KROMATOGRAFI KERTAS

&
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
METODE PEMISAHAN BAHAN ALAM
R. Herni Kusriani,M.Si.,Apt.

PENDAHULUAN
Kromatografi adalah suatu cara pemisahan
dimana komponen-komponen yang akan
dipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salah
satunya yang merupakan fase stasioner (diam),
dan yang lainnya berupa fasa mobil (fasa gerak).
Fase gerak dialirkan menembus atau sepanjang fase
stasioner.
Fase diam cenderung menahan komponen campuran,
sedangkan fasa gerak cenderung menghanyutkannya.

KROMATOGRAFI PLANAR
Kromatografi datar
Sistem : Sistem terbuka
interaksi antara fase diam, fase
gerak dan solut berada pada
sistem terbuka, ada kontak
dengan udara

Kromatografi kolom
Sistem : Sistem tertutup
interaksi antara fase diam, fase
gerak dan solut berada pada
sistem tertutup, tidak terjadi
kontak dengan udara (minimal)

Arah : sebagian besar merupakan Arah : Searah dengan gravitasi

ascending (menaik), melawan
gravitasi

KROMATOGRAFI KERTAS
Kromatografi kertas merupakan kromatografi
cairan - cairan dimana sebagai fasa diam
adalah lapisan tipis air yang diserap dari
lembab udara oleh kertas.

Prinsip dasar kromatografi kertas

Partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang
saling tidak bercampur.
Partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan
fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang
sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.

Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan

polimer dari gula sederhana, yaitu glukosa.

Teknik KKt :
cuplikan yang mengandung campuran yang akan
dipisahkan diteteskan / diletakkan pada daerah yang
diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia
akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda
telah kering kertas dimasukkan dalam bejana tertutup
yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan
cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang
dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda
tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan
akan terlarut dari kertas).

 Metoda identifikasi yang paling mudah adalah

berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif
terhadap permukaan pelarut, menggunakan
harga Rf.
Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi
suatu senyawa pada kromatogram dan pada
kondisi konstan merupakan besaran karakteristik
dan reprodusibel.
Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan
antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi
muka pelarut dari titik awal.
Rf = Jarak titik tengah noda dari titik awal
Jarak tepi muka pelarut dari titik awal

Faktor yang menentukan harga Rf

1) Pelarut
koefisien partisi menyebabkanperubahan yang sangat kecil dalam komposisi
pelarut dapat menyebabkan perubahan harga Rf.
2) Suhu
perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
3) Ukuran dari bejana
volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi
mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen - komponen pelarut dari
kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama,
seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi
akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi
harga Rf.
4) Kertas,
Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan
partisi.
5) Sifat dari campuran
berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari
fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik
dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.

Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994)

adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam
amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino
menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena
kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air)
yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang.
Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan.

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan
tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber.
Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang
bertindak sebagai penunjang fase diam.
Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam
dan terbentuklah kromatogram.
Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan
tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali
senyawa-senyawa yang terpisahkan.

Prinsip KLT
Didasarkan atas partisi dan adsorpsi. Zat
penjerap merupakan fase stasioner, berupa
bubuk halus dibuat serba rata dan tipis diatas
lempeng kaca. Fase diam yang umum
digunakan adalah silika gel

Cara kerja KLT :

Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan
fisikokimia.
Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas
bahan berbutir butir (fase diam), ditempatkan pada
penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang
cocok.
Campuran yang akan dipisah berupa larutan ,
ditotolkan berupa berupa bercak atau pita (awal).
Setelah plat itu ditaruh didalam bejana tertutup rapat
yang berisi larutan pengembang yang cocok.

Proses Penjenuhan

Gelas kimia atau chamber wadah

pengembang ditutup supaya terjenuhkan oleh
uap dari pelarut.
Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas
kimia biasanya ditempatkan kertas saring yang
terbasahi oleh pelarut.
Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap
mencegah penguapan pelarut.

Sifat penjerap dan sistem larutan pengembang harus

dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama
untuk mencapai pemisahan.
Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram
biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf.
Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya
dapat ditentukan dua desimal.
hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h),
menghasilkan nilai berjangka 0 100.
Jika angka hRf lebih tinggi dari hRf yang dinyatakan,
kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hRf lebih rendah
maka komponen polar pelarut harus dinaikkan.

Fase Diam KLT

Bahan adsorben sebagai fasa diam :
silica gel,
alumina, dan
serbuk selulosa.
Partikel silica gel mengandung
gugus hidroksil di permukaannya
yang akan membentuk ikatan
hidrogen dengan molekul -molekul
polar.
Alumina lebih disukai untuk
memisahkan senyawa -senyawa
polar lemah
Magnesium silikat, kalsium silikat,
dan arang aktif mungkin juga dapat
digunakan sebagai adsorben.

 Kebanyakan penjerap yang digunakan adalah

silika gel.
Silika gel yang digunakan kebanyakan diberi
pengikat yang dimaksudkan untuk memberi
kekuatan pada lapisan dan menambah adhesi
pada gelas penyokong. Pengikat yang
digunakan kebanyakan kalsium sulfat.
Tetapi biasanya dalam perdagangan silika gel
telah diberi pengikat. Jadi tidak perlu
mencampur sendiri dan diberi nama dengan
kode silika gel G.

