Handout

Spektrofotometri UV & UV-Vis

Oleh :
Dr. Nita Kusumawati, M.Sc

Jurusan Kimia FMIPA Unesa

2016
1
Prinsip Dasar Analisis Spektrometri

 Prinsip dasar analisis spektrometri :

Larutan sampel menyerap radiasi elektromagnetik dan
jumlah intensitas radiasi yang diserap oleh larutan sampel
dihubungkan dengan konsentrasi analit (zat/unsur yang
akan dianalisis) dalam larutan sampel

Contoh :
Larutan yang mengandung ion Cu2+ berwarna biru, karena :
Larutan tersebut menyerap warna komplementer , kuning,
dari sinar putih dan meneruskan warna sisanya yaitu biru,
sehingga larutan teramati oleh mata kita berwarna biru.
2
 Hubungan intensitas yang diserap dengan konsentrasi
larutan

“Semakin pekat larutan Cu2+, akan semakin banyak warna

kuning yang diserap, sehingga warna biru yang diteruskan
akan semakin kuat”

Jadi, dengan mengukur banyaknya warna kuning yang

diserap oleh larutan, akan dapat dihitung konsentrasi ion
Cu2+ dalam larutan.
3
 Spektra Elektromagnetik
 Radiasi elektromagnetik adalah :
(1) Suatu bentuk energi yang merambat sebagai suatu
gelombang transversal
(2) Gelombang tersebut bervibrasi tegak lurus terhadap
arah rambatan.

 Beberapa istilah berkaitan dengan radiasi elektromagnetik :

(1) Panjang Gelombang (λ) :
Jarak satu putaran gelombang (cycle) lengkap.
4
(2) Frekuensi (ν) :
Banyaknya putaran gelombang yang melewati titik
tertentu per satuan waktu.
(3) Bilangan gelombang (ν) :
Banyaknya gelombang dalam suatu satuan panjang
tertentu (merupakan kebalikan panjang gelombang)

5
 Hubungan-hubungan antar istilah :
(1) Panjang gelombang dengan Frekuensi.
λ = c/f
dimana, λ = Panjang gelombang (cm)
f = Frekuensi gelombang (detik-1 atau Hertz)
c = Kecepatan cahaya (3x1010 cm/detik)

(2) Bilangan gelombang

ν = 1/λ = f/c
dimana, ν = bilangan gelombang
6
 Warna Radiasi Elektromagnetik yang Diserap &
yang Diteruskan (Komplemen) Pada Daerah Vis
λ yang diserap Warna radiasi Warna radiasi
larutan, nm elektromagnetik elektromagnetik
yang diserap yang diteruskan
(komplemen)
380-450 Ungu Kuning-Hijau
450-495 Biru Kuning
495-570 Hijau Ungu
570-590 Kuning Biru
590-620 Oranye Hijau-Biru
620-750 Merah Biru-Hijau 7
 Asal Mula Adsorpsi
 Adsorpsi molekul berasal dari peristiwa perpindahan
elektron valensi molekul ke tingkat energi orbital yang lebih
tinggi dalam molekul tersebut.

 Elektron valensi molekul dapat dijumpai pada ketiga jenis

orbital berikut ini :
1. orbital ik. Tunggal (orbital σ)
2. orbital ik. Rangkap 2 dan 3 (orbital π)
3. orbital non-bonding (pasangan elektron bebas)
8
 Jika radiasi elektromagnetik dengan f sesuai diserap oleh
suatu kromofor, maka akan terjadi transisi elektronik dari
salah satu orbital terisi ke suatu orbital kosong, biasanya
orbital antibonding σ* dan π*.
 Transisi elektronik orbital bonding mempunyai frekuensi
yang cukup tinggi (λ kecil) sehingga tidak teramati oleh alat
spektrometer uv-vis.
 Adsorpsi yang teramati pada daerah visible umumnya
berasal dari transisi : π→π*, n→σ*, n→π*.

9
 Istilah Penting Berkenaan dengan
Spektrofometri UV-Tampak
 Kromofor
Gugus tak jenuh kovalen yang bertanggung jawab terhadap
terjadinya peristiwa adsorpsi radiasi oleh molekul (Contoh : C=C,
C=O dan NO2)
 Auksokrom
Gugus jenuh yang apabila terikat pada kromofor dapat menyebabkan
perubahan λ dan intensitas absorbansi maksimum molekul (Contoh :
-OH, -NH2 dan –Cl)
 Pergeseran Batokromik
Pergeseran adsorpsi molekul ke λ yang lebih tinggi akibat substitusi
suatu auksokrom atau karena pengaruh solven. Disebut juga dengan
red-shift.
10
 Pergeseran Hipsokromik
Pergeseran adsorpsi molekul ke λ lebih rendah akibat
substitusi suatu auksokrom atau karena pengaruh solven.
Disebut juga dengan blue-shift.

