HPLC II

Indah Solihah
 Teknik Elusi

Isokratik:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak tetap (polaritas tetap) selama proses
kromatografi berlangsung

Gradien:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah)
selama proses kromatografi berlangsung
2 HPLC-2011
Teknik Isokratik

3 HPLC-2011
Eluen= campuran A + B

50 % B

40 % B

4 HPLC-2011
30 % B

35 % B

5 HPLC-2011
 Teknik Gradien
Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas,
kemudian dilakukan
teknik elusi gradien

6 HPLC-2011
Hasilnya

7 HPLC-2011
 Normal-Phase HPLC
[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]

Senyawa polar:
- terelusi belakangan (tR panjang)
- semakin non-polar fase gerak, tR senyawa
polar makin panjang

Solven:
- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

Eluent strength:
- dimodifikasi dengan n-heksan
8 HPLC-2011
 Reversed-Phase HPLC
Reversed-Phase HPLC
[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]

Senyawa polar:
- terelusi lebih dahulu
Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar
lebih kuat tertahan
Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra-
hidrofuran
Eluent strength:
- dimodifikasi dengan air
(Kellner dkk., 1998)

9 HPLC-2011
 Detektor
Bagaimana
Memilih detektor
dan
Apa pertimbangannya

???
 Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2
golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat
secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan
detektor spektrometri massa;
detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
 Detektor HPLC
Bulk property detector (BPD) :
- mengukur sifat solute dan fase gerak
contoh : detektor indeks bias ( RI )

Solute property detector (SPD) :

- hanya mengukur sifat solute
- 1000 kali sensitif dibanding BPD
Contoh : detektor UV
 Syarat Detektor :
Cukup sensitif
Stabilitas dan reprodusibilitas tinggi
Respon linear terhadap solut
Waktu respon pendek sehingga tidak
bergantung flow rate (kec.alir)
Mudah digunakan
Tidak merusak sampel
 Detektor UV
Detektor ini bekerja pada tertentu dimana
pelarut tidak menyerap sinar pada tersebut
sedangkan cuplikan menyerap dengan kuat.
Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan
satu panjang gelombang (254 nm) dan detektor
dengan yg dapat diubah ubah antara 200-700
nm
Detektor mempunyai jangka kepekaan yg lebar
Detektor ini hanya bekerja jika senyawa
mempunyai kromofor
 Detektor UV
Untuk keperluan analisis komponen utama
dalam sampel secara HPLC-UV diperlukan
minimal nilai senyawa harus 10 M-1. cm-1
pada 185 nm.
Untuk keperluan trace analisis secara HPLC-
UV diperlukan minimal nilai senyawa harus
1000 M-1. cm-1
Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV,
senyawa dengan nilai senyawa 100 M-1.
cm-1 tidak mungkin dilakukan
UV / Visible detector
Advantages
High sensitivity & small
sample volume required
Can be used with gradient
elution
Is relatively cheap and not
sensitive to temperature
Sensitive to large number of
organic compounds
suwedo hadiwiyoto basic principles of HPLC - 1
Disadvantages
Does not work with
compounds that do not absorb
light at this wavelength region
Cannot be used with the
solvents having large
absorption in the UV region
Cannot be used for the sample
components which cannot be
absorbed in the UV region
17
Kromofor UV-HPLC
Kromofor UV-HPLC
 Detektor PDA
Mampu memberikan kumpulan kromatogram
secara simultan pada panjang gelombang yg
berbeda dlm sekali proses (single run)
Pada kromatogram dapat pula ditampilkan
spektrum UV shg dpt digunakan untuk
memilih maks utk sistem HPLC
Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan
ditampilkan sbg plot 3 dimensi (absorbansi,
panjang gelombang, dan waktu)
 Detektor Fluoresensi
Merupakan detektor yg paling peka, tetapi
hanya dapat dipakai untuk senyawa yg bisa
berfluorisensi, karena itu kadang2 solut
diubah menjadi turunan senyawa yg
berfluorisensi sebelum dikromatografi
Detektor UV vs Fluorescen

UV

Fluorescen

24 HPLC-2011
 Luminescence

Bagaimana terjadinya fluorescensi ???

Fluorescensi

25 HPLC-2011
Fluorescene detection
Compared to UV-VIS
detectors fluorescence
detectors offer a higher
sensitivity and selectivity excitation emission
that allows to quantify
and identify compounds
and impurities in complex Mobile phase
matrices to extremely low
concentration levels
(trace level analysis)
Fluorescence detectors
sense only those
substances that fluoresce
suwedo hadiwiyoto basic principles of HPLC - 1 26
 Detektor Indeks Bias
Indeks bias solut dan pelarut harus berbeda
Detektor mengukur perbedaan antara indeks
bias pelarut murni dan indeks bias pelarut yg
keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan
oleh adanya solut.
Detektor ini tidak dapat dipakai untuk pelarut
landaian karena indeks bias sistem berubah
selama kromatografi
Sangat sensitif terhadap perubahan suhu
Refractive index (RI) detection
The ability of a compound or
solvent to deflect light provides
a way to detect it
The RI is a measure of
molecules ability to deflect
light in a flowing mobile phase
in a flow cell relative to a static
mobile phase contained in a
reference flow cell
The amount of deflection is
proportional to concentration
The RI detector is considered to
be a universal detector but it is
not very sensitive

basic principles of HPLC - 1 28

 Detektor Elektrokimia
Detektor ini menggunakan sifat redoks solut
untuk mengukur kehadiran solut tersebut.
Memiliki kepekaan yg tinggi
Fase gerak harus polar dan mengandung
elektrolit pendukung
 Detektor Spektrometri Massa
Untuk identifikasi senyawa murni
GC-MS : terjadi pola fragmentasi
LC-MS : tdk terjadi pola fragmentasi
Data berupa berat molekul, terkadang
ditambah berat molekul pelarut
 Derivatisasi

Apa arti derivatisasi ?

Apa tujuannya ?
Bagaimana caranya ?
Derivatisasi Post-/Pre-column ?

HPLC-2011 31
 Tujuan Derivatisasi
Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa
dengan pereaksi (agen) penderivat untuk
menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs

Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa

dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-
kromofor senyawa berkromofor)

Meningkatkan daya deteksinya (senyawa

berkromofor UV senyawa berkromofor
fluorescensi)

32 HPLC-2011
 Syarat reaksi derivatisasi
1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap
baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa
berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan
spektrofluorometri;
2. Proses derivatisasi harus cepat dan
menghasilkan produk yang sebesar mungkin
(100 %);
3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama
proses derivatisasi dan deteksi;
4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak
menganggu pemisahan kromatografi.
 Captopril
HS CH3
O

N COOH

Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC

dengan detektor UV ?
34 HPLC-2011
 Derivatisasi dg p-Br fenacylbromide

HS CH3
O
O
N COOH + Br C-CH2-Br

E
t
i
Captopril l p -Br fenacylbromide
a
m
i
35
n HPLC-2011
 Hasil derivatisasi :
Captopril + p -Br Fenacylbromide

HS CH3
O
O O
N C-O-CH2-C Br

Dapat dideteksi secara UV

36 HPLC-2011
 Gabapentin
O
H2N C
OH

R-NH2

Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan detektor UV atau

Fluorescen ?

37 HPLC-2011
 Derivatisasi dg Dansilklorid

H3 C CH3 H3C CH3

N N

+ R-NH2

- HCl

O=S=O O=S=O

Cl NH

R
Dansil klorid
HPLC-2011 Fluorescent derivative 38
Contoh Senyawa
Asli
Yang
Berfluorescensi
Kunang-kunang

40 HPLC-2011
Fluorescensi

41 HPLC-2011
Asam Salisilat

O
C
OH

H
O
As.Salisilat - Fluorescensi

O
C
OH

H
O
 Papaverin HCl

H3CO

OCH3
N
H3CO .HCl
CH2 OCH3
 Riboflavin
OH OH OH
CH2-CH-CH-CH-CH2OH

H 3C N N O

NH
H3 C N
O
46 HPLC-2011
 Bentuk Kromatogram

Bentuk kromatogram (peak) ada berma-

cam-macam, a.l:
- tailing, fronting (leading)
- asimetri, simetri
- pecah
- lainnya

47 HPLC-2011
 Peak asymmetry - tailing

USP

HPLC-2011 48
 Peak Asymmetry vs Tailing

Baca:
Snyder dkk., 1997
HPLC-2011 49
 Kriteria Peak

HPLC-2011 50
 Pengatasan Peak Tailing
Tambahkan 30 mM:
- Trietilamin (utk seny. basa)
- Amonium asetat (utk seny. asam)

Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietil-

amin dengan:
10 mM dimetiloktilamin atau dimetiloktil-
amin asetat

Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g

Bagaimana mekanisme kerja
TEA mencegah tailing ?
51 HPLC-2011
 Tailing Senyawa Basa
Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam
kolom yang bersifat asam, akan berikatan kuat
dengan senyawa basa [ R-NH2 ] yang melewati
kolom tersebut.

Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin

modifier ke dalam campuran fase gerak, misal:
trietilamin [ TEA ].

TEA akan me-masking residu Si-OH, sehingga

saat senyawa basa melewati kolom tidak terjadi
ikatan yang terlalu kuat, hingga akhirnya dapat
memperkecil terjadinya tailing.
52 HPLC-2011
 Penggunaan TEA
Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak.
Bila terlalu banyak akan menghilangkan fungsi
residu silanol pada kolom RP-18.

Untuk hal tersebut, lakukan optimasi !

Perhatikan:
pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan

fase gerak yang mengandung TEA

53 HPLC-2011