IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR INJEKSI SIANOKOBALAMIN (B12)

DENGAN SPEKTROFOTOMETER UV-VISIBLE

1
Alma Aulia Sahara
2
Edi Prayogo, 3Islah Salma Akbari, 4Nadya Uswatun Hasanah.
*
Kelompok 4 Praktikum Kimia Analisis Instrumen
Program Studi Kimia, FST UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta Jl. Ir. H. Juanda No. 95 Ciputat Jakarta 15412

ABSTRAK
Salah satu instrumen penunjang yang dapat digunakan dalam penentapan kadar dan
identifikasi senyawa dalam kegiatan penelitian yakni spektrofotometri UV-VIS. Prinsip kerja
spektro UV-VIS dalam menentukan kemurnian suatu sampel adalah dengan melihat nilai
koefisien ekstingsi dan harga serapan relatif dari senyawa tersebut. Tujuan utama dari
praktikum ini adalah mengidentifikasi dan penetapan koefisisen ekstingsi sianokobalamin
dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Rangkaian metode penelitian dimulai
dengan menyiapkan sampel sianokobalamin dengan konsentrasi 10 ppm. Kemudian sampel
yang didapat diukur serapannya dengan alat spektrofotometer UV-VIS yang kemudian dicari
nilai serapan relatif dan nilai ekstingsi. Dari penelitian yang telah dilakukan menunjukan
hasil serapan sebesar 0.03 ; 0.11 ; dan 0.06 untuk panjang gelombang 550, 361, dan 278 nm
secara berurutan dan nilai koefisien ekstingsi sampel pada panjang gelombang 550, 361, dan
278 nm didapatkan sebesar 3,3 x 10-3, 1,1 x 10-2, dan 1,6 x 10-3 dan serapan relatif pada
361/550 dan 361/278 didapat sebesar 3,67 dan 1,83.
Key word : spektrofotometer uv-vis, sianokobalamin, koefisien ekstingsi, serapan relatif

I. PENDAHULUAN
Vitamin B12 disebut juga sianokobalamin, merupakan sebuah vitamin larut air yang
berperan penting dalam berfungsi normalnya otak dan sistem saraf, serta dalam pembentukan
darah. Vitamin ini merupakan salah satu dari delapan vitamin B. Umumnya vitamin ini
terlibat dalam metabolisme setiap sel dalam tubuh, terutama pengaruhnya pada sintesis dan
regulasi DNA serta pada sintesis asam lemak dan produksi energi.
Kekurangan vitamin B12 dapat menyebabkan terganggunya proses metabolisme dalam
tubuh. Salah satu diantaranya, kekurangan vitamin B12 dapat menyebabkan kekurangan
darah (anemia) yang sebenarnya disebabkan oleh kekurngan folat. Tanpa vitamin B12, folat
tidak dapat berperan dalam pembentukan sel-sel darah merah.
Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai
sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak
 (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis
melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga
spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan
kualitatif.
Koefisien ekstingsi molar dan hukum Lambert-Beer digunakan untuk menentukan
konsentrasi senyawa (Dachriyanus, 2004). Koefisien ekstingsi dikenal juga dengan
Absorptivitas molar. Absorptivitas molar adalah absorpsi larutan yang diukur dengan
ketebalan 1 cm dan konsentrasi 1 mol/ L. Nilai Absortivitas molar dapat bervariasi. Seperti
sianokobalamin yang memiliki tiga puncak serapan dalam spektrum UV-Visible.
Dalam pengukuran kemurnian suatu senyawa pada spektrofotometri UV-Vis dapat
dilakukan dengan menetukan nilai serapan relatif. Serapan relatif adalah perbandingan
harga serapan pada dua ujung panjang gelombang tertentu, dimana pada penelitian kali ini
dilakukan pengujian kemurnian sianokobalamin yang terdapat puncak yaitu pada 361 nm/
550 nm dan 361 nm/ 278 nm

II.TINJAUAN PUSTAKA
Vitamin B12 disebut juga sianokobalamin, adalah sebuah vitamin larut air yang
berperan penting dalam berfungsi normalnya otak dan sistem saraf, serta dalam
pembentukan darah. Vitamin ini merupakan salah satu dari delapan vitamin B. Umumnya
vitamin ini terlibat dalam metabolisme setiap sel dalam tubuh, terutama pengaruhnya pada
sintesis dan regulasi DNA serta pada sintesis asam lemak dan produksi energi.
Spektrofotometer UV-Visible sering digunakan untuk keperluan penetapan kadar dan
identifikasi suatu senyawa. Panjang gelombang yang secara maksimum diabsorbansi dengan
mengukur absorbansi sampel pada rentang panjang gelombang yang telah ditentukan.
Setelah cahaya melewati larutan uji, energi cahaya yang melewati phototube dinyatakan
sebagai rasio transmitasi cahaya I (cahaya yang melewati sample) terhadap incident I 0
(intensitas cahaya dari sumber sebelum melewati sample) cahaya yang diterima phototube
adalah diukur sebagai persen transmitasi (%T) atau sebagai log kebalikannya, absorbansi
(A).
Jika I lebih kecil dari I0, artinya sample menyerap sejumlah sinar. Dalam hal ini terdapat
hubungan yang sederhana antara absorbansi (A) dengan intensitas cahaya yang melewati
sample dan intensitas cahaya sebelum melewati sample, yakni :
I₀
A = log10
I

Bagian sinar yang diserap akan tergantung pada berapa banyak molekul yang berinteraksi
dengan sinar. Dengan kata lain nilai absorbansi sangat bergantung pada konsentrasi suatu
senyawa. Hubungan antara banyaknya cahaya yang diserap dengan konsentrasi suatu
senyawa dinyatakan secara kuantitatif melalui persamaan Hukum Lambert-Beer:
Log I0/I = ε.L.C........................................*)
 Keterangan:
I0 = Intensitas cahaya sebelum melewati sample
I = Intensitas cahaya setelah melewati sample
ε = Koefisien ekstingsi, yaitu konstanta yang tergantung pada sifat alami dari senyawa
substansi dan panjang gelombang yang digunakan untuk analisis
L = Panjang atau jarak cahaya yang melewati sample
C = Konsentrasi dari larutan yang dianalisa
Koefisien ekstingsi sering pula dinyatakan dalam koefisien absortivitas molar. Nilai
absorptivitas molar dapat bervariasi. Contohnya, sianokobalamin memiliki dua puncak
serapan dalam spektrum UV-tampak. Dua puncak serapan ini disebabkan oleh promosi
elektron dari pasangan elektron bebas gugus karbonil dan delokalisasi elektron ikatan rangkap
terkonjugasi dari orbital pi anti-ikatan.
Dalam pengukuran kemurnian suatu senyawa dapat dilakukan dengan menentukan harga
serapan realtifnya. Serapan relatif adalah perbandingan harga serapan pada 2 ujung panjang
gelombang tertentu dimana zat tertentu besarnya tertentu pula, sehingga dapat digunakan
untuk mengidentifikasi kemurnian zat tersebut.

III. METODE PENELITIAN

III.1 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah Spektrofotometer UV-VIS,
labu ukur, pipet volumetric, beaker glass, pipet tetes, tissue, Injeksi 500 µg/ml dan ampul 1 ml
sianokobalamin (Vitamin B12)
III.2 Prosedur Kerja
Pada penelitian kali ini dilakukan pengukuran nilai serapan rel atif dan penentuan harga
koefisien ekstingsi terhadap sampel larutan sianokobalamin 10 ppm. Tahap-tahap yang
dilakukan dalam penelitian ini diantaranya adalah sebagai berikut:
a. Penentuan Nilai Serapan Relatif
Percobaan diawali dengan menyiapkan larutan sianokobalamin dengan konsentrasi 10
ppm. Selanjutnya dinyalakan alat spektrofotometer UV-Vis, dipilih menu aplikasi
waveprogram. Kemudian dilakukan pengukuran serapan dengan kuvet setebal 1 cm pada
panjang gelobang 550 nm, 361 nm, dan 278 nm. Dihitung perbandingan serapan pada 361
nm / 550 nm dan 361 m / 278 nm
b. Penentuan Harga Koefisien Ekstingsi
Dihitung konsentrasi sianokbalamin hasil pengenceran, ditentukan nilai koefisien
ekstingsi sianokobalamin dengan menggunakan persamaan Lambert-Beer.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Panjang Gelombang (nm) 278.20 361.08 549.99

Absorbansi 0.06 0.11 0.03

Pada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami tentang identifikikasi vitamin B12
dengan menggunakan metode spektrofotometer UV-VIS dan untuk menentukan koefisien
absorptivitas vitamin B12.
Vitamin B12 yang biasanya diisolasi disebut sianokobalamin, sebab pada molekul ini
mengandung gugus siano yang berikatan dengan kobalt (Lehninger, 1995). Membantu dalam
pemindahan atom hidrogen dari satu atom karbon ke atom berikutnya sebagai pengganti
alkil, karboksil, hidroksil, atau gugus amino. Sehingga bentuk ini merupakan bentuk yang
sangat stabil.
Pertama yang dilakukan yaitu mengeluarkan isi dari ampul injeksi sianokobalamin ke
dalam beaker glass 50 ml, kemudian dipipet 1 ml injeksi sianokobalamin tersebut ke dalam
labu ukur 100 dan ditambahkan aquades hingga volume mencapai 100 ml. Vitamin B12 ini
merupakan yang dapat larut dengan air seperti halnya dengan vitamin C, sehingga sampel
tersebut dilarutkan dengan aquades. Hal ini dikarenakan vitamin B12 merupakan senyawa
polar. Senyawa non polar atau yang tidak larut oleh air akan mengendap. Kemudian sampel
dihomogenkan dengan cara divortex. Tujuan dari vortex ini yaitu agar larutan menjadi
homogen dan bercampur dengan baik.
Langkah selanjutnya yaitu dilakukan penyaringan sampel. Tujuan dari penyaringan
sampel ini adalah agar endapan pada larutan bisa terpisah dari larutannya. Hasil penyaringan
sampel berwarna merah muda, hal ini disebabkan sianokobalamin (vitamin B12) pada sampel
dalam bentuk kobalt (III). Warna merah muda ini disebabkan oleh semua senyawa kompleks
kobalt (III). Senyawa kompleks dapat berwarna karena senyawa tersebut menyerap energi
pada daerah sinar tampak. Penyerapan energi tersebut digunakan untuk melakukan promosi
atau transisi elektronik pada atom pusat.
Bagian molekul yang mengadsorpsi dalam daerah UV dan daerah sinar tampak dinyatakan
sebagai kromofor. Gugus kromofor adalah gugus yang menyebabkan molekul menjadi
berwarna. Hal inilah yang menyebabkan filtrat vitamin B12 dapat diukur oleh
spektrofotometer UV-VIS karena vitamin B12 mengandung gugus kromofor. Gugus kromofor
yang terkandung dalam vitamin B12 adalah ikatan rangkap dan cincin benzene. Berikut ini
adalah struktur dari sianokobalamin :

Gambar 1. Struktur sianokobalamin (sumber : Kornobis et al., 2011)

Kemudian dilakukan pengukuran sampel dengan spektrofotometer UV-VIS pada panjang
gelombang 550, 361, dan 278 nm. Didapat serapan sebesar 0.03 ; 0.11 ; dan 0.06 untuk
panjang gelombang 550, 361, dan 278 nm secara berurutan. Dari hasil percobaan dapat dilihat
bahwa pada panjang gelombang 361 nm didapat serapan sebesar 0.11. serapan yang besar ini
disebabkan karena sampel yang digunakan memiliki konsentrasi 10 ppm sehingga semakin
banyak molekul yang berinteraksi dengan sinar. Setelah didapatkan nilai serapan maka dapat
dicari nilai koefisien ekstingsinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Sehingga
didapatkan koefisien ekstingsi sampel pada panjang gelombang 550, 361, dan 278 nm sebesar
3,3 x 10-3, 1,1 x 10-2, dan 1,6 x 10-3. nilai koefisien ekstingsi akan dipengaruhi oleh jarak
cahaya yang melewati sampel (tebal kuvet) dan konsentrasi sampel yang digunakan. Dimana
semakin besar jarak cahaya dan konsentrasi maka nilai koefisien ekstingsinya akan semakin
kecil.

V. KESIMPULAN DAN SARAN

1. Vitamin B12 adalah salah satu jenis vitamin yang larut dalam air dan merupakan
bagian dari vitamin B Complex yang mengandung kobalt, sehingga disebut
sebagai sianokobalamin.
2. Nilai serapan sianokobalamin pada panjang gelombang 550, 361, dan 278
sebesar 0.03 ; 0.11 dan 0.06.
 3. Nilai koefisien ekstingsi pada panjang gelombang 550, 361, dan 278 sebesar 3,3
x 10-3, 1,1 x 10-2, dan 1,66 x 10-3 dan Serapan relatif pada 361/550 dan 361/278
didapat sebesar 3,26 dan 1,91.

VI. DAFTAR PUSTAKA

Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi.
Lembaga Pengembangan Teknologi Informasi dan Komunikasi (LPTIK)
Universitas Andalas
Hermanto, Sandra dan Fitriani Eka. 2017. Petunjuk Praktikum Kimia Instrument.
Kimia UIN Jakarta
Kornobis, Karina & Kumar, Neeraj & Wong, Bryan & Lodowski, Piotr & Jaworska,
Maria & Andruniów, Tadeusz & Ruud, Kenneth & M Kozlowski, Pawel.
2011. Electronically Excited States of Vitamin B12: Benchmark Calculations
Including Time-Dependent Density Functional Theory and Correlated Ab
Initio Methods. The journal of physical chemistry. A. 115. 1280-92.
10.1021/jp110914y.
Lehninger, A. 1995. Dasar-dasar Biokimia. Alih Bahasa. Meggy Thenawijaya.
Erlangga. Jakarta
http://www.chem-
istry.org//materi_kimia/instrumen_analisis/spektrum_serapan_ultraviolet-
tampak_uvvis_/hukum_beer_lambert/ diakses 26 Maret 2020
 LAMPIRAN
Perhitungan koefisien ekstingsi

 Panjang gelombang 550

A =εLC
0.03 = ε . 1 cm . 10 ppm
= 3,3 x 10-3

 Panjang gelombang 361

A =εLC
0.11 = ε . 1 cm . 10 ppm
= 1,1 x 10-2
 Panjang gelombang 278

A =εLC
0.06 =ε.L.C
= 1,6 x 10-2

Perhitungan Perbandingan serapan

a) 361 nm / 550 nm : 0,11/0,03 = 3,67
b) 361 nm / 278 nm : 0,11/0,06 = 1,83

Pertanyaan
1. Jelaskan apa yang dimaksud koefisien ekstingsi dan nilai serapan relatif
 Koefisien ekstingsi yaitu konstanta yang tergantung pada sifat alami dari senyawa
subtansi dan panjang gelombang yang digunakan
 Nilai serapan relatif adalah perbandingan harga serapan pada 2 ujung panjang
gelombang tertentu dimana untuk zat besarnya tertentu pula, sehingga dapat digunakan
untuk mengidentifikasi kemurnian zat tertentu.

2. Jelaskan fakto-faktor apa saja yang mempengaruhi nilai koefisien ekstingsi dan nilai
serapan relatif
Absorptivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi,
tebal kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Absorptivitas
tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi
(Yanlinastuti, 2009)

3. Hitunglah nilai koefisien ekstingsi vitamin B12 pada masing-masing panjang gelombang
dan hitung juga nilai serapan relatifnya.
Perhitungan koefisien ekstingsi

 Panjang gelombang 549,99

A =εLC
0.03 = ε . 1 cm . 10 ppm
= 3,3 x 10-3

 Panjang gelombang 361,08

A =εLC
0.11 = ε . 1 cm . 10 ppm
= 1,1 x 10-2
 Panjang gelombang 278,20

A =εLC
0.06 = ε . 1 cm . 10 ppm
= 1,6 x 10-3
 Perhitungan Perbandingan serapan

c) 361 nm / 550 nm : 0,11/0,03 = 3,67

d) 361 nm / 278 nm : 0,11/0,06 = 1,83

4. Bagaimana nilai serapan relatif tersebut jika dibandingkan dengan standar farmakope?
Apakah kaitan antara nilai serapan relatif dengan kemurnian senyawa?

Serapan relatif sianokobalamin berdasarkan referensi Farmakope Indonesia Ed.IV hal

723-724 adalah 3,15-3,45 untuk panjang gelombang 361/550 dan 1,75-1,98 untuk
panjang gelombang 361/278. Sedangkan serapan relatif adalah perbandingan harga
serapan pada dua ujung panjang gelombang tertentu dimana nilai suatu zat tertentu
sesuai dengan besarnya, sehingga dapat digunakan untuk mengindentifikasi kemurnian
zat tersebut. Nilai serapan relatifitas dari percobaan adalah perbandingan panjang
gelombang 361 nm / 550 nm yaitu 3,67 dan perbandingan panjang gelombang 361 nm /
278 nm yaitu 1,83. Nilai serapan relatifitas yang didapat bila dibandingkan dengan
referensi farmakope Indonesia maka diketahui bahwa nilai tersebut masih terdapat
didalam range yang ditentukan sehinggu dapat disimpulkan bahwa sampel
sianokobalamin 10 ppm yang diujikan masih dalam keadaan tidak murni, diduga karena
adanya zat pengotor didalamnya.