 Efek Hiperkromik
Kenaikan intensitas adsorpsi molekul terhadap radiasi.

 Efek Hipokromik
Penurunan intensitas adsorpsi molekul terhadap radiasi.

11
 Transisi “allowed” dan “Forbidden”
1. Allowed Transition
Transisi yang secara statistika diperkenankan.
Adsorpsi dari transisi elektronik jenis ini biasanya sangat kuat dan
mempunyai harga absorptivitas molar (ε) > 10.000

2. Forbidden Transition
Transisi yang secara statistik probabilitasnya nol.
Transisi ini secara statistik diharapkan tidak pernah terjadi, tetapi
faktanya sering terjadi. Adsorpsi yang dihasilkan biasanya
merupakan pita lemah dengan harga ε jarang melebihi 1000
Contoh : transisi d→d* u/ logam transisi, n→π* u/ gugus karbonil
(280 nm), π→π* u/ senyawa aromatis (230-330 nm). 12
 Contoh Adsorpsi Karakteristik
Senyawa Organik
 Senyawa yang hanya mengandung elektron σ
1. Contoh senyawa jenis ini adalah senyawa hidrokarbon
jenuh.
2. Karena senyawa jenis ini hanya mempunyai elektron σ,
maka transisi elektronik yang mungkin hanyalah σ→σ*.
3. Transisi ini memerlukan energi yang cukup tinggi, yaitu
185 kkal/mol, yang hanya dapat dipenuhi o/ uv-jauh.
Oleh karena itu, senyawa hidrokarbon jenuh adalah
senyawa transparan di daerah uv dekat.
13
 Hidrokarbon jenuh yang mempunyai elektron n
1. Senyawa hidrokarbon jenuh heteroatom yang memiliki
atom-atom O, N, S atau halogen yang selain memliki
elektron-σ juga memiliki elektron non bonding, sehingga
dapat mengalami transisi n→σ*.
2. Transisi ini membutuhkan energi <<< transisi σ→σ*, tetapi
mayoritas senyawa jenis ini belum menunjukkan serapan
di daerah uv dekat.
3. Contoh, alkohol dan eter mempunyai adsorpsi < 185 nm
sehingga sering dipakai u/ solven dalam analisis uv-vis.
Namun demikian, karena keberadaannya sebagai solven,
Konsentrasinya dalam larutan tinggi, sehingga A-nya
melebar sampai λ 200-220 nm.
14
 Senyawa yang mengandung elektron π
1. Senyawa ini umumnya juga mengandung pas. elektron
non-bonding, sehingga dapat mengalami 3 jenis transisi
elektronik : n→σ*, π→π*, dan n→π*.
2. Adsorpsi pada uv dekat umumnya berasal dari n→π*.

 Senyawa yang mempunyai ik. Rangkap terkonjugasi

1. Senyawa ini umumnya mengalami transisi π→π* yang
berasal dari elektron ikatan rangkap.
2. Contoh : benzena menunjukkan A-nya pada λ 184 nm
(ε=60.000), 204 nm (ε=7.900) dan 256 nm (forbidden
transition dengan ε=200).
15
 Perhitungan Kuantitatif
Dalam Spektrometri
 Hukum Lambert Beer
Jumlah radiasi yang diserap oleh suatu larutan sampel.

Po P

A = - Log T = Log 1/T = Log Po/P = abc

Jika b (cm) dan c (gram/liter), maka a = absorbtivitas

Jika b (cm) dan c (mol/liter), maka ε = absorbtivitas molar
16
Contoh Soal
1. Suatu larutan sampel dalam sel 1 cm setelah diukur
dengan spektrofotometer mentransmisikan 80% cahaya
pada suatu λ tertentu. Jika absorbtivitas zat pada λ ini =
2. Hitunglah konsentrasi zat tersebut !
2. Suatu larutan yang mengandung besi 1 mg/100 mL
(sebagai kompleks besi-tiosianat) teramati
mentransmisikan 70% dari sinar masuk.
a. Berapakah absorbansi larutan pada λ
b. Berapakah fraksi cahaya yang akan diteruskan jika
konsentrasi larutan besi tersebut 4 kali lebih besar ?

