Disusun Oleh :

Ardina Purnama Tirta, M.Si

 Kromatografi kolom klasik yaitu kolom dengan
karakteristik penambahan fase gerak pada
tekanan atmosfer dan fase diam dikemas pada
kolom gelas
 Kolom klasik biasanya terbuat dari gelas
Teknik elusi dengan gaya gravitasi
 partikel fase diam umumnya > 150 μm
Packing kolom dilakukan dengan homogen untuk
meminimalkan difusi Eddy
 Packing Column
Pemilihan metode pengemasan terutama tergantung pada
kepadatan fasa diam

Packing kolom dapat dilakukan dengan cara :

 Cara basah
(mencampurkan dulu fase diam dengan solvent biasanya pada
perbandingan 1:3)

 Cara kering
(memasukkan fase diam kering ke dalam kolom baru
dilarutkan solvent, tidak dapat dilakukan bila fase diam gel)

Dalam semua cara perlu untuk menghindari masuknya

gelembung udara
 Aplikasi Sampel

• Sampel diaplikasikan pada

bagian atas kolom
• Aplikasi tidak boleh merusak
packing fase diam
• Bagian atas fase diam biasanya
dilindungi dengan lapisan tipis
pasir / kertas saring/ pasir
Cara elusi
Fase gerak
Fase gerak
sampel C Kontinu sampai semua
B sampel keluar
A
adsorben

Pemisahan bagus

A B C
 Teknik ELusi
Kromatografi Kolom

Teknik Prosedur

Elusi Isocratic Penambahan pelarut dengan komposisi tetap

selama keseluruhan proses

Elusi Gradient Continuous or linear elution: dimana terjadi

perubahan secara berkelnjutan pada komposisi
fase gerak selam proses pemisahan
(misalkepolaran, pH atau kekuatan ion).
Step wise or fractional elution: dimana terjadi
perubahan tapi tidak berkelanjutan, misalnya
perubahan tiba-tiba pada komposisi fase gerak
yang kemudian kembali pada komposisi semula
 Deteksi
Kromatografi Kolom

Deteksi pada kromatografi kolom untuk

senyawa berwarna atau berflouresence dapat
dilihat secara langsung setelah muncul
kromatogram

Pemantauan fraksi terelusi (PC atau TLC).

Menggunakan detektor khusus terhubung ke

kolom seperti indeks bias, detektor UV, dll ...
 Faktor yang mempengaruhi pemisahan zat terlarut dalam CC
(Faktor-faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom

Factor Effect
Ukuran Partikel dari Fasa Ukuran partikel semakin kecil meningkatkan
Diam (support) pemisahan, namun membutuhkan tekanan tinggi.
Efficiency meningkat dengan meningkatnya rasio
Dimensi Kolom
panjang/lebar
Packing kolom yang tidak seragam menyebabkan
pergerakan zat terlarut melalui kolom tidak seragam
Keseragaman Packing Kolom
dan pembentukan zona menjadi tidak seragam
(terjadinya pelebaran pita atau tailing).
Meningkatkan suhu kolom menyebabkan elusi yang
Suhu Kolom lebih cepat tapi tidak meningkatkan pemisahan
(tailing).
Pelarut harus memiliki viskositas yang rendah
(untuk mendapatkan resolusi yang baik) dan &
Pelarut fase gerak
volatilitas yang tinggi (untuk mendapatkan recovery
yang cepat dari zat).
 Faktor yang mempengaruhi pemisahan zat terlarut dalam CC
(Faktor-faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom

Factor
Laju alir pelarut
Kontinuitas laju alir
Kondisi adsorben
Konsentrasi zat terlarut
Effect
Laju alir yang seragam dan rendah memberikan
resolusi yang lebih baik
Laju alir yang tidak kontinue mengganggu resolusi
Adsorben yang tidak aktif menurunkan pemisahan
Sampel dengan konsentrasi tinggi bergerak lenih
lambat
 Pelebaran Pita

Faktor-faktor yang mempengaruhi terjadinya

pelebaran pita disebabkan oleh :
 Difusi eddy
 Difusi Longitudinal
 Transfer Massa
 Difusi Eddy
Difusi Eddy disebut juga efek jalur , yaitu akibat dari panjang jalur gerakan
molekul-molekul komponen tidak sama sepanjang kolom.

Molekul-molekul yang masuk bersama-sama pada ujung kolom, keluar pada

waktu yang tidak bersamaan pada ujung yang lain.

