Iman Rosyidin

KROMATOGRAFI
Kromatografi
 Adalah teknik pemisahan komponen-komponen dari
sebuah campuran yang didasarkan pada perbedaan
tingkat kepolaran, ukuran molekul , atau ionitas
dengan cara dilewati pada sebuah fase diam
menggunakan fase gerak.
 Dalam fase diam komponen-komponen akan terpisah.
 Diperkenalkan pertama kali oleh M. Tswett pada
tahun 1906, melalui pemisahan klorofil.
Kromatografi
Planar
 Fase diam berupa lapisan
tipis.
 Contoh: Kromatografi kertas
dan Kromatografi lapis tipis
Kolom
 Fase diam berupa kolom yang
telah dipacking dengan zat
adsorben seperti silika atau
alumina
 Contoh: Kromatografi kolom
dan KCKT
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
 Termasuk ke dalam kategori kromatografi kolom
 Telah dimodifikasi dengan menambahkan tekanan
laju alir pada fase gerak sehingga proses analisis
semakin cepat, bahkan kini telah terkomputerisasi.
 Daya pisah tinggi, peka, dan akurat
 Pilihan fase diam dan fase gerak sangat luas
 Banyak dipakai dalam skala industri
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kolom Fase Terbalik (Rp-18)
Kolom Fase Terbalik – 18 (RP-18)
 Kolom fase terbalik
 Permukaan Silika terikat dengan C18 (octadecylsilane)
 Bersifat non-polar
 Dapat digunakan untuk analisis bersifat organik
maupun anorganik
Kolom Fase Terbalik – 18 (RP-18)
Tabel : Volum kolom pada beberapa variasi kolom

Ukuran kolom (mm x mm) Volum kolom (ml)

250 x 4.6 2.5
150 x 1.5 1.5
150 x 3.0 0.64
150 x 2.1 0.28
50 x 4.6 0.50
30 x 4.6 0.30
15 x 4.6 0.15
Mengapa perlu dilakukan
pencucian dan regenerasi?
 Setiap sampel yang dianalisis tidak murni zat aktif,
melainkan terdapat matriks penyusun sampel itu
sendiri
 Garam, lipid, protein dan senyawa lainnya yang bukan
analit bisa menjadi kontaminan bagi kolom
 Jika terus disuntikkan,maka akan terjadi penumpukan
kontaminan di dalam kolom
 Akan berpengaruh pada kromatogram  hasil analisa
Apa yang terjadi?
 Kehilangan performa kolom
 Terjadinya tekanan balik yang tinggi
 Peak tailing, retention time-shift dan baseline drift
Pencucian
Fase Gerak (buffer:pelarut organik) Fase gerak (Air : pelarut organik)

 Air : pelarut organik  Fase gerak

(komposisi sesuai dengan  Air
fase gerak)
 Air : metanol/asetonitril(50:50)
 Air
 Air : metanol/asetonitril  Metanol/asetonitril
(50:50)
 Metanol / asetonitril

• Setiap fase dialiri sebanyak 20 x volum kolom dengan flow rate 1 ml/mnt
• Metanol dapat diganti dengan Acetonitril sesuai fase gerak yang dipakai
untuk analisa
• Semua Fase Gerak harus memakai pelarut Grade HPLC
Regenerasi
 Jika metode pencucian masih menunjukkan performa
kolom yang kurang baik
 Pencucian tingkat lanjut
 Menggunakan gradiasi kepolaran
 Waktu proses lama
 Regenerasi kolom

Pasang kolom dalam keadaan terbalik Buang sisa-sisa buffer dengan dialiri air

Aliri Diklorometan Aliri Isopropanol Aliri metanol

Aliri Hexane Aliri Diklorometan Aliri Isopropanol

Aliri Air : metanol Pasang kolom dalam keadaan normal

Aliri Fase gerak Cek performa dengan injek standar sampel

Tips Merawat Kolom
 Perhatikan Fase Gerak yang digunakan jika
komposisinya sebagian besar air.
 Gunakan pre-kolom untuk menghindari kontak
langsung dengan preserpatif yang mungkin ada.
 Selalu cuci kolom setelah dipakai,apalagi jika Fase
gerak mengandung buffer.
 Jika Fase gerak adalah buffer hendaknya mencuci
sesuai urutan.
 Jika kolom akan tidak digunakan dalam waktu lama,
maka simpan dalam keadaan air : metanol (50:50)
Kesimpulan
 Kromatografi merupakan ilmu yang sangat penting
dalam dunia penelitian
 Salah satu hasilnya adalah KCKT yang sekarang
banyak digunakan baik untuk penelitian maupun
komersil
 Kolom adalah jantung dari KCKT
 Pencucian dan Regenerasi perlu dilakukan untuk
merawat dan memperpanjang usia kolom
 Sehingga hasil analisis tetap pada performa yang
bagus