17
 Perhitungan Untuk Campuran
Lebih Dari Satu Spesies

 Menurut Hukum Beer

Absorbansi total dari dua zat atau lebih pada suatu panjang
gelombang tertentu akan sama dengan jumlah absorbansi dari
masing-masing zat tersebut (bersifat aditif), sehingga 2 zat yang
menyerap radiasi pada gelombang tertentu, diperoleh :
A = axbcx + aybcy atau
A = εxbcx + εybcy

dimana x adalah zat x dan y adalah zat y.

18
19
Keterangan :
Dari gambar tampak :
Aλ1 = Axλ1 + Ayλ1 = εxλ1 b cx + εyλ1 b cy

Aλ2 = Axλ2 + Ayλ2 = εxλ2 b cx + εyλ2 b cy

Aλ1 dan Aλ2 pada persamaan di atas ditentukan dengan mengukur A

larutan campuran pada λ 1 dan 2, sedangkan εxλ1 dan εxλ2 ditentukan
dengan mengukur A lar. murni x pada λ 1 dan 2, demikian pula
halnya dengan εyλ1 dan εyλ2 ditentukan dengan mengukur A lar. murni
y pada λ 1 dan 2. Dengan demikian variabel yang belum diketahui
adalah cx dan cy. Karena ada 2 persamaan dengan variabel yang
sama, maka baik cx dan cy dapat dihitung.

20
 Contoh Soal
 Kalium dikromat dan kalium permanganat dalam 1 M H2SO4 mempunyai
spektra A yang saling tumpang tindih. K2Cr2O7 mempunyai Amax pada
440 nm dan KMnO4 pada 545 nm (A sebenarnya adalah pada 525 nm,
tetapi λ yang lebih tinggi biasanya dipakai untuk penentuan karena
interferensinya minimal). Campuran kedua zat tersebut dianalisis dengan
mengukur A larutan pada kedua λ tersebut dengan hasil sbb : A440 =
0,405 dan A545 = 0,712. Tebal sel yang digunakan 1 cm. A larutan murni
K2Cr2O7 1x10-3 M dan KMnO4 2x10-4 M dalam 1 M H2SO4 menggunakan
sel yang sama adalah sebagai berikut :
ACr, 440 = 0,374 ACr, 545 = 0,009
AMn, 440 = 0,019 AMn, 545 = 0,475
Hitunglah konsentrasi bikromat dan permanganat dalam larutan
campuran tersebut !
21
 Penyimpangan Hukum
Lambert Beer
 Grafik antara absorbansi A vs C menurut hukum Lambert-
Beer seharusnya selalu memberikan kurva yang linier,
namun demikian penyimpangan terhadap hukum ini
kadang-kadang terjadi.
 Penyebab terjadinya penyimpangan hukum Lambert-Beer
dikelompokkan menjadi 3, yaitu :
1. Real Factor
2. Instrumental Factor
3. Chemical Factor

22
Ketiga faktor tersebut dapat menyebabkan kurva A vs C
menjadi kurva cekung (penyimpangan positif) atau kurva
cembung (penyimpangan negatif).
A
C
B

A = Penyimpangan positif
B = Penyimpangan negatif
C = Tidak terjadi penyimpangan
23
 Real Factor
 Penyimpangan ini terjadi karena pada waktu penurunan
hukum Lambert Beer terjadi pengabaian perubahan indeks
bias sepanjang medium yang dilalui sinar.

Sebenarnya yang berbanding lurus dengan C bukan hanya

konstanta ε, tetapi juga faktor ε x n/(n2 + 2)2.

Indeks bias larutan naik dengan naiknya konsentrasi, yang

berarti bahwa faktor n/(n2 + 2)2 nilainya mengecil.

Penyimpangan negatif akan terlihat dengan naiknya C

larutan 24
 Instrumental Factor
 Penyebab :
Sinar elektromagnetik yang digunakan dalam analisa tidak
monokromatis, dan umumnya terdiri dari beberapa λ.
 Contoh :
Misalkan sinar yang dipakai untuk analisis terdiri dari 2 λ, λ dan λ’,
menurut hukum Lambert-Beer absorbansi pada λ adalah :
A = Log (Po/P) = ε b c atau Po/P = 10 εbc
Sedangkan pada λ’ adalah
A = Log (Po/P) = ε’ b c atau Po/P = 10 ε’bc

