengakibatkan variasi respon test untuk protein yang berbeda. Oleh karena itu, dianjurkan
untuk memilih protein yang memberikan nilai absorbansi mendekati konsentrasi sampel
protein yang diujikan. Selain hal tersebut, meningktanya konsentrasi detergen dalam larutan
protein juga menyebabkan terganggunya pengukuran konsentrasi protein dengan metode ini.
Salah satu contoh detergen tersebut adalah sodium dodesil sulfat (SDS) yang sering
ditemukan dalam ekstrak protein karena pada umumnya SDS digunakan untuk mengelurakan
isi sel dengan cara merusak lapsian ganda membran lipid.
Larutan BSA adalah protein yang paling berlimpah dalam serum. Larutan ini berfungsi
dalam transportasi asam lemak, menjaga cairan agar tidak bocor keluar dari sistem peredaran
darah, dan peran terbatas dalam pemeliharaan pH. Larutan BSA sering digunakan untuk
 membantu menstabilkan larutan encer enzim di laboratorium atau untuk mencegah antigen
non-spesifik mengikat antibodi. Larutan BSA dan IGg adalah larutan standar yang biasa
digunakan untuk menentukan kadar protein dengan metode Bradford.2
Dari data percobaan terhadap larutan standar BSA mulai dari konsentarsi 0 - 20µg/mL,
diperoleh nilai absorbansi yang berkisar antara 0 - 0,236. Hasil tersebut kemudian diplot ke
grafik kurva standar dan kemudian diperoleh nilai persamaan linearnya sebesar y = 0,0105x +
0,0341. Berdasarkan persamaan tersebut, kemudian kita memeroleh kadar protein pada
larutan uji/serum sebagai berikut:
U1 = 1,142 µg/mL
U2 = 3,440 µg/mL
Hal tersebut sesuai dengan literatur yang mengatakan bahwa uji Bradford digunakan
untuk mengetahui kadar protein dengan kisaran 1--100 µg/mL.

G. Kesimpulan
Pengukuran kadar protein dengan metode microassay Bradford pada percobaan
menunjukkan bahwa uji tersebut benar digunakan untuk mengetahui kadar protein dengan
kisaran antara 1--100µg/mL (U1 = 1,142 µg/mL, U2 = 3,440 µg/mL).