Kromatografi

Anindita Tri Kusuma Pratita

Kimia Analisis
StiKes BTH Tasikmalaya
2018
 SEJARAH
Kromatografi

1901

Mikhail Tswett
• Penelitian mengenai pigmen
warna pada tanaman
• Menggunakan suatu teknik untuk
memisahkan berbagai pigmen-
pigmen warna pada berbagai
variasi tanaman seperti klorofil, Mikhail Tswett
xantofil dan karotenoid Russian Botanist
(1872-1919)
 SEJARAH
Kromatografi

 Kalsium karbonat  sebagai

adsorben
 Ekstrak etanol yang
mengandung pigmen (sampel)
dituangkan pada bagian atas
kolom
Later  Kolom dicuci dengan cara
menambahkan lagi etanol dan
dibiarkan mengalir ke bawah 
setelah beberapa saat: pigmen
yang semula satu warna menjadi
beberapa warna yang berurutan
dari bagian atas sampai bawah
(tampak sebagai zone-zone
berwarna)
 Pendahuluan
Kromatografi

Chromatography = Chroma (colour) + Graphein (Writing)

Chromatography = Colour Writing

“Penulisan dengan warna”  sudah tidak tepat lagi, karena dapat juga
dipisahkan senyawa yang tidak berwarna

Definisi kromatografi menurut IUPAC

kromatografi adalah metode yang digunakan terutama untuk memisahkan
komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara
dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa padatan atau
cairan yang dilapiskan pada padatan atau gel (supporting medium).
 Penggunaan Kromatografi
Untuk penelitian

• Analisis : meneliti campuran dari suatu komponen dan hubungan

satu dengan lainnya
• Identifikasi : menentukan identitas dari suatu campuran atau
komponen berdasarkan komponen yang diketahui
• Pemurnian : memisahkan komponen menjadi suatu isolat untuk
penelitian lebih lanjut
• Kuantifikasi : menentukan jumlah dari suatu campuran
 Penggunaan Kromatografi
Untuk kehidupan nyata

• Perusahaan farmasetika – untuk menentukan jumlah zat kimia

yang terdapat pada produk
• Rumah Sakit – untuk mendeteksi darah atau kadar alkohol
pada pasien
• Hukum – untuk mengumpulkan sampel yang terdapat pada TKP
hingga sampel dari tersangka
• Lingkungan – untuk menentukan tingkat dari polutan pada air
• Pabrik manufaktur – untuk memurnikan senyawa yang
diperlukan untuk pembuatan produk
 Klasifikasi Kromatografi
Based on process/mechanism

Mode or type Stationary phase Mobile phase Mechanism

Adsorption Solid that attracts the Liquid or gas Solutes move at different rates according to
Chromatography solutes the forces of attraction to the stationary phase.
Partition Chromatography Thin film of liquid Liquid or gas Solutes equilibrate between the 2 phases
formed on the surface according to their partition coefficients
of a solid inert support
Ion Exchange Solid resin that carries Liquid containing Solute ions of charge opposite to the fixed
Chromatography fixed ions & mobile electrolytes ions are attracted to the resin by electrostatic
couterions of opposite forces & replace the mobile counterions.
charge attached by
covalent bonds
Molecular Exclusion Porous gel with no Liquid Molecules separate according to their size:
Chromatography attractive action on 1.Smaller molecules enter the pores of the
solute molecules gel, and need a larger volume of eluent.
2.Larger molecules pass through the column
at a faster rate.
Affinity Chromatography Solid on which specific Liquid or gas Special kind of solute molecules interact
molecules are with those immobilized on the stationary
immobilized phase
 Klasifikasi Kromatografi

Based on place of stationary phase:

1.Planar Liquid Chromatography
 Thin Layer Chromatography
 Paper Chromatography
2.Column Liquid Chromatography
 Gas Liquid Chromatography
 Column Chromatography
 High Performance Liquid Chromatography
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Mekanisme Pemisahan
Kromatografi

Adsorpsi

• adsorpsi komponen2 campuran

dengan afinitas berbeda terhadap
permukaan fase diam.
• komponen yang mempunyai
afinitas besar terhadap absorben
akan secara selektif tertahan dan
Komponen dengan afinitas kecil
terhadap fase diam akan mengikuti
aliran pelarut.
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Fase diam
 Kromatografi juga merupakan analisis
Chamber cepat yang memerlukan bahan
sangat sedikit, baik penyerap
maupun cuplikannya.

Fase gerak
 Fase Diam
Kromatografi lapis tipis

 Merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter

partikel antara 10-30 μm.

 Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika

 Permukaan bidang datar yang digunakan bisa berupa

lempeng kaca, pelat alumunium atau pelat plastik
Beberapa Fase Diam
Kromatografi lapis tipis
 Fase Diam
Kromatografi lapis tipis

• Silika merupakan fase diam yang paling banyak digunakan.