Variasi panjang jalur ini akibat dari ketidak seragaman kemasan kolom yang ada
hubungannya dengan partikel pengisi kolom, geometri, dan ketebalan fasa diam.

Pelebaran puncak yang diakibatkan oleh difusi eddy ini dapat dikurangi dengan
jalan menggunakan partikel pengisi kolom yang ukurannya kecil, dengan mesh-
range partikel yang semakin kecil.

Selain itu, diperlukan pula menggunakan kolom yang diameternya lebih kecil,
tetapi perlu dipikirkan kolom yang diameternya lebih kecil dari 3 mm akan sukar
mengisinya. Pengemasan harus dilakukan secermat mungkin.
Difusi Eddy
Difusi Longitudinal

Biasanya terjadi jika kecepatan alir fase gerak lambat.

Pada keadaan tersebut, aliran fase gerak dengan analit yang

dekat dengan fase diam akan lambat karena adanya gaya
Vander walls ,sedangkan yang berada di tengah lebih cepat
alirannya namun konsentrasinya lebih kecil daripada yang
samping.
Karenanya analit yang semula tertahan oleh gaya Vanderwalls
di samping akan berdifusi ke tengah sesuai dengan hukum
Ficks.
Cara meminimalkannya: mempercepat laju alir dan
menurunkan temperatur
Difusi Longitudinal
 Transfer Massa

laju alir yang terlalu cepat menyebabkan proses transfer

massa dan pemisahan pada kolom belum tercapai
sempurna.

Cara meminimalkannya:
 Menggunakan support fasa diam dengan ukuran partikel
kecil, sehingga luas permukaan besar yang menyebabkan
kesetimbangan cepat tercapai
 Menaikkan temperatur
 Laju alir diperlambat
Transfer Massa
Jumlah Pelat Teoretis
(N)

H = Tinggi plat teoritis

L = Panjang Kolom

N=L/H

HETP (H) menurun, efisiensi

pemisahan meningkat
Jumlah Pelat Teoretis
(N)
Istilah H merupakan tinggi ekivalen lempeng teoretis atau HETP (high
equivalent theoretical plate), yang mana merupakan panjang kolom yang
dibutuhkan untuk menghasilkan satu lempeng teoretis.

Kolom yang baik akan mempunyai bilangan lempeng yang tinggi; dan
karenanya kolom yang baik mempunyai nilai H yang rendah.

Ukuran partikel merupakan penyumbang utama pada nilai H. Semakin

kecil ukuran partikel, maka semakin tinggi bilangan lempeng teoretis.

Kondisi optimum diperoleh dengan melihat hubungan antara tinggi

lempeng teoretis dan kecepatan alir (kurva Van Deemter)
 Kurva Van Deemter

Istilah H merupakan tinggi ekivalen lempeng teoretis atau HETP (high

equivalent theoretical plate), yang mana merupakan panjang kolom yang
dibutuhkan untuk menghasilkan satu lempeng teoretis.

Kolom yang baik akan mempunyai bilangan lempeng yang tinggi; dan
karenanya kolom yang baik mempunyai nilai H yang rendah.

Ukuran partikel merupakan penyumbang utama pada nilai H. Semakin

kecil ukuran partikel, maka semakin tinggi bilangan lempeng teoretis.

Kondisi optimum diperoleh dengan melihat hubungan antara tinggi

lempeng teoretis dan kecepatan alir (kurva Van Deemter)
Kurva Van Deemter
 Kromatografi Kolom
Adsorpsi

• Sifat-sifat atom, ion atau molekul yang terletak pada

permukaan partikel padat memiliki perbedaan sifat dengan
atom, ion atau molekul yang terletak pada bagian sebelah
dalam dari partikel padat.

• Ikatan-ikatan yang terletak pada bagian permukaan

dipengaruhi oleh tidak terdapatnya struktur kimia di atomnya,
karena itu lapisan permukaan berada pada tingkat energi yang
lebih tinggi dan hal ini dikatakan mempunyai aktivitas
permukaan.
 Kromatografi Kolom
Adsorpsi
Bila partikel padat dicelupkan dalam suatu cairan, maka
permukaan zat aktif tersebut menarik dan cenderung
mengadsorpsi species (atom, ion atau molekul) dari cairan
tadi.
• Gaya tarik tersebut mungkin bersifat ionik (elektrostatik).
• Bila cairan tersebut berupa suatu larutan, maka salah satu
atau semua zat terlarut atau pelarutnya mungkin dapat
diadsorpsi.
• Adsorben yang baik harus mempunyai daerah permukaan
yang luas yang mengandung banyak bidang-bidang yang aktif
secara kimiawi.
• Biasanya permukaan tersebut akan kehilangan aktivitasnya
jika tertutup oleh suatu lapisan species yang diadsorpsi.
 Kromatografi Kolom
Adsorpsi Adsorben