Kekuatan radiasi pada kedua panjang gelombang tersebut sebelum

melewati medium penyerap radiasi adalah Po + Po’ dan setelah melewati
medium penyerap radiasi adalah P + P’, sehingga A total pada kedua λ
tersebut adalah : At = Log {(Po + Po’)/(P + P’)} 25
Atau :
At = Log {(Po + Po’)/(Po.10-εbc + Po’.10-εbc)}

(1) Jika ε = ε’, yang berarti bahwa sinar yang dipergunakan

benar-benar monokromatis, maka persamaan di atas
menjadi identik dengan hukum Lambert-Beer.
(2) Jika ε ≠ ε’, yang berarti bahwa sinar terdiri dari lebih dari
satu gelombang (polikromatis), maka akan terjadi
penyimpangan terhadap Hukum Lambert-Beer (grafik
tidak linier). Untuk ε > ε’, akan terjadi penyimpangan
negatif, sedangkan untuk ε < ε’ akan terjadi
penyimpangan positif.
26
 Chemical Factor
 Penyimpangan dari Hukum Lambert Beer seringkali
disebabkan oleh faktor-faktor kimia, seperti : disosiasi,
asosiasi, pembentukan kompleks, polimerisasi atau
solvolisis.
 Contoh :
1. Asam benzoat dalam larutan berada sebagai campuran dari
bentuk terionisasi dan bentuk tak terionisasi dari asam tersebut.
Dalam larutan encer terjadi kesetimbangan sbb :
C6H5COOH + H2O C6H5COO- + H3O+
(λmaks = 273 nm; ε = 970) (λmaks = 268 nm; ε = 560)

dari reaksi di atas terlihat bahwa absorptivitas molar, ε pada λmaks

273 nm akan turun dengan naiknya pengenceran larutan atau pd
27
pH tinggi karena disosiasi asam benzoat semakin besar.
2. Dalam larutan murni (tanpa adanya penambahan larutan buffer)
K2Cr2O7 akan berada dalam kesetimbangan dengan bentuk
kromatnya sesuai dengan persamaan kesetimbangan rx berikut :
Cr2O72- + H2O 2CrO4 -2 + 2H+
(λmaks = 350 nm; 450 nm) (λmaks = 372 nm)

Penyimpangan dari hukum Lambert-Beer akan terjadi apabila

larutan diencerkan dengan air. Konstanta kesetimbangan reaksi
di atas adalah:
[CrO4 -2]2[H+ ]2/[Cr2O72-] = K
Konsentrasi CrO4 -2 dan Cr2O72- dalam larutan sangat dipengaruhi
pH larutan. Efek ini dapat dikontrol dengan menambahkan asam
kuat ke dalam larutan u/ mempertahankan bentuk bikromat atau
dengan menambahkan basa kuat untuk mempertahankan bentuk
bentuk kromat. 28
 Contoh Soal

 Suatu larutan asam lemah HB (Ka = 1 x 10-3) menyerap

radiasi uv pada λmaks = 280 nm dengan harga ε = 975,
sedangkan spesies B- tidak menyerap radiasi. Jika sel yang
dipakai untuk pengukuran A mempunyai ketebalan 1 cm
dan C asam tersebut 2 x 10-3 M,
a. Hitunglah A larutan tersebut pada λmaks !
b. Jika larutan diencerkan 2x, berapakah A-nya?
c. Perkirakan apakah larutan tersebut mengikuti Hukum
Lambert-Beer !

29
 Kesalahan Fotometri
 Kesalahan fotometri adalah kesalahan yang diakibatkan oleh sel
fotolistrik pada detektor dalam membedakan sinar datang dan sinar
yang ditransmisikan.
 Kesalahan ini terjadi pada larutan yang terlalu encer dan pekat.
 Solusi :
Harus dicari daerah konsentrasi atau absorbansi yang memberikan
kesalahan paling minimum.
Berdasarkan penelitian :
Pada daerah transmitansi 10-80% (A= 1-0,1), kesalahan relatif dari
konsentrasi konstan, yang berarti kesalahan dalam analisis akan
minimum jika harga A diusahakan berada pada A = 0,1 – 1 dengan
cara mengencerkan atau memekatkan larutan.
30
 Instrumentasi spektrofotometri
 Alat yang dipakai untuk mempelajari adsorpsi atau emisi
radiasi elektromagnetik sebagai fungsi panjang gelombang
disebut spektrofotometer.
 Komponen utama alat spektrofotometer :
1) Sumber radiasi yang stabil dan berkelanjutan (kontinyu)
2) Sistem lensa, cermin dan celah untuk membatasi,
membuat paralel dan memfokuskan berkas sinar.
3) Monokromator, untuk menyeleksi sinar menjadi λ tertntu
4) Kontainer transparan untuk tempat sampel
5) Detektor radiasi yang dirangkaikan dengan suatu
pembaca (read out).
31
 BAGAN UMUM INSTRUMENTASI
SPEKTROFOTOMETER UV-VIS

Source Monokromator Sampel

Detektor

Read Out

32
Sumber Radiasi
 Radiasi sinar tampak (UV-Visible)
Menggunakan lampu filamen tungsten yang mempunyai daerah λ
pada rentang 320 – 2500 nm
 Radiasi Sinar Ultraviolet (UV)
Menggunakan lampu hidrogen atau deuterium yang menghasilkan
radiasi kontinyu pada λ = 180 – 375 nm.
Kelebihan lampu deuterium :
Dapat menghasilkan intensitas sinar yang lebih besar dari lampu
hidrogen.

33
 Monokromator
 Ada 2 jenis monokromator :
1> Prisma
Penguraian sinar didasarkan pada perbedaan indeks bias di
luar dan di dalam prisma, sehingga sinar diteruskan sesuai
dengan panjang gelombang masing-masing.
2> Difraksi Grating
Penguraian sinar didasarkan pada grating (permukaan benda
seperti gergaji). Grating dapat diputar dengan sudut tertentu
sehingga diperoleh sinar dengan λ yang diinginkan.
34
Difraksi Prisma

Sinar Putih

Red (longer wavelenght)

Blue (Shorter wavelenght)

Difraksi Grating
800
600
400
200

Sinar datang (200-800 nm)

Normal )β

º tertentu 35
 Kontainer Sampel (Sel/Kuvet)
 Sel atau kuvet tempat sampel (biasanya berupa larutan)
ditempatkan, harus terbuat dari bahan yang tembus radiasi
pada λ yang akan digunakan untuk pengukuran absorbansi
 Jenis Kuvet :
1) Untuk daerah UV (λ < 380 nm)
Sel dari kuarsa
2) Untuk daerah UV Vis (380 nm < λ < 750 nm)
a) Sel kaca silikat : 350 nm – 2 μm
b) Sel plastik : 350 – 750 nm

36
 Detektor
 Ada 3 jenis detektor yang biasa digunakan, yaitu :
1. Sel Fotovoltaik (Barrier layer)
2. Phototube
3. Photomultiplier tube

 Dari ketiga jenis detektor di atas, photomultiplier tube

adalah jenis detektor yang paling baik karena sifatnya yang
lebih sensitif, sehingga mampu membedakan perubahan
intensitas sinar meskipun sinar yang sampai ke detektor
sangat lemah.
37
 Macam-macam Spektrofotometer
 Ada 3 macam spektrofotometer :
1) Spektrofotometer berkas tunggal (single beam)
Alat ini hanya terdiri dari 1 berkas sinar, sehingga
pengukuran sampel dan blanko harus bergantian
menggunakan sel yang sama.
2) Spektrofotometer berkas ganda (double beam)
Banyak dijumpai pada alat spektrofotometer yang telah
memakai autoscanning λ dan mencatat secara otomatis
A sebagai fungsi λ.
Alat ini mempunyai 2 berkas sinar sehingga pengukuran sampel dan
blanko dapat dilakukan bersamaan.
3) Spektrofotometer Gilford
Banyak digunakan di lab. Biokimia dan mempunyai kelebihan
dibandingkan spektrofotometri biasa, yaitu mampu membaca absorbansi
38
 SOAL-SOAL LATIHAN
1. Jika analisis spektrofomoteri dilakukan terhadap sampel yang
memiliki struktur molekul seperti di bawah ini:

a) Metode analisis apa yang dapat digunakan? Jelaskan

alasannya !
b) Berdasarkan referensi, senyawa tersebut memiliki λmaks di
510 nm, tetapi berdasarkan pengukuran, senyawa tersebut
menunjukkan serapan maksimum di 525 nm. Analisa apa
yang terjadi, sebutkan penyebabnya dan bagaimana
solusinya ! 39
2. Jika senyawa A yang mempunyai struktur molekul seperti
tergambar di bawah ini, menyerap radiasi elektromagnetik,
maka :
a) Berapa jenis transisi elektronik yang dapat terjadi dan
sebutkan transisi elektronik apa saja !
b) Dapatkah senyawa ini dianalisis dengan metode
spektrofotometri ultraviolet? Jelaskan alasanmu?

40