HPLC – PDA

M. H. A
 outline
• Prinsip dasar analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi
• Desain instrumen, mekanisme kerja, dan fungsi masing-
masing bagian dalam kromatografi cair kinerja tinggi
• Kualifikasi kinerja instrumen
• Teknik preparasi sampel
• Prinsip deteksi ketidakmurnian dengan KCKT-PDA
• Teknik derivatisasi dalam kromatografi cair kinerja tinggi
 HPLC
• Kata kromatogrfi berasal dari bahasa Greek yaitu
Chromato dan grafe yaitu penulisan dengan warna
(writing with colors).
• Prinsip: kromatografi merupakan cara pemisahan yang
mendasarkan pada partisi cuplikan antara fase bergerak
(mobile phase) dan fase diam (stationary phase).
 Kromatografi

Fase bergerak Fase bergerak

gas cairan

Kromatografi gas Kromatografi

(GC) cairan (LC)

Fase diam Fase diam Fase diam

Fase diam
cairan, cairan, padatan,
padatan,
krom.caira krom.cairan- krom.padata
krom.padata
n-gas cairan n-cairan
n-gas (GSC)
(GLC) (LLC), (LSC),
contoh contoh KLT
kromat.kert Gel
Krom.penukarasion filtration
Krom. eksklusi Gel
 Proses sorpsi
Sorpsi: adl perpindahan solut dari fase gerak ke
fase diam.
Desorpsi: perpindahan solut dari fase diam ke
fase gerak.
Sorpsi dan desorpsi terjadi terus menerus
selama pemisahan kromatografi, sistem
kromatografi berada dalam kesetimbangan
dinamis.
Klasifikasi HPLC/KROMATOGRAFI Berdasarkan
Mekanisme
• Kromatografi adsorpsi (adsorption
chromatography)
• Kromatografi Partisi (partition chromatography)
• Kromatografi Pertukaran ion (ion exchange
Chromatography)
• Size exclusion chromatography (SEC)
• Kromatografi Permeasi Gel
• Kromatografi Filtrasi Gel
 Keunggulan dan Kelemahan HPLC
Keunggulan Kelemahan
• Dilakukan pada suhu • Sulit ditemukan detektor
kamar yang universal
• Analisis kuantitatif yang • Efisiensi pemisahan lebih
cepat dengan presisi dan rendah daripada GC
akurasi yang tinggi • Lebih rumit dalam
pelaksanaannya
• Dapat dioperasikan
• Lebih mahal
secara otomatis
• Sensitivitas detektor yang
tinggi
• Dapat diaplikasikan untuk
berbagai analit dalam
jenis sampel yang lebih
luas
HPLC Instrumentation

Gradien
t
Controll •
er Column
Pump
Detector
Injector
Mobile
Phases
 Instrumentation
Degasser

70 mbar

A A
B B
C C

Pump

A A B C
A B C

B
C

Eluent Gradient mixer Detector

Column
 Fase Gerak
• Fase gerak
diletakkan dalam
botol-botol
reservoir.
Fase Gerak
• Zat cair yang
digunakan sebagai
fase gerak harus
saling campur.
 HPLC Mobile Phase
• High solubility for the sample components
• Non corrosive to HPLC system components
• High purity, low cost, UV transparency
• Others: low viscosity, low toxicity, non
flammability
 Reversed-phase mobile
• Water phases
• Methanol
• Acetonitrile
• THF
• Additives, salts, acids, bases
 Kemurnian Fase gerak
Solvent UV Cutoff (nm)
• Diperlukan solvent
dengan kemurnian tinggi Acetonitrile 190
Water 190
• Adanya pengotor Cyclohexane 195
(impurities) pada solvent Hexane 200
dapat menimbulkan Methanol 210
gangguan analisis. Ethanol 210
Diethyl Ether 220
• Gunakan HPLC grade Dichloromethane 220
• Air sebagai fase gerak: Chloroform 240
digunakan water for Carbon Tetrachloride 265
injection Tetrahydrofuran 280 (220)
Toluene 285

Panjang gelombang UV cutoff

Menunjukkan panjang gelombang terendah pada
detektor UV yang dapat digunakan untuk solven
 Isocratic and Gradient
Elution
Isokratik (Isocratic elution):
Kompoisis fase gerak tetap selama analisis
Contoh: Metanol-air = 60:40

Gradien (Gradient elution):

Komposisi fase gerak berubah (secara
bertahap atau kontinyu selama analisis
 Gradient Analysis
Advantages:
• Better suited for complex samples
• Better resolution of early and late eluting peaks
• Better sensitivity of late eluting peaks
• Higher peak capacity (fit more peaks in the
chromatogram)
Disadvantages
• More complex HPLC instrument
• Method development, implementation and transfer
are more difficult
• Typically longer analysis times since column must be
calibrated with initial mobile phase
 Degasser
• Menghilangkan udara (gas nitrogen dan oksigen) yang terlarut.
• Adanya udara dapat menimbulkan variasi tekanan pada pompa
atau timbulnys noise pada detektor tertentu (RID, FLD dan
Amperometric Detector)
• Cara: vacuum degassing, pengaliran gas helium atau
ultrasonikasi.
 Pompa HPLC
• Fungsi Pompa
• Mengalirkan fasa gerak ke dalam sistem
• Mencampur fasa gerak
• Berdasarkan cara pencampuran:
• Low-pressure
• High-pressure
• Berdasarkan rentang alir:
• Pompa analitik 0.001 – 10 mL/menit
• Pompa preparatif 30 mL/menit – liter/menit
• Berdasarkan mekanisme pendorong:
• Mekanisme pendorong bolak-balik (reciprocating)
• Pompa syringe
 POMPA: Resiprocating
Single Piston
Pump Dual Piston
Outlet
Check Valve

Piston

Cam
Seal

Inlet
Check Valve
 PENYEBAB GANGGUAN
POMPA
 Seal  aus, menyebabkan kebocoran fasa
gerak ke bagian belakang pompa
 Kontaminasi pada Check valve akibat
partikulat atau kotoran
 Gelembung udara yang berpengaruh
pembukaan dan penutupan check valve

Pengatasan:
• Ganti Seal secara berkala
• Cuci sistem sebelum dimatikan
• Lakukan Degassing Fase gerak
 HPLC, Mengapa perlu tekanan
tinggi?
• Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing
kolom (silika) yang sangat kecil, umumnya 3-
10um.
• Faktor C pada hukum van Deemter sebanding
dengan dp2
• Ukuran partikel makin kecil  luas permukaan
makin besar  transfer massa dari fase gerak ke
fase diam atau sebaliknya makin besar  kolom
semakin efisien dan resolusi peak semakin baik.
• Penggunaan ukuran partikel kecil  diperlukan
tekanan tinggi
• Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit,
panjang kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-
Macam injector
 Injector dg diafragma (Septum injector)
 Injector tanpa diafragma (Septumless injection system)
 Injector dengan pipa dosis (loop valve)
 Sistem injeksi otomatis (autoinjector)
 Sample Injection
• Load and Inject -Position

Load –
Inject
Position
 Sample Injection
• Load and Inject
-Position
 loop valve
 Merupakan pilihan tepat terutama utk analisis kuantitatif
 Fase normal dan Fase terbalik

 Normal Phase (Fase normal)

 Fase diam polar dan fase gerak non polar
 Contoh Fase gerak: Chloroform, heksana dll.

• Reversed Phase (Fase terbalik)

• Fase diam non polar dan fase gerak polar
• Contoh fase gerak: air, metanol, asetonitril dll.
 Kromatografi Fase Normal
• Disebut juga kromatografi cair-
padat atau kromatografi adsorpsi
(adsorption chromatography)
• Pemisahan didasarkan atas
adsorpsi/desorpsi analit pada fase
diam polar (silika atau alumina)
• Analit polar lebih tertahan
daripada analit non polar karena
gugus silanol pada silika.
 Kromatografi Fase terbalik
• Pemisahan didasarkan atas
koefisien partisi analit dalam fase
diam dan fase gerak
• Urutan elusi: analit polar terelusi
lebih dahulu, analit non plar
terelusi terakhir
• Cocok untuk analisis zat-zat yang
larut dalam air, semipolar atau
beberapa senyawa non polar.
• Untuk analit berupa ion dapat
dianalisis dengan RP-HPLC
menggunakan dapar dan teknik
pasangan ion (ion-pair).
 Reversed-phase mobile phases
• Water
• Methanol
• Acetonitrile
• THF
• Additives, salts, acids, bases
• Ion pairing
 Ion Exchange
Chromatography
• Pemisahan didasarkan
atas pertukaran ion analit
dengan ion dari gugus
fungsi bahan pendukung
padat fase diam
• Contoh Fase diam:
senyawa sulfonate
(penukar kation);
ammonium kuarterner
(penukar anion)
• Fase gerak: dapar
• Aplikasi: analisis ion,
asam-asam amino,
protein/peptida,
 Size Exclusion Chromatography
• Untuk pemisahan
makromolekul (BM >
10000).
• Disebut GFC jika digunakan
untuk pemisahan molekul
biologis yang larut air
• Disebut GPC jika digunakan
untuk penentuan Bobot
molekul suatu polimer
organik. Fase gerak
umumnya toluen dan
tetrahidrofuran.
HPLC Columns

Kolom:
Bagian
terpenting
dalam
pemisahan
 Column Dimension

Length x ID
Art.-Nr. xxxx HPLC-column 250x3 mm
Lichrospher 100 RP-18 5µm
Flow  Particle size in µm

Modification of silicagel

Pore size (Angstrom)

Producer of silica gel

Flow direction
 Chromatography Stationary
Phases
Silica Gel Derivatized Silica Gel

O O O O O O
| | | | | |
OSiOSiOSiOH OSiOSiOSiOR
| | | | | | Where R = C18H37
O O O O O O
| | | | | | hydrocarbon chain
OSiOSiOSiOH OSiOSiOSiOR
| | |
(octadecylsilyl deriv.
| | |
O O O O O O silica or “C18”)
bulk (SiO2)x surface bulk (SiO2)x surface

relatively polar surface relatively nonpolar surface

“normal phase” “reversed phase”
 Bonded Phases

• C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3

•C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3

• C-18 Octadecyl Silyl -Si-

(CH2)17-CH3
•CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-
CN
Fase Normal  Fase
terbalik
 Residual Silanol
• Pada derivatisasi silika: Karena efek halangan ruang,
tidak semua gugus silanol mengalami derivatisasi,
sehingga masih ada gugus silanol tersisa (Residual
silanol)
• Residual silanols menyebabkan timbulnya puncak
yang berekor (tailing) khususnya untuk analit asam
dan basa
• Untuk menghilangkan residual silanol  dilakukan
proses “endcapping”
• penggunaan molekul rantai pendek
• Contoh: RP-18 endcapped
RP-HPLC column endcapped
 Kolom HPLC
• Bentuk Partikel
• Spherical atau irregular
• Partikel spherical 
mengurangi tekanan dan
kolom lebih awet

• Ukuran Partikel
• Umumnya 3-10µm
• Makin kecil ukuran
partikel, makin tinggi
efisiensi
 Kolom HPLC
•Ukuran Pori-pori
• Bervariasi antara 60-10,000Å
• Makin besar pori-pori  analit
molekul besar dapat tertahan
lebih lama.
• Pilih  150Å untuk sampel BM 
2000.
 Kolom Monolitik

Batangan silika monolitik  Kecepatan alir dapat ditingkatkan

dengan resolusi yang baik
 Kolom Monolitik

Pori-pori besar  kecepatan alir dapat ditingkatkan  waktu

analisis makin cepat
 HILIC
Hydrophylic Interaction Liquid Chromatography =
Hydrophylic Interaction Chromatography
Sometimes is called “Aqueous Normal Phase”

A Liquid chromatography technique

HILIC
(Andy Alpert’s early work or sugars
on amino columns using H2O/ACN)

Similar to NP-HPLC
but with aqueous mobile phase
46

Retention of polar components 

separation of many types of
polar and hydrophilic compounds
 HPLC vs UHPLC/UPLC

• UHPLC/UPLC menggunakan kolom dengan

ukuran partikel sangat kecil
(< 2µm)
• waktu analisis sangat cepat dengan resolusi
yang tinggi
Pemisahan Kromatografi Cair
 Separation
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

High Performance Liquid Chromatograph

 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
Mobile Phases

Flow Rate
Composition

Injection Volume
Column
Oven Temperature
Wavelength
Time Constant
 HPLC Detectors
• UV-Vis Detector
• Photodiode array Detector (PDA = DAD)
• Refractive Index Detector (RID)
• Fluorescence Detector (FLD)
• Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
• Electrochemical Detector (ECD)
• Conductivity Detector
• Radiometric Detector
Hyphenated Systems
• LC-MS;
• LC-MS/MS; LC-NMR
 Photodiode array Detector
• Disebut juga diode array(PDA)
detector (DAD)
• Dapat menampilkan
spektra UV/Vis dari
puncak yang terelusi
• Mampu melakukan
identifikasi puncak
 PDA
• Dengan menggunakan software  dapat
menampilkan kromatogram dan spektra serapan
UV/Vis sampel
• Dapat mengenali panjang gelombang maksimum,
peak matching (menghitung match factor atau
MF), library search dan evaluasi kemurnian peak
(peak purity)
• Dapat menampilkan 3-D spektra
Spektra 3D
 HPLC-DAD
• Spektra UV/Vis analit dan baku
pembanding  overlay 
Evaluasi korelasinya (r, MF)

• Kemurnian puncak 200 250 300 350 400 nm

• Pengukuran spektra pada “upslope,

apex dan down slope”
• dapat diketahui Peak “pure atau impure”
 Match Factor
• MF = 1000  r = 1 100% pure peak
• MF > 990  pure
• MF < 900  impure
• 900 < MF < 950  contaminated
Pure and Impure HPLC peaks
Memilih Panjang Gelombang Detektor
UV/PDA
 Kondisi Analisis
• Kondisis analisis adalah semua hal pada suatu metode
analisis yang bisa kita kontrol
HPLC Spektrofotometry
Pelarut (solvent) Pelarut (solvent)
Panjang gelombang Pengamatan Panjang gelombang Pengamatan
Fase diam (stationary phase) Jenis kuvet
Fase Gerak (Eluent)
Suhu (jika ada thermostat)
Kecepatan aliran (Flow rate)
 Efisiensi kromatogram
• Jarak Setara Plate Teori (HETP) = paling kecil
• Resolusi (Rs)= >1,5
• Lempeng teoritis/ Teoritical Plate (N)>2000
• Waktu tambat (RT) paling kecil
• Capacity Factor (K’) paling Kecil
HPLC/LC -MS
M.H.A
 OUTLINE

 Prinsip dasar analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi dengan detektor spektrometri massa
 Desain instrumen, mekanisme kerja, dan fungsi masing-masing bagian dalam kromatografi cair kinerja tinggi-
spektrometri massa
 Kualifikasi kinerja instrument Prinsip analisis kuantitatif dengan KCKT-spektrometri massa atmospheric pressure
chemical ionization dengan triple quadrupole
 Sumber ion

 Ionisasi elektrospray (ESI)

 Ionisasi nanoelektrospray (nanoESI)
 Ionisasi kimia tekanan atmosfer (APCI)
 Fotoionisasi tekanan atmosfer (APPI)
 Matrik dibantu laser desorpsi/ionisasi (MALDI)
 Desorpsi/ionisasi pada silikon (DIOS)
 Atom cepat/ion pemboman (FAB)
 Ionisasi elektron (EI)
 Ionisasi kimia (CI)
ESI menghasilkan molekul gas terionisasi langsung dari larutan cair yang menghasilkan semprotan tetesan
(droplet) dalam medan listrik. Sampel larutan disemprotkan dari daerah medan listrik yang kuat di ujung jarum
logam yang dipertahankan pada potensial 700 V sampai 5000 V. Jarum berfungsi untuk membuat larutan menjadi
droplet saat disemprotkan. Gas kering dan panas, atau keduanya diterapkan pada droplet pada tekanan atmosfer
sehingga menyebabkan pelarut menguap dari setiap droplet. Sebagai ukuran menurunnya tetesan droplet dilihat
dari densitas muatan pada permukaannya yang meningkat
 Keuntungan Kekurangan
 Rentang massa praktis hingga 70.000  Adanya garam-garam dan agen pasangan
Da ion seperti TFA dapat mengurangi
snsitifitas
 Sensifitas yang baik dengan femtomol  Campuran kompleks dapat mengurangi
untuk sensitifitas pikomol tipikal sensitifitas
rendah
 Metode ionisasi paling lembut, mampu  Analisis campuran simultan bisa menjadi
menghasilkan kompleks nonkovalen rendah
dalam fase gas
 Mudah beradaptasi dengan  Beberapa pengisian dapat membingungkan
kromatografi cair terutama dalam analisis campuran
 Mudah beradaptasi dengan tandem  Kemurnian sampel sangat penