POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa
menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu
relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA.

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu
proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metoda PCR dapat
meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 10 6-107 kali.
Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus
PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target.

PRINSIP KERJA PCR

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh
enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid
dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan.

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus yang
tergantung oleh kebutuhan. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap
bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu
tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi
berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai
5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan
DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2
menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang
komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini
bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau
primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi atau DNA Polymerase extension

Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer
yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju
ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang
diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan

Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase (ditunjukkan oleh P pada
gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu
76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa
berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA
yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah
karena penambahan terjadi secara eksponensial.
KOMPONEN PCR

Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, ensim DNA polimerase yang
thermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermal cycler.

Template DNA

Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau 1KB, Hasil amplifikasi
yang efisien antara 100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil amplifikasi lebih dari 1 kB tetapi prosesnya
kurang efisien, karena produk yang panjang rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja ensim
DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini dapat menyebabkan hasil amplifikasi
yang tidak diinginkan.

Primers

Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini harus mampu mengenali
urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepasang primer akan mempunyai kisaran
pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap primernya. Kandungan GC harus antara 45-60%.
Annealing temperatur antara primer yang digunakan harus berkisar antara 1°C. Ujung 3’ dari setiap
primer harus G atau C, akan tetapi hindari susunan nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini,
misal CCG, GCG, GGC, GGG, CCC, GCC. Pada penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting
diperhatikan urutan primer tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu
sama lain, atau membentuk hairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada daerah DNA repetitif.

Taq DNA polymerase

Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas polimerisasi DNAnya dari
ujung-5’ ke ujung-3’ dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada 95ºC.
Biasanya untuk setiap 100μl volume reaksi ditambahkan 2.0-2.5 unit.

PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer
standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi
mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam
bentuk tanpa atau dengan MgCl2.

Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena
kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template,
dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting
untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti
EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak
menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan
produk PCR yang tidak diinginkan.

Nucleotides (dNTPs)

Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 μM. Pada konsentrasi ini penting
untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km untuk setiap dNTP. 50mM, harus
selalu diatur pH7.0. Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim
polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa
mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara
bebas.

PCR Thermal Cycler

PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan PerkinElmer sebagai pemegang paten
asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR thermal cycler ini dari berbagai
perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama masing-masing alat itu berbeda tetapi
prinsip kerjanya sama.