Silika gel GF254 (mengandung pengikat gipsum & indikator
fluoresensi timah kadmium sulfida/mangan timah silikat
aktif, yang berfluoresensi pada 254 nm
• Bersifat polar
• Pemisahan sampel berdasarkan pada polaritas
 Fase Gerak
Kromatografi lapis tipis

a. Pelarut tunggal
b. Pelarut campuran
 Berdasarkan polaritas senyawa
 Campuran 2 pelarut organik ini daya elusi campuran kedua pelarutnya dapat mudah
diatur

Cara memilih dan mengoptimasi fase gerak:

• Fase gerak mempunyai kemurnian yang tinggi
• Daya elusi fase gerak diatur sedemikian rupa sehingga nilai Rf terletak antara 0,2-0,8
• Penggunaan fase diam polar (silika gel) akan menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut
yang sedikit polar ke dalam pelarut non polar akan meningkatkan Rf secara signifikan
 Fase Gerak
Kromatografi lapis tipis

Seorang peneliti akan melakukan isolasi

suatu senyawa. Selama proses isolasi
diperlukan pemantauan dengan metode
KLT. Eluen yang digunakan adalah
kloroform : etanol : asam asetat glasial
(5:3:2) sebanyak 100 ml. Hitunglah masing-
masing kebutuhan komponen eluen yang
dibutuhkan!
 Aplikasi Penotolan Sampel
Kromatografi lapis tipis

 Untuk memperoleh
reprodusibilitas, volume
sampel yang ditotolkan
paling sedikit 0,5 µl.
 Jika volume sampel yang
ditotolkan lebih besar dari 2-
10 µl, maka penotolan harus
dilakukan secara bertahap
dengan dilakukan
pengeringan antar penotolan
 Penjenuhan Chamber
Kromatografi lapis tipis

• Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah

ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase
gerak kurang lebih 0,5-1 cm.
• Tinggi fase gerak dalam bejana harus
dibawah lempeng yang telah berisi totolan
sampel.
• Untuk melakukan penjenuhan fase gerak,
biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring
. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari
kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa
fase gerak telah jenuh.
 Spot Apperance
Kromatografi lapis tipis

A. Penampak bercak
• Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak
dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak
menjadi jelas
• Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan
bereaksi secara kimia dengan solute yang mengandung gugus
fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang
diperlukan pemanasan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi
pembentukan warna dan intensitas warna bercak
 Penampak Bercak
Kromatografi lapis tipis

 Penampak Bercak kimia, berdasarkan sifatnya:

1. Permanen: Asam sulfat pekat
2. Sementara: Uap Iodium
 Penampak Bercak kimia, berdasarkan
spesifisitasnya:
1. Spesifik:
FeCl3, Dragendorff, dll
2. Umum:
Uap Iodium, Asam sulfat pekat
Spot Apperance
Kromatografi lapis tipis

B. UV Light
 Plat dengan indikator floresensi
1.Solute mengandung ikatan rangkap konjugasi

• Latar berpendar
• Spot hitam

2.Solute tanpa ikatan rangkap konjugasi

• Latar berpendar
• Pendaran spot berbeda dengan latar
 UV light
Kromatografi lapis tipis

• Cara fisika sinar ultraviolet

• untuk senyawa yang dapat berfluorosensi,
membuat bercak akan terlihat jelas.
• Mengamati lempeng dibawah lampu
ultraviolet yang dipasang panjang gelombang
emisi 254 atau 366 untuk menampakkan
solute sebagai bercak yang gelap atau bercak
yang berfluorosensi terang pada dasar yang
berfluorosensi seragam.
Perhitungan Nilai
Retention Factor (RF)
• Perhitungan nilai Rf didasarkan
atas rumus : Rf=jarak yang
ditempuh oleh komponen dibagi
jarak yang ditempuh oleh pelarut
• Nilai Rf dinyatakan hingga angka
1,0 beberapa pustaka menyatakan
nilai Rf yang baik yang
menunjukkan pemisahan yang
cukup baik adalah berkisar antara
0,2-0,8.
 Contoh perhitungan Rf
Kromatografi lapis tipis

Jika komponen berwarna merah

bergerak dari 1.7 cm dari garis
awal, sementara pelarut berjarak 5 cm
5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk
komponen berwarna merah
menjadi:
1,7 cm
Kromatografi Kertas
Mekanisme Pemisahan
Kromatografi

Partisi

• Proses pemisahan komponen2 dari

campuran
• komponen akan terpisah
dipengaruhi oleh kesetimbangan
antara fase gerak dan fase diam
berdasarkan koifisien partisinya
 Mekanisme Pemisahan
Kromatografi

Berdasarkan kesetimbangan fisik  ketika zat terlarut

berpindah antara fase gerak dan fase diam

K = koefisien distribusi atau

rasio partisi
CS = konsentrasi molar dari zat
terlarut pada fase diam
CM = konsentrasi molar pada
fase gerak
“A” diadsorbsi ke fase diam
“A” berpindah ke fase gerak.
 Pendahuluan
Kromatografi kertas

• Terjadi partisi yang dipengaruhi oleh

ketimbangan fase diam dan fase
gerak
• Fase diam menggunakan selulosa
(kertas Whatman)
• Fase gerak menggunakan BAW
(butanol:asam asetat:air), asam
asetat 2-50%
 Kromatografi Kertas

Deposition of a Deposition of a Deposition of

drop of colour drop of solvent more solvent
That’s all. Thank you! 
Any Questions?