ISOLASI DNA PLASMID

4 tahapan kerja untuk isolasi plasmid dari bakteri :

1. Kultivasi sel dan pemanenan sel bakteri 2. Lisis sel 3. Pemurnian DNA plasmid 4. Pemekatan DNA plasmid

Pemisahan DNA plasmid dan DNA kromosom dapat dilakukan berdasarkan

Ukuran Konformasi Pemisahan berdasarkan ukuran * Ukuran terbesar plasmid hanyalah 8% dibanding ukuran kromosom E.coli * Cara pemisahan : a. lisis sel menggunakan campuran EDTA+lizosim dalam larutan sukrosa, diinduksi Triton-X b. Sentrifugasi, DNA plasmid dalam supernatan, sedangkan DNA kromosom dalam debris sel

Kelemahan : Sebagian kecil fragmen DNA kromosom akan terlarut dalam supernatan Plasmid yang berukuran besar akan terendapkan bersama debris sel.
Pemisahan berdasarkan konformasi

Plasmid dalam sel berada dalam konformasi supercoiled (disebut juga ccc = DNA covalently closed circular), sedangkan DNA kromosom berbentuk linier

2 cara pemurnian DNA plasmid

Denaturasi alkali Denaturasi dengan pemanasan Denaturasi alkali
Dasar dari teknik ini adalah dengan rentang pH yang sempit (penambahan NaOH pH 12-12,5) DNA non-supercoiled akan terdenaturasi, ikatan hidrogen rantai polinukleotida akan putus, akibatnya dapat dipisahkan dari supercoiled DNA Penambahan asam (penurunan pH) akan menyebabkan DNA kromosom beragregasi Penambahan SDS dan netralisasi dengan Na-asetat menyebabkan protein dan RNA menjadi tak terlarut

Sentrifugasi densitas gradien Etidium Bromida-CsCl

Dapat digunakan untuk memisahkan DNA,RNA dan protein Menggunakan etidium bromida sebagai pendeteksi keberadaan DNA