• Yang paling umum adalah Alumina & Silica gel di mana

interaksi dengan molekul zat terlarut adalah karena kelompok
gugus OH pada permukaannya.
• molekul yang lebih polar akan teradsorpsi lebih kuat & dengan
demikian, sehingga terelusi lebih lambat
• Kekuatan adsorpsi kelompok polar (zat terlarut) pada support
polar diurutkan sebagai berikut:
-C=C- < O-CH3 < -COOR < >C = O < -CHO < -NH2 < -OH < -
COOH
Kromatografi Kolom
Adsorpsi Adsorben
Zat padat Digunakan untuk memisahkan
Alumina/magnesia Sterol-sterol, zat warna, vitamin-vitamin, ester-ester,
alkaloid-alkaloid, senyawa anorganik
Silika gel Sterol-sterol, asam-asam amino
Karbon Peptida-peptida,karbohidrat-karbohidrat, asam-asam
amino
Magnesium silikat Sterol-sterol, ester-ester, gliserida-gliserida, alkaloida-
alkaloida
Magnesium karbonat Porphirin
Kalsium hidroksida Karotenoida-karotenoida
Kalsium karbonat Karotenoida-karotenoida, Xantofil
Kalsium fosfat Enzim-enzim, protein-protein, polinukleotida-
polinukleotida
Aluminium silikat Sterol-sterol
Pati Enzim-enzim
Gula Klorofil, xantofil
 Kromatografi Kolom
Partisi
Pada tipe ini, kemasan terdiri dari bahan pendukung padat
yang inert dilapisi dengan lapisan dari fase diam cair.
Senyawa yang dipisahkan dengan sendirinya akan terdistribusi
diantara dua zat cair tergantung dari koefisien pembagiannya.

Syarat Zat penunjang :

 harus mengadsorpsi dan menahan fasa diam dan
 membuat luas permukaan fasa diam seluas-luasnya.
 harus stabil,
 mudah diisikan dan tidak menghalangi aliran fasa gerak.

Sebagai zat padat penunjang biasa digunakan silika gel, serbuk

selulosa dan tanah diatomae.
 Kromatografi Kolom
Partisi

• Fase diam & fase gerak harus memiliki perbedaan kepolaran

yang cukup besar
Pure water > Methanol > Ethanol > Propanol > Acetone >
Ethyl acetate> Ether > Chloroform > Dichloromethane
>Benzene > Toluene > Carbon tetrachloride > Cyclohexane >
Hexane > Pentane.
misalnya jika fase diam adalah air, pentana dapat menjadi
pilihan sebagai eluen
• Support biasanya dijenuhkan dulu
 Kromatografi Kolom
Partisi

Pemisahan Support Fasa Diam Fasa Gerak

Alkohol-alkohol C1 – C4 Celite Air CHCl3 atau CCl4

Asam-asam lemak C1–C4 Silika gel Air CHCl3 / n-BuOH

Asam-asam amina Pati Air n-PrOH atau n-BuOH /

HCl

Fenol-fenol Selulosa Air Me-OH / n-BuOH /

CHCl3

Lipida-lipida Silika gel Air Bermacam-macam

 Gel Permeation
Chromatography (GPC)

GPC dikenal juga dengan istilah :

Size Exclusion Chromatography (SEC)
Molecular Exclusion Chromatography (MEC)
Molecular Sieve Chromatography (MSC)
Gel Filtration Chromatography (GFC)
Gel Chromatography
 Gel Permeation
Chromatography (GPC)

Pada kromatografi gel, fasa diam adalah gel yaitu suatu

matriks polimer yang berpori-pori dan pori-porinya
seluruhnya terisi oleh pelarut yang digunakan sebagai fasa
gerak.

