HPLC

Instrumentasi

FF-UNAIR 2016

Mochammad Yuwono
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
yuwono05@yahoo.com
 HPLC Instrumentation
1. Mobile Phase Supply System
2. Pump
3. Sample Injector
4. Column
5. Detector
6. Data System
Gradient
Controller
•
Pump Column
Detector
Injector
Mobile
Phases
 Instrumentation
HPLC Instrumentation
 Instrumentation
HPLC Instrumentation
Degasser

70 mbar

A A
B B
C C

Pump

A A B C
A B C

B
C

Eluent Gradient mixer Detector

Column
HPLC Instrumentation
Instrumen HPLC di Lab Unit Layanan Pengujian FF Unair
Instrumen HPLC di Lab Unit Layanan Pengujian FF Unair
HPLC instrument (di Lab Unit Layanan Pengujian FF Unair)
8
Lab Unit Layanan Pengujian FF Unair
9
 Fase Gerak

 Fase gerak
diletakkan dalam
botol-botol
reservoir.
 Fase Gerak

 Zat cair yang

digunakan sebagai
fase gerak harus
saling campur
 Pelarut yang
umum digunakan
pada RP-HPLC
 Air
 Asetonitril
 Metanol
 Tetrahidrofuran
 HPLC Mobile Phase

High solubility for the sample

components
Non corrosive to HPLC system
components
High purity, low cost, UV transparency
Others: low viscosity, low toxicity, non
flammability
 Kemurnian Fase gerak
Solvent UV Cutoff (nm)
Diperlukan solvent dengan
kemurnian tinggi Acetonitrile 190
Adanya pengotor Water 190
Cyclohexane 195
(impurities) pada solvent
Hexane 200
dapat menimbulkan Methanol 210
gangguan analisis. Ethanol 210
Gunakan HPLC grade Diethyl Ether 220
Air sebagai fase gerak: Dichloromethane 220
digunakan water for injection Chloroform 240
Carbon Tetrachloride 265
Tetrahydrofuran 280 (220)
Toluene 285

Panjang gelombang UV cutoff

Menunjukkan panjang gelombang terendah pada detektor UV
yang dapat digunakan untuk solven tersebut
 Pompa HPLC
 Fungsi Pompa
 Mengalirkan fasa gerak ke dalam sistem
 Mencampur fasa gerak
 Berdasar kan cara pencampuran:
 Low-pressure
 High-pressure
 Berdasar kan rentang alir:
 Pompa analitik 0.001 – 10 mL/menit
 Pompa preparatif 30 mL/menit – liter/menit
 Berdasarkan mekanisme pendorong:
 Mekanisme pendorong bolak-balik (reciprocating)
 Pompa syringe
 POMPA: Resiprocating Pump
Single Piston
Dual Piston
Outlet
Check Valve

Piston

Cam
Seal

Inlet
Check Valve
 PENYEBAB GANGGUAN POMPA
 Seal  aus, menyebabkan kebocoran fasa
gerak ke bagian belakang pompa
 Kontaminasi pada Check valve akibat partikulat
atau kotoran
 Gelembung udara yang berpengaruh
pembukaan dan penutupan check valve

Pengatasan:
• Ganti Seal secara berkala
• Cuci sistem sebelum dimatikan
• Lakukan Degassing Fase gerak
 HPLC, Mengapa perlu tekanan tinggi?
 Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing
kolom (silika) yang sangat kecil, umumnya 3-10um.
 Faktor C pada hukum van Deemter sebanding
dengan dp2
 Ukuran partikel makin kecil  luas permukaan
makin besar  transfer massa dari fase gerak ke
fase diam atau sebaliknya makin besar  kolom
semakin efisien dan resolusi peak semakin baik.
 Penggunaan ukuran partikel kecil  diperlukan
tekanan tinggi
 Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit, panjang
kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm
(1000 – 6000 psi)
Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)
Particle Size and Column Performance

(300 psi)
(1300 psi)
(10,000 psi)
(34,000 psi)
 HPLC vs UHPLC/UPLC

 UHPLC :Tekanan sangat tinggi

UHPLC menggunakan kolom dengan
ukuran partikel sangat kecil
(< 2µm)
waktu analisis sangat cepat dengan
resolusi yang tinggi
 Sample Injection

 6-port rotary valves

 Terdiri dari:
 Stator: bagian terfiksasi
 Rotor: seal internal
berotasi
 Dapat diputar pada 2 Load – Inject
posisi: Position

 Load
 Inject
 Sample Injection
 Load and Inject -Position
 INJEKTOR

Autosampler:
 Sampel dimasukkan dengan
syringe otomatis yg
mengambil sampel dari vial
pada rak bermotor
penggerak
HPLC Columns

Kolom:
Bagian
terpenting
dalam
pemisahan
 HPLC Column Categories
 Column Hardware: Standard or Cartridge,
stainless, titanium
 Chromatographic Modes: Normal-phase
(NPC), reversed-phase (RPC), ion-exchange
(IEC), size exclusion (SEC)
 Dimensions: Preparative, semi-prep,
analytical, fast LC, micro, nano
 Support Types: Silica, polymer, zirconia,
hybrid
 Column Dimension

Length x ID
Art.-Nr. xxxx HPLC-column 250x3 mm
Lichrospher 100 RP-18 5µm
Flow  Particle size in µm

Modification of silicagel

Pore size (Angstrom)

Producer of silica gel

Flow direction
Chromatography Stationary Phases

Silica Gel Derivatized Silica Gel

Where R = C18H37
hydrocarbon chain
(octadecylsilyl deriv.
silica or “C18”)

bulk (SiO2)x surface bulk (SiO2)x surface

relatively polar surface relatively nonpolar surface

“normal phase” “reversed phase”
 Bonded Phases

 C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3

•C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3

• C-18 Octadecyl Silyl -Si-(CH2)17-

CH3
•CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-CN
 Fasa Diam (USP)
Kelompok fase diam HPLC:
Berdasarkan sifat kimia rantai bonded phase :
 L1: C18 / octadecyl / ODS
 L7: C8 / octyl
 L8: NH2
 L9: SCX
 L10: CN
 L11: Phenyl
 L13: Trimethylsilyl/methyl/TMS
 L14: SAX
Fase Normal  Fase terbalik
 Residual Silanol
 Pada derivatisasi silika: Karena efek halangan
ruang, tidak semua gugus silanol mengalami
derivatisasi, sehingga masih ada gugus silanol
tersisa (Residual silanol)
 Residual silanols menyebabkan timbulnya
puncak yang berekor (tailing) khususnya untuk
analit asam dan basa
 Untuk menghilangkan residual silanol 
dilakukan proses “endcapping”
 penggunaan molekul rantai pendek
Contoh: RP-18 endcapped
RP-HPLC column endcapped

33
 Kolom HPLC
 Bentuk Partikel
 Spherical atau irregular
 Partikel spherical 
mengurangi tekanan dan kolom
lebih awet

 Ukuran Partikel
 Umumnya 3-10µm
 Makin kecil ukuran partikel,
makin tinggi efisiensi
 KARAKTERISTIK KOLOM HPLC

Carbon Load
 Amount of bonded phase attached to base material,
expressed as %C
 Higher carbon loads generally offer greater resolution
and longer run times.
 Low carbon loads shorten run times and many show a
different selectivity.
 Kolom HPLC

Ukuran Pori-pori
 Bervariasi antara 60-
10,000Å
 Makin besar pori-pori 
analit molekul besar
dapat tertahan lebih lama.
 Pilih  150Å untuk sampel
BM  2000.
 Kolom Monolitik

Batangan silika monolitik  Kecepatan alir dapat

ditingkatkan dengan resolusi yang baik
 Kolom Monolitik

Pori-pori besar  kecepatan alir dapat ditingkatkan 

waktu analisis makin cepat
 High Pure Silica
Spherical particles
 Almost no metal impurities (< 5 ppm)
 Excellent peak symmetry
 Extended stability: pH range 1.5 to 10.5

irregular

spherical

monolithic

40
 High Pure Silica

The Difference - Metal Content

Metal content in ppm

Sodium Calcium Magnesium Iron Aluminium

irregular 340-400 1300 160-220 20-25 15-20

Sperical 150-250 6-10 4-6 20-40 75-140

High Pure Silica 1 1 3 1

1
 HILIC

Hydrophylic Interaction Liquid Chromatography =

Hydrophylic Interaction Chromatography
Sometimes is called “Aqueous Normal Phase”

A Liquid chromatography technique

(Andy Alpert’s early work or sugars
on amino columns using H2O/ACN)

Similar to NP-HPLC
but with aqueous mobile phase
42

Retention of polar components 

separation of many types of
polar and hydrophilic compounds
 HPLC Detectors

To detect the separated analytes

An ideal Detector:
 UNIVERSAL (i.e. detects everything)
 SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of
analytes)
 LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between
intensity of response and amount of analyte).
 give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the
analyte is, even if you didn’t know beforehand).
 HPLC Detectors

UV-Vis Detector
Photodiode array Detector (PDA = DAD)
 Refractive Index Detector (RID)
 Fluorescence Detector (FLD)
 Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
 Electrochemical Detector (ECD)
 Conductivity Detector
 Radiometric Detector

Hyphenated Systems
 LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR
 HPLC Detectors
 UV-Vis
 Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105)
 Can be used with gradient elution
 Requires chromophore
 Refractive Index
 Poor detection limits (100-1000 ng; linear range 102)
 Isocratic only
 Nearly universal detection
 Evaporative Light Scattering
 Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105);
 Non-linear calibration required
 Can be used with gradient elution
 Nearly universal detection
 UV-Vis Detector
 Paling banyak digunakan
 Tersusun dari Lampu deuterium, monokromator dan
flow cell
 Monokromator terdiri dari grating atau prisma yang
dapat bergerak dan dapat memilih panjang
gelombang spesifik yang masuk melalui celah (slit)
 190 – 600nm
 Ditambah lampu tungsten untuk meningkatkan
sensitivitas pada daerah visibel.
 Macam UV-Vis:
 Fixed wave length
 Variable wave length
 Multiple variable wave length
 Photo diode-array
 UV-Vis Detector
Lamp Cut-off filter
Holmium oxide filter

Slit

Sample diode
Mirror 1

Grating

Flow cell

Mirror 2

Reference diode
 Photodiode array Detector (PDA)
Disebut juga diode
array detector (DAD)
Dapat menampilkan
spektra UV/Vis dari
puncak yang terelusi
Mampu melakukan
identifikasi puncak
 PDA
Dengan menggunakan software 
dapat menampilkan kromatogram dan
spektra serapan UV/Vis sampel
Dapat mengenali panjang gelombang
maksimum, peak matching
(menghitung match factor atau MF),
library search dan evaluasi kemurnian
peak (peak purity)
Dapat menampilkan 3-D spektra
Spektra 3D
 HPLC-DAD
 Spektra UV/Vis analit dan baku pembanding
 overlay 
Evaluasi korelasinya (r, MF)

 Kemurnian puncak 200 250 300 350 400 nm

 Pengukuran spektra pada “upslope,

apex dan down slope”
 dapat diketahui Peak “pure atau impure”
 Match Factor
MF = 1000  r = 1 100% pure peak
MF > 990  pure
MF < 900  impure
900 < MF < 950  contaminated
Pure and Impure HPLC peaks

53
Memilih Panjang Gelombang Detektor UV/PDA
Pemilihan
Panjang
Gelombang
(UV)

?
 Refractive index
 Mengukur perubahan indeks refraksi antara sel
sampel yang mengandung analit yang terelusi
dengan sel pembanding.
 Sensitivitas lebih rendah (0,01-0,1 ug)
 Dapat mendeteksi hampir semua senyawa dan
digunakan umumnya untuk analit yang memiliki
gugus kromofor lemah seperti gula, trigliserida,
asam-asam organik dll.
 Detektor standar untuk GPC
 Tidak dapat digunakan untuk gradien
Refractive Index Detector
Evaporative Light Scattering Detector
Terima Kasih!