LAPORAN PRAKTIKUM

REKAYASA GENETIKA

BAB III
Pembuatan Sel Kompeten dan Transformasi Plasmid

KELOMPOK RE2 :

ROY ARDY COLAS NAPITUPULU (205100500111012)

FRANSISKUS RADYAPUTRA A.
ARYA RAKA RAINNANTYA M.
SELLENA SALSABILA C. N.
ADMIRAL ALIM
CATUR ROFIQOL ILMA I.
ADAM FARISQI
RAYHAN ZULNA GHIFFARI
AULIA PRAJNNA PARAMITHA
1ALQIH FATIMAH AZZAHRA
(205100500111016)
(205100500111017)
(205100500111022)
(205100500111023)
(205100500111024)
(205100500111026)
(205100500111029)
(205100500111032)
(205100500111036)

ASISTEN PRAKTIKUM :
KADEK BINTANG INDAH LESTARI

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI INDUSTRI

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2022
 Kelas RE
Kelompok RE2

Pembuatan Sel Kompeten dan Transformasi

3 Plasmid
DIAGRAM ALIR
1. Pembuatan Starter E. Coli DH5α

1 Koloni E. Coli DH5α tanpa plasmid

Diinokulasi kedalam 2 ml LB Broth

Diinkubasi 12 jam pada suhu 37 C

Hasil
 Kelas RE
Kelompok RE2

2. Pembuatan Sel Kompeten

2 mL starter

Diinokulasikan pada 100 mL LB Broth no Amp

Diinkubasi pada suhu 37℃

Diukur OD hingga mencapai 0,34 – 0,4 setiap jam dan tiap 20

menit setelah OD 0,2 dengan λ = 600 nm

Kultur dimasukkan dalam falcon tube 50 ml dalam es batu

Diinkubasi dalam es selama 10 menit

Di-sentrifuge pada suhu 4℃, 3000 rpm, 15 menit

30 mL ice cold MgCl₂ Dibuang supernatan

Di-pipetting secara perlahan hingga homogen

Di-sentrifuge pada suhu 4℃, 3000 rpm (2000 x g), 15 menit

Dibuang supernatan

Dilakukan sebanyak dua kali (2x)

30 mL ice cold CaCl₂

Di-pipetting secara perlahan hingga homogen

Di-sentrifuge pada suhu 4℃, 3000 rpm (2000 x g), 15 menit

Dibuang supernatan

Dilakukan sebanyak dua kali (3x)

 Kelas RE
Kelompok RE2

2 mL ice cold Solution A

Di-pipetting secara perlahan hingga homogen

Di-sentrifuge pada suhu 4℃, 3000 rpm (2000 x g), 10 menit

2 mL ice cold Solution A Dibuang supernatan

Di-pipetting secara perlahan hingga homogen

Dipindahkan dalam mikrotube dengan volume 100 μL

Disimpan pada suhu -80℃

Hasil
 Kelas RE
Kelompok RE2

3. Transformasi dengan metode heat shock

100µl sel kompeten E.coli DH5α

Dicairkan dalam wadah es batu

5µl plasmid pUC18
Diketuk-ketuk perlahan

Dimasukkan dalam wadah es 3 menit

Dimasukkan waterbath 42⁰C; 90 detik

Dimasukkan dalam wadah es 10 menit

400µl SOC
Diinkubasi 37⁰C; 1 jam; 120 rpm

Hasil
 Kelas RE
Kelompok RE2

LAPORAN PRAKTIKUM
Praktikum 3. Pembuatan Sel Kompeten dan Transformasi Plasmid
1. Mengapa pada LB agar ditambahkan ampisilin konsentrasi 100 µg/mL?
Penambahan ampisilin pada media tumbuh E. coli berupa LB berfungsi sebagai agen
penguji resistensi E. coli terhadap antibiotik. Koloni yang pada akhirnya mampu tumbuh
merupakan koloni yang resisten terhadap ampisilin dikarenakan pada koloni-koloni
tersebut telah tersisip gen bla yang menyandi β-lactamase pemecah cincin β-lactam
sehingga E. coli menjadi resisten terhadap ampisilin. Oleh karena itu, ampisilin berfungsi
sebagai penanda keberhasilan proses transformasi DNA plasmid serta mempermudah
proses isolasi DNA mengandung plasmid resisten antibiotik sebab hanya koloni yang
mengandung gen resisten antibiotik yang dapat tumbuh pada media mengandung
ampisilin. Konsentrasi 100 µg/mL dipilih berdasarkan batas konsentrasi ideal ampisilin
yang mampu mengeliminasi koloni tanpa gen penyandi β-lactamase tersebut tanpa
menyebabkan lemahnya dinding sel serta lepasnya β-lactamase akibat konsentrasi
ampisilin yang terlalu tinggi dari batas tersebut (Lee et al., 2015).

2. Apa peranan dari sel Escherichia coli DH5α?

Sel Escherichia coli DH5α merupakan salah satu bahan yang diperlukan dalam
melakukan transformasi. Escherichia coli DH5α adalah bakteri hasil rekayasa yang
mampu dan berperan untuk memaksimalkan efisiensi proses transformasi. Sel ini
mengalami beberapa mutasi pada gen-gennya yang masing-masing hasil mutasi memiliki
perannya sendiri dan membantu proses transformasi. Beberapa di antaranya adalah
menghasilkan plasmid yang stabil dan kualitas yang baik, tidak menyebabkan
rekombinasi gen homolog terjadi sehingga vektor dapat lebih stabil, dan dapat tetap
tumbuh meskipun sumber nutrisi pada media terbatas (Fernanda, 2017).

3. Apakah sel Escherichia coli DH5α dapat diganti dengan sel mikroorganisme yang lain?
Jelaskan alasan Anda!
Sel E. coli DH5α merupakan salah satu strain E. coli yang umum dipakai dalam
transformasi genetic, sebab strain E. coli ini memiliki mutasi-mutasi yang membuatnya
dapat ditransformasi dengan lebih mudah, atau dengan kata lain merupakan sel kompeten
yang baik. Beberapa mutase tersebut diantaranya adalah mutasi yang mengaktivasi
enzim-enzim tertentu yang berkaitan dengan transformasi (recombinase dan
endonuclease), serta mutasi yang menghilangkan sebagian gen pengkode beta
galactosidase pada gen lacZ (mutasi lacZM15). Mutasi lacZM15 ini memungkinkan
adanya blue-white screening, sebab bagian gen yang hilang tersebut tersedia pada
plasmid-plasmid tertentu, dan ketika tranformasi berhasil dilakukan, kedua gen
ditranslasi menjadi komponen-komponen yang dapat digabung menjadi enzim beta
galactosidase yang lengkap (Hamed et al, 2020).
 Kelas RE
Kelompok RE2

Dalam proses transformasi, terdapat banyak metode transformasi, dan metode

transformasi yang dilakukan akan dipilih berdasarkan beberapa hal, diantaranya plasmid
yang digunakan, gen insert, serta mikroorganisme yang akan dipakai. Untuk metode yang
digunakan pada praktikum ini, sudah diatur sedemikian rupa sehingga cocok untuk
mentransformasi E. coli DH5α, sehingga kemungkinan besar tidak cocok untuk
mikroorganisme lain. Namun, mikroorganismenya, baik spesies maupun strainnya, dapat
diganti apabila prosedurnya ikut diganti, atau memungkinkan dua/lebih mikroorganisme
berbeda, dengan tujuan yang sama yaitu transformasi sel. Misalnya, transformasi pada
DH5α dapat di-screening menggunakan blue-white selection. Apabila terdapat
mikroorganisme lain yang mampu discreening dengan metode yang sama (misalnya
memiliki mutase gen yang sama), maka mikroorganismenya dapat diganti. Oleh karena
itu, mikroorganisme mungkin diganti dengan syarat memiliki kriteria transformasi yang
mirip dengan DH5α, dan apabila prosedurnya menyesuaikan (Hamed et al, 2020).

4. Pada metode transformasi heat shock, mengapa dilakukan penambahan larutan CaCl2?
Jelaskan!
Pada pembuatan sel kompeten ini, plasmid rekombinan tidak dapat dimasukkan ke
dalam sel tanpa tahap persiapan terdahulu. Hal ini dikarenakan porositas sel yang tidak
memungkinkan plasmid untuk masuk. Karena itu dilakukan penambahan CaCl--2 untuk
melemahkan porositas dinding sel yang akan ditransformasi sehingga sel tersebut
menjadi sel kompeten. Dengan pelemahan dinding sel ini, plasmid rekombinan akan
dapat masuk ke dalam sel dengan lebih mudah pada saat proses heat shock (Mastutik dkk,
2015).

5. Apa peranan dari inkubasi pada suhu 4⁰C dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 42⁰C?
Heat shock merupakan metode tranformasi sel yang memiliki prinsip dengan cara
mengejutkan pada suhu tinggi selama beberapa detik. Metode heat shock umumnya
menggunakan suhu 42oC selama 2 menit. Suhu memiliki peranan penting dalam heat
shock, agar dapat terjadi kejutan, suhu awal sampel diturunkan terlebih dahulu. Dengan
cara menginkubasi sampel terlebih dahulu pada es suhu 0-4oC lalu selama 3 menit lalu
diinkubasi kembali pada suhu yang lebih tinggi yaitu 42oC selama beberapa menit.
(Bernadus dkk, 2019).

6. Jelaskan faktor yang mempengaruhi keberhasilan proses transformasi plasmid! (minimal 4)

Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan proses tranformasi plasmid
diantaranya adalah Konsentrasi antibiotik, Jenis antibiotik, Konsentrasi DNA,
Kompetensi sel, Jenis ion metal, dan suhu heat shock. Konsentrasi antibiotik
berpengaruh, jika konsentrasi antibiotic yang sesuai dengan jenis vector memungkinkan
koloni untuk tumbuh pada media, jika konsentrasi antibiotik tidak sesuai maka sel akan
mati atau tidak tumbuh. Jenis antibiotik juga mempengaruhi proses tranformasi karena
 Kelas RE
Kelompok RE2

jika jenis antibiotic tidak sesuai dengan resistensinya maka sel kemungkinan akan mati.
Konsentrasi DNA yang terlalu rendah memungkinkan koloni tidak dapat tumbuh.
Kompetensi sel berfungsi untuk menggangu keseimbangan kalsium dalam membrane
sehingga membran berhasil terbuka. Jenis ion metal mempengaruhi keberhasilan jika
divalent ion metal semakin baik. Suhu heat shock harus pada suhu yang spesifik yaitu
42oC, jika terlalu tinggi sel akan mati dan jika suhu terlalu rendah tidak efektif (Masfurah
et al, 2017).

7. Apa yang dimaksud dengan efisiensi transformasi?

Efisiensi transformasi merupakan metode untuk mengukur efektivitas proses
transformasi plasmid untuk memasukkan suatu gen asing ke sel inangnya. Tinggi
rendahnya efisiensi transformasi dipengaruhi oleh suhu dan waktu ketika dilakukan heat
shock, ukuran plasmid, serta metode transformasi itu sendiri. Semakin tinggi nilai
efisiensi transformasi yang dihasilkan maka semakin efektif pula proses transformasi
yang dilakukan (Patigu dkk., 2021).

8. Bagaimana cara menghitung efisiensi transformasi?

Perhitungan efisiensi transformasi dapat menggunakan formula efisiensi
transformasi (CFU/µg) sebagai berikut:
(Jumlah koloni bakteri × rasio pengenceran × volume transformasi awal) / (Volume
kultur yang diplatting × plasmid DNA atau vektor transformasi)
Jumlah koloni bakteri merupakan jumlah koloni yang terbentuk pada media yang
dapat dihitung dengan colony counter. Rasio pengenceran merupakan tingkat
pengenceran yang digunakandalam proses transformasi dan volume transformasi awal
adalah volume kultur total atau keseluruhan. Sementara itu, volume kultur yang diplatting
serta plasmid DNA atau vektor transformasi merupakan pembagi untuk mendapatkan
nilai berat hasil transformasi (Patigu dkk., 2021).
 Kelas RE
Kelompok RE2

KESIMPULAN
Praktikum ini bertujuan untuk melakukan proses transformasi plasmid kedalam sel inang
bakteri dengan menerapkan metode heat shock. Sel kompeten dibuat dengan prinsip bahwa
larutan garam dapat merubah permeabilitas atau porositas dinding sel. Hasil yang diperoleh
dari praktikum kali ini adalah diketahuinya keberhasilan proses transformasi dengan uji
resistensi antibiotik, uji ini digunakan untuk mengetahui berhasil atau tidaknya plasmid
diinsersikan kedalam sel inang. Jika plasmid mengandung gen insert, maka inang akan
bertransformasi sehingga menjadi resisten terhadap antibiotik ampisilin. Jika proses
transformasi ini berhasil, sel inang + plasmid yang ditumbuhkan pada media akan tumbuh.
Sebaliknya jika ternyata proses transformasi ini tidak berhasil atau sel inangnya kososng,
maka tidak akan tumbuh. Seleksi ini akan menunjukan bahwa efisiensi transformasi
(CFU/µg) adalah perbandingan jumlah plasmid terhadap jumlah transforman.
 DAFTAR PUSTAKA

Bernadus, Z. G., Fatimawati, dan B. Kolondam. 2019. “Transformasi Plasmid Yang

Mengandung Gen merB Pada Escherichia coli BL21(DE3)”. Jurnal PHARMACOM,
08(01): 197
Fernanda, S. (2017). Kloning Gen Penyandi Lysophospholipase dari Bacillus halodurans
CM1 ke Escherichia coli DH5α. Skripsi. Depok: Universitas Indonesia
Hamed, Ahmed A., Khedr, Mohamed, Abdelraof, Mohamed. 2020. Activation of LacZ gene
in Escherichia coli DH5α via α-complementation mechanism for β-galactosidase
production and its biochemical characterizations. Journal of Genetic Engineering and
Biotechnology 18(1): 80-94
Lee, H. J., Hyun, M. J., Moon, S. P., Woojun, P., Eugene, L. M., dan Che, O. J. 2015.
Recovery of Plasmid pEMB1, Whose Toxin-Antitoxin System Stabilizes an Ampicillin
Resistance-Conferring β-Lactamase Gene in Escherichia coli, from Natural
Environments. Applied and Environmental Microbiology, 81(1): 40-47.
Mastutik, Gondo., I’tishom, Reny., Hardjowito, Sunaryo., Putra, Suhartono Taat. 2015.
Kloning Gen Melanoma Antigen 1 (Mage-1) dari Jaringan Testis untuk Mendapatkan
Plasmid Rekombinan Mage-1. Majalah Kedokteran Bandung, 47(4): 199-206.
Patigu, R. F., Putri, W., Alfino, S., Yekti, A. P. 2021. Optimization of Heat Shock
Temperature and Time on the Transformation of pRGEB32 into Escherichia coli DH5α.
Jurnal Biologi Tropis, 21(3): 632-640.
SCREENSHOOT DAFTAR PUSTAKA