 Proses Adsorpsi
Peranan penting : adsorpsi - desorpsi
Fase gerak dan molekul solut
berkompetisi untuk sisi aktif
adsorben.
Adsorpsi nisbi fase gerak naik,
adsorpsi solut harus turun.
Penyebab adsorbsi :
dipole-dipole antara adsorben polar
dan solut polar
ikatan hidrogen, misal. SiOH....O(CH3)2
(atom basa, O, N, S, dll)
daya terpolarkan : antara adsorben
polar dengan senyawa terpolarkan
(senyawa aromatik, dll)

Fase Gerak

Eluen pengembang dapat berupa pelarut

tunggal dan campuran pelarut dengan
susunan tertentu.
Pelarut-pelarut
pengembang
harus
mempunyai kemurnian yang tinggi.
Terdapatnya sejumlah kecil air atau zat
pengotor lainnya dapat menghasilkan
kromatogram yang tidak diharapkan.

Pemilihan Pelarut
Sifat pelarut :
Sifat khas pemisahan
Polaritas campuran pelarut bukan fungsi linier
tapi logaritmik

Pelarut A dicampur dengan pelarut B

Pemilihan Pelarut
Pencampuran
Polaritas pelarut masing-masing hendaknya tidak jauh

Syarat utama fase gerak

kekuatan dan polarita pelarut cukup tepat
rendah
kecocokan dengan detektor
stabilitas dan kecocokan pelarut dengan solut
mudah menguap

Sistem Pengembang
Isokratik : suatu pelarut atau campuran
pelarut yang komposisi dan polaritasnya tidak
berubah selama proses berlangsung
Elusi gradien/ bertahap : selama pengerjaan
komposisi fase gerak diubah, pada umumnya
perubahan menuju ke polarita menaik,
sehingga mempercepat elusi komponen yang
ditahan dengan kuat (perubahan polarita,
kekuatan ion, pH)

Antaraksi adsorben & solut

Adsorben yang paling banyak digunakan silika,
kemudian alumina, adsorben lainnya kurang.
Elusi campuran senyawa, paling dulu keluar
senyawa paling nonpolar, mis.
benzenasetofenonbenzil alkohol
(berdasarkan urutan polaritas menaik)
(cat : asetofenon memiliki BM>> namun pemberi
kepolaran sehingga lebih polar dari benzen)

Antaraksi adsorben & solut

Polaritas solut naik tambatan naik. Urutan
polaritas naik (tambatan naik) :
RH<RX<RNO2<ROR<RCOOR<RCRO<RCHO<RC(
NHR)O<RNH2;R2NH;R3N<ROH<
H2O<ArOH<RCOOH<Nukleotida<NH3+RCO2-

Antaraksi adsorben & solut

Senyawa yang punya gugus dalam posisi orto
paling kurang ditambat, tambatan naik pada
meta, kemudian para. Misalnya :

Pereaksi penampak
Pereaksi penampak adalah larutan pereaksi yang digunakan untuk
menyemprot lempeng KLT agar bercak yang terjadi dapat jelas
terlihat.
a) Anisaldehid-asam sulfat P
Untuk mengamati minyak atsiri, saponin, zat pedas dan lain-lain.
b) Dragendroof
Untuk mengamati alkaloid.
c) Antimon (III) klorida
Untuk mengamati glikosida jantung, saponin.
d) Besi (III) klorida
Mendeteksi senyawa golongan Fenolat
e) Alumunium Klorida
Mendeteksi senyawa golongan Flavonoid
dll

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam KLT :

a) Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih
dahulu agar pada proses elusi lempeng silica gel dapat
menyerap dan berikatan dengan sampel.
Pengaktifan lempeng dilakukan dalam oven pada suhu
1100C selama 30 menit.
b) Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air
atau gas lain yang mengisi fase penjerap yang akan
menghalangi laju eluen.
c) Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu
pekat sebab pemisahannya akan sulit sehingga didapat
noda berekor.
d) Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda
yang baik.
e) Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak
menghasilkan noda lain.

Noda pada KLT

Mekanisme panampakan noda pada UV yaitu
suatu molekul yang mengabsorbsi cahaya
ultraviolet akan mencapai suatu keadaan
tereksitasi dan kemudian memancarkan
cahaya ultraviolet atau cahaya tampak pada
waktu kembali ke tingkat dasar (emisi), emisi
inilah yang digambarkan sebagai fluoresensi.

Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor

disebabkan karena :
Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak
tepat
Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa
Lempeng yang tidak rata

Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis yaitu :

lebih cepat dan lebih reproducible dari kromatografi
kertas,
untuk menyempurnakan pemisahan,
area dari bercak lebih kompak dan jenis spray-reagents
lebih banyak termasuk yang bersifat korosif dapat
digunakan bila adsorben bukan selulosa.

Manfaat Kromatografi Lapis Tipis

Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.
Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.
Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.
Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran
senyawa obat.