Ukuran pori gel sangat menentukan karena dasar

pemisahan pada sistem ini adalah bahwa molekul yang
ukuran besar diatas ukuran pori akan sama sekali tidak dapat
masuk ke dalam gel,

sedang molekul yang lebih kecil dari ukuran pori akan dapat
masuk dan menggunakan sebagian atau seluruh ruangan
bagian gel tersebut
 Gel Permeation
Chromatography (GPC)

Aliran fasa gerak akan menyebabkan molekul yang

lebih besar bergerak melewati kolom tanpa
hambatan tanpa menembus masuk ke dalam
matriks gel,

sementara molekul yang lebih kecil akan terhambat

sesuai dengan masuknya ke dalam gel.

Komponen dari campuran akan muncul keluar dari

kolom berurutan tergantung massa molekul, yang
paling besar akan keluar paling dahulu
 Gel Permeation
Chromatography (GPC)

Senyawa yang sama sekali tidak dapat masuk ke dalam

gel akan terpisah satu sama lain.

Molekul dengan ukuran intermediate (diantara besar

dan kecil) akan tertahan yang lamanya bergantung
pada perembesan mereka dalam matriks.

Efek adsorpsi pada permukaan butiran gel biasanya

dapat diabaikan.
 Gel Permeation
Chromatography (GPC)
Gel merupakan senyawa yang terdiri dari rantai-rantai polimer panjang
berhubungan silang dan membentuk kerangka tiga dimensi.

Kebanyakan mempunyai gugus polar yang mampu mengadsorpsi air atau

pelarut lain yang polar, ada pula yang mampu mengadsorpsi pelarut lain yang
non polar.

Bila suatu gel mengadsorpsi cairan, maka akan terjadi perentangan struktur
dan pembukaan dan terjadi penghilangan celah-celah yang terdapat di dalam
gel, tergantung pada banyaknya hubungan silang, terdapat pula macam-
macam ukuran molekul yang tepat dapat masuk ke ruang dalam gel.

Batas-batas ukuran molekul yang dapat masuk disebut Ukuran Kritis

(exclusion limit) yang bervariasi pada berat molekul antara 1000 – beberapa
juta.
 Gel Permeation
Chromatography (GPC)

Beberapa jenis gel yang biasa digunakan :

 Sephadex untuk pemisahan molekul yang besar dalam biokimia
 Biogel P untuk molekul dengan bobot molekul 1.800 – 400.000
 Agarose untuk molekul dengan bobot molekul > 500.000
 Styragel untuk molekul dengan bobot molekul 1.600 – 40 juta
 Gel Permeation
Chromatography (GPC)
Aplikasi
 Penghilangan garam (desalting)
Menghilangkan garam dan molekul kecil dari makromolekul dan merupakan
masalah umum dalam pemisahan biokimia.
Desalting dengan mudah dapat dilakukan dengan kolom gel yang sederhana
dengan laju aliran yang tinggi.

 Pemekatan
Larutan encer makromolekul dengan Bobot Molekul lebih tinggi dari exclusion
limit suatu gel dapat dipekatkan dengan menggunakan sifat higroskopis dari
gel kering. Bila gel kering dimasukkan dalam larutan encer maka air dan
garam-garam serta molekul yang kecil akan terpisah oleh gel tersebut, sedang
makromolekul tertinggal dalam larutan sisa dengan kadar lebih tinggi.

 Pemisahan
Untuk senyawa-senyawa berbobot molekul tinggi seperti protein, pestisida,
asam nukleat, polisakarida, enzim dan hormon
 Kromatografi Pertukaran Ion/ Ion Exchange
Chromatography
Prinsip
Proses dimana ion dari larutan elektrolit dibawa agar kontak
dengan resin pertukaran ion.

Resin pertukaran ion merupakan polimer larut yang terdiri

dari "matrix" (Lattice atau kerangka) yang membawa muatan
tetap (tidak dapat ditukarkan) dan mobile ion aktif "ion counter"
yang mudah lepas melekat pada matriks.

Dalam air, counter-ion bergerak secara leluasa dalam rangka &

dapat digantikan oleh ion dengan muatan yang sama dalam
larutan sekitarnya.

Resin penukar ion dibedakan menjadi 2 macam, yaitu penukar

kation dan penukar anion
 Kromatografi Pertukaran Ion/ Ion Exchange
Chromatography

 Sebagai bahan penukar ion digunakan resin penukar ion sintetik yang
mempunyai stabilitas kimiawi serta ukuran partikel yang seragam.

Resin merupakan suatu polystyrene yang dibuat dengan proses

polimerisasi dari styrene dan adanya sedikit divinyl benzene. Kemudian ke
dalam polystyrene dimasukkan gugus-gugus polar yang dapat memberikan
sifat pertukaran ion.

 Resin dapat dibuat dalam bentuk butiran-butiran atau dalam bentuk

lembaran (membran).

Selain polystyrene dapat juga digunakan asam polimetakrilat

(polymetacrylic acid).
 Kromatografi Pertukaran Ion/ Ion Exchange
Chromatography

penukar kation

ion aktif ( counter ion) adalah kation.

Yang mempunyai gugus polar yang melekat pada matriks bersifat asam
(asam sulfonat, asam karboksilat, fenol, asam fosfat)
X-COO- H+
X = Frame work (matrix)
-COO- = Fixed charge (anionic), Non-exchangeable
H+ = Counter ion (cation), Exchangeable
 Penukar ion

Penukar ion terdapat dalam bentuk organik maupun

anorganil

 Penukar ion Anorganik

Pada umumnya tanah liat, tanah, mineral mis zeolit
digunakan untuk "pelunakan air".
– Kerugian: kapasitas pertukaran ion rendah.
– Keuntungan:
Tahan terhadap suhu tinggi.
kapasitas volume tinggi.
selektivitas tinggi terhadap ion anorganik sederhana
Penukar ion Organik
They may be natural or synthetic.
Preparation of organic synthetic ion exchangers :
Polycondensation of phenols, sulpho- & carboxy-
derivatives with formaldehyde → cationic
exchangers.
Polycondensation of aromatic amines with
formaldehyde → anionic exchangers.
These techniques yield products linear in structure &
relatively soluble in water which are now replaced
by resin materials based on styrene divinyl benzene
copolymers and polyacrylate.
 Aplikasi

1- Water softening:
Removal of Ca2+, Mg2+ & other multivalent ions causing
hardness of water by filtration through a layer of strong
cation resin.
2-Water demineralization:
Removal of cations & anions dissolved in water. Usually
carried by the two step technique in which two columns
of strongly acid cation exchanger in [H+] form & strongly
basic anion exchanger in [OH-] form are used in
sequence.
3- Neutralization:
Cationic exchanger in [H+] can be used to neutralize alkali
hydroxide & anionic exchanger in [OH+] form to
neutralize the acidity.
 Aplikasi
4- Separation of electrolytes from non-
electrolytes.

5- Separation of carbohydrates & their

derivatives:
Uronic acids separated on anion exchanger.
Sugars converted into ionized form by using
borate& separated on strong anion exchanger.
Hexosamines separated on strong cation
exchanger.
Kromatografi Afinitas
Dalam sistem ini fasa diam berupa suatu kerangka zat padat yang
mempunyai afinitas berlainan dengan berbagai senyawa.

Pemisahan dalam kromatografi afinitas terjadi karena interaksi-

interaksi biokimia yang sangat spesifik.

Salah satu kolom yang menggunakan prinsip ini adalah kolom protein
A sepharosa.

Fase diam yang digunakan mengandung gugus-gugus molekul yang

hanya dapat menyerap sampel, jika ada kondisi-kondisi yang terkait
dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai, misalnya
dalam interaksi antara antigen dan antibodi).

Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein

(enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
Kromatografi Afinitas

Proses kromatografi afinitas ini melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom

afinitas dengan adanya fase gerak (dengan pH yang tepat) dan komposisi
pelarut untuk ikatan solut-ligan.

Pelarut ini menggambarkan fase gerak lemah pada kolom afinitas yang
disebut dengan bufer aplikasi.

Selama fase pemisahan, senyawa-senyawa yang komplemen dengan ligan

afinitas dalam kolom akan berikatan (membentuk kompleks ligan-solut) dan
tertahan sedangkan senyawa-senyawa lain yang tidak terikat akan keluar
kolom.

Senyawa yang tertahan tersebut dikeluarkan menggunakan pelarut yang

dapat memecahkan kompleks ligan-solut tersebut yaitu elusi buffer. Kolom
afinitas yang telah digunakan ini dapat digunakan kembali dengan
disetimbangkan kembali menggunakan buffer aplikasi.
Kromatografi Afinitas

Proses ini digunakan misalnya dalam

reaksi enzimatis secara kontinyu.

Enzim mula-mula diikatkan pada fasa

diam, kemudian zat yang akan
direaksikan dialirkan melalui kerangka
yang telah mengikat enzim tersebut