3.

Analisa Kuantitatif dari Cabe Jawa (Piperis retrofracti fructus),

 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Densitometri

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh
suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase,
salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dengan arah tertentu
dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya
perbedaan dalam absorbsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau
kerapatan muatan ion. Dengan demikian masing-masing zat dapat diidentifikasi
atau ditetapkan dengan metode analitik (Farmakope Herbal, 2009).
Teknik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi
diantara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase
gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat
terlarut lainnya, yang tereluasi lebih awal atau lebih akhir. Umumnya zat terlarut
dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau
gas yang disebut eluen (Farmakope Herbal, 2009).
Pada hakikatnya kromatografi lapis tipis (KLT) melibatkan sifat fase diam
dan sifat fase gerak. Fase diam dapat berupa serbuk halus dan dapat bertindak
sebagai sel penjerap, seperti halnya alumina yang diaktifkan, silika gel, dan resin
penukar ion, atau bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara
fase diam dan fase gerak. Dalam proses terakhir ini suatu lapisan cairan pada
suatu penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam (Farmakope Herbal,
2009).
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu metode yang paling
banyak digunakan dan paling mudah untuk memurnikan sejumlah kecil
komponen. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau aluminium yang telah
dilapisi dengan penyerap (misalnya silika gel) dengan ketebalan tertentu
tergantung pada jumlah bahan yang akan dimuat ke dalam lempeng analisis
biasanya memiliki ketebalan 0,2 mm; lempeng preparatif dapat memiliki
ketebalan hingga 1-2 cm (Heinrich et al., 2004).
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu tipe kromatografi
partisi dengan menggunakan sebuah lapis silika atau alumina yang seragam pada
sebuah lempeng gelas atau logam. Silika gel merupakan fase diam untuk
kromatografi lapis tipis (KLT) seringkali juga mengandung substansi yang mana
dapat berpendar dalam sinar ultraviolet. Pada kromatografi lapis tipis (KLT), zat
penjerap merupakan lapisan tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng
kaca, plastik, atau logam secara merata, umumnya digunakan lempeng kaca.
Lempeng yang dilapisi dapat dianggap sebagai kolom kromatogarafi terbuka dan
pemisahan yang tercapai dapat didasarkan pada absorpsi, partisi, atau kombinasi
kedua efek, yang tergantung dari jenis lempeng, cara pembuatan, dan jenis pelarut
yang digunakan (Farmakope Herbal, 2009).
Lempeng lapis-penjerap sering menggunakan indikator flouresensi (F254),
sehingga bahan alam yang mengabsorpsi sinar UV pendek (254nm) akan tampak
sebagai bercak hitam pada latar hijau,pada sinar UV gelombang panjang, senyawa
tertentu dapat menampakkan flouresensi biru atau kuning terang. Baik sifat
absorbansi UV maupun flouresensi dapat digunakan untuk memantau pemisahan
senyawa pada lempeng kromatografi lapis tipis (KLT) (Heinrich et al., 2004).
Kromatografi lapis tipis (KLT) dengan penjerap penukar ion dapat
digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada
kromatografi lapis tipis (KLT), tidak tetap jika dibandingkan dengan yang
diperoleh pada kromatografi kertas. Karena itu lempeng yang sama disamping
kromatogram dari zat yang diperiksa perlu dibuat kromatogram dari zat
pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda. Perkiraan
identifikasi diperoleh dengan pengamatan 2 bercak dengan harga Rf dan ukuran
yang lebih kurang sama. Ukuran dan intensitas bercak dapat digunakan untuk
memperkirakan kadar. Penetapan kadar yang lebih teliti dapat dilakukan dengan
cara densitometri atau dengan mengambil bercak dengan hati-hati dari lempeng,
kemudian disari dengan pelarut yang cocok dan ditetapkan dengan cara
spektrofotometri (Prawirosujanto, 1977).
Kromatografi lapis tipis (KLT) densitometri yaitu alat untuk pengukur
kuantitatif secara langsung pada lempeng kromatografi lapis tipis (KLT).
Keuntungan penggunaan kromatografi lapis tipis (KLT) adalah mampu
memisahkan beberapa sampel secara bersamaan. Densitometri metode analisis
instrumental yang didasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit
yang merupakan bercak kromatografi lapis tipis (KLT). Pada kondisi dimana
fluoresensi diukur, diperlukan filter yang sesuai untuk mencegah cahaya yang
digunakan untuk eksitasi mencapai foto sel dengan membiarkan emisi yang
spesifik dapat lewat (Farmakope Herbal, 2009).
Penetapan kadar Marker yang memenuhi kriteria spesivitas setidaknya
digunakan densitometer. Densitometer adalah instrumen kuantitatif standar untuk
 penetapan kadar Marker. Dengan sistem ini senyawa target akan berupa bercak
tunggal yang terpisah dari senyawa-senyawa lain dari dalam ekstrak sehingga
aspek spesivitas terpenuhi (Saifudin, 2011).

 Pengukuran Kadar Piperin

Pengukuran penetapan kadar piperin ekstrak etanol 95% buah cabe jawa
(Piperis retrofracti fructus) dengan cara kromatografi lapis tipis (KLT)
Densitometri (TLC-Scanner)
a. Pembuatan Larutan Standar Piperin (Lartan Induk 2000 ppm)
Larutan induk : Ditimbang 20 mg standar piperin, larutkan dalam etanol p.a
secukupnya sampai tanda batas 10 mL.
Deret Standar Piperin
- Larutan Standar Piperin 200 ppm
Diambil dari larutan induk standar piperin (2000 ppm) sebanyak 0,5
mL dengan mengunakan mikropipet kemudian ditambahkan etanol p.a
sampai tanda batas 5 mL.
- Larutan Standar Piperin 400 ppm
Diambil dari larutan induk standar piperin (2000 ppm) sebanyak 1
mL dengan mengunakan mikropipet kemudian ditambahkan etanol p.a
sampai tanda batas 5 mL.
- Larutan Standar Piperin 600 ppm
Diambil dari larutan induk standar piperin (2000 ppm) sebanyak 1,5
mL dengan mengunakan mikropipet kemudian ditambahkan etanol p.a
sampai tanda batas 5 mL.
- Larutan Standar Piperin 800 ppm
Diambil dari larutan induk standar piperin (2000 ppm) sebanyak 2
mL dengan mengunakan mikropipet kemudian ditambahkan etanol p.a
sampai tanda batas 5 mL.
- Larutan Standar Piperin 1000 ppm
Diambil dari larutan induk standar piperin (2000 ppm) sebanyak 2,5
mL dengan mengunakan mikropipet kemudian ditambahkan etanol p.a
sampai tanda batas 5 mL.
b. Larutan Uji
Timbang saksama lebih kurang 50 mg ekstrak etanol 95% buah cabe
jawa (Piperis retrofracti fructus), larutkan dalam 25 mL etanol p.a didalam
 tabung reaksi. Saring kedalam labu terukur 50 mL, bilas kertas saring dengan
etanol p.a secukupnya sampai tanda sehingga didapat konsentrasi 1000 ppm
kemudian diencerkan menjadi 800 ppm.
c. Pengukuran (Farmakope Herbal, 2009)
Totolkan masing-masing 1 μL larutan deret standar dan larutan uji
pada lempeng kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel 60 F 254, kembangkan
dengan fase gerak diklorometan P, ukur dengan kromatografi lapis tipis
(KLT) Densitometri (TLC-Scanner), pada panjang gelombang 254 nm.
d. Analisis Hasil TLC-Scanner (Murrukmihadi, 2013)
Data luas area yang didapatkan dari baku standar piperin kemudian
dibuat persamaan kurva baku. Persamaan kurva baku yaitu y= a+bx dengan
y=AUC (Area Under Curve), x=kadar piperin (ng). AUC yang didapat dari
hasil scan pada alat TLC-Scanner kemudian dimasukan kedalam persamaan
garis kurva baku, maka didapat masing-masing % kadarpipierin dalam ekstrak
etanol 95% buah cabe jawa (Piperis retrofracti fructus) hasil ekstraksi maerasi
dan sokletasi.

 Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Densitometri

Kadar piperin ekstrak etanol 95% buah cabe jawa (Piperis retrofracti
fructus) diukur menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) Densitometri
dengan alat TLC-Scanner. Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan
senyawa kimia secara kimia fisika bedasarkan perbedaan kecepatan migrasi atau
rasio distribusi dari komponen campuran fase diam dan fase gerak
(Kusumaningtyas et al., 2008). Pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak
etanol 95% buah cabe jawa (Piperis retrofracti fructus) ialah etanol p.a. Pada
penentuan kadar senyawa Marker ekstrak etanol 95% buah cabe jawa (Piperis
retrofracti fructus) peneliti menggunakan senyawa identitas yang merupakan
senyawa khas yang terdapat dalam buah cabe jawa (Piperis retrofracti fructus)
yaitu senyawa piperin.
Pada proses kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fase diam yaitu
silika gel 60 GF 254 berukuran 8×10 cm dan fase geraknya menggunakan pelarut
diklorometan. Diklorometan merupakan pelarut yang bersifat non polar karena
alkaloid bersifat semipolar sehingga dapat memisahkan alkaloid dengan senyawa
lain didalam ekstrak. Penotolan pada plat kromatografi lapis tipis (KLT) yaitu 1
μL menggunakan mikropipet. Setelah dilakukan penotolan kemudian dielusi
dengan menggunakan fase gerak diklorometan, yang sebelumnya telah dilakukan
proses penjenuhan pada chamber. Proses penjenuhan chamber bertujuan
mempercepat proses elusi.
Proses elusi pada plat kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan selama
kurang lebih 15 menit sampai tanda batas rambat yang telah ditandai. Plat yang
telah dielusi atau dikembangkan kemudian dikeringkan dengan cara didiamkan.
Setelah selesai kemudian plat kromatografi lapis tipis (KLT) dianalisis dengan
menggunakan alat TLC-Scanner. Alat TLC-Scanner digunakan untuk menentukan
kadar piperin ekstrak buah cabe jawa (Piperis retrofracti fructus) dengan metode
kromatografi lapis tipis (KLT) Densitometri dan juga dapat dilakukan analisa
kualitatif piperin bedasarkan nilai Rf. Pada analisa kuantitatif, bercak fase diam
dapat langsung diukur menggunakan teknik Densitometri. Densitometri dapat
bekerja secara serapan atau fluoresensi (Gandjar et al., 2008). Pengamatan kadar
senyawa piperin dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) Densitometri pada
panjang gelombang 254 nm (Farmakope Herbal, 2009). Hasil kromatografi lapis
tipis (KLT) Densitometri dapat dilihat pada Tabel 4.9.

Tabel 4.9. Hasil KLT Densitometri

Konsentrasi Bobot Piperin

Track Track Type Rf Area
(ppm) (ng)
1 Standar Piperin 200 200 0,03 3323,27
2 Standar Piperin 400 400 0,04 5420,19
3 Standar Piperin 600 600 0,03 7451,89
4 Standar Piperin 800 800 0,04 8641,72
5 Standar Piperin 1000 1000 0,03 9840,99
Ekstrak Hasil X ekstrak hasil
6 800 0,04 2632,60
Maserasi maserasi
Ekstrak Hasil X ekstrak hasil
7 800 0,03 3082,79
Sokletasi sokletasi

Setelah proses scan selesai maka didapat hasil luas area dan peak
kromatogram sampel dan selanjutnya dibuat kurva kalibrasi dengan menggunakan
persamaan regresi linear. Kurva kalibrasi piperin, dibuat dengan rentang deret
standar seperti terlihat pada Tabel 4.10.
 Tabel 4.10. Luas Area Piperin

Bobot Piperin (ng) Luas Area (AUC)

200 3323,27
400 5420,19
600 7451,89
800 8641,72
1000 9840,99

KURVA KALIBRASI PIPERIN

12000
LUAS AREA (AUC)

10000

8000

6000

4000

2000 y = 2058,521+8,128485x r = 0,990026

0
0 200 400 600 800 1000 1200
BOBOT PIPERIN (ng)

Gambar 4.1. Kurva Kalibrasi Piperin

Koefisien korelasi : 0,990026

Persamaan garis : y = 2058,521+8,128485x

x= (y-2058,521)/ 8,128485

Hasil persamaan regresi linear yang didapat kemudian dibuat kurva

kalibrasi standar sehingga didapat hubungan antara berat senyawa standar dengan
luas area. Setelah didapat hasil dari kurva kalibrasi, luas area sampel dimasukkan
kedalam persamaan regresi linear, lalu akan mendapatkan berat senyawa sampel
kemudian dilakukan perhitungan kadar senyawa piperin dalam ekstrak etanol 95%
buah cabe jawa (Piperis retrofracti fructus). Linearitas merupakan salah satu
parameter untuk menilai kesahihan metode analisis dengan melihat nilai
 hubungan respon dari berbagai konsentrasi zat baku pada suatu kurva baku yang
dilihat sebagai nilai koefisien korelasi (Murrukmihadi, 2013).
Pembuatan kurva kalibrasi standar piperin yang terdiri dari lima deret
standar yang berbeda, yaitu larutan standar 200; 400; 600; 800; 1000 ng diperoleh
persamaan garis y = 2058,521+8,128485x dengan koefisien korelasi 0,990026.
Hasil persamaan garis yang didapat kemudian dihitung kadar piperin ekstrak
etanol 95% buah cabe jawa (Piperis retrofracti fructus). Kenaikan konsentrasi
atau kadar standar piperin sebanding dengan kenaikan nilai AUC (Area Under
Curve) pada pada kromatografi lapis tipis (KLT) Densitometri. Hal ini sesuai
dengan apa yang didapat. Semakin tinggi kadar piperin dalam larutan standar
maka semakin besar nilai AUC (Area Under Curve) (Murrukmihadi, 2013).

Ekstrak etanol 95% buah cabe jawa (Piperis retrofracti fructus) hasil ekstraksi
maserasi dan sokletasi dapat dilihat hasil kadar piperin yaitu pada Tabel 4.11.
Tabel 4.11. Hasil Kadar Piperin dalam Ekstrak

Ekstrak Buah Cabe Jawa Bobot Piperin Dalam Kadar Piperin

(Piperis retrofracti fructus) Sampel (ng) (% b/b)
Ekstrak Hasil Maserasi 70,6255 8,8281
Ekstrak Hasil Sokletasi 126,0098 15,7512

Hasil yang didapat pada penentuan kadar piperin dengan menggunakan

metode kromatografi lapis tipis (KLT) Densitometri (TLC-Scanner) terlihat
bahwa metode ekstraksi yang mampu menghasilkan kadar piperin tertinggi yaitu
pada metode ekstraksi sokletasi yaitu sebesar 126,0098 ng (15,7512%). Pada
metode ekstraksi sokletasi menghasilkan kadar piperin yang tertinggi karena
senyawa piperin bersifat termostabil untuk dilakukan ekstraksi cara panas, dalam
hal ini yaitu metode ekstraksi sokletasi dan metode ini dapat menyari senyawa
piperin dalam buah cabe jawa (Piperis retrofracti fructus) yang lebih efektif.
 Metode ekstraksi sokletasi merupakan ekstraksi menggunakan pelarut
yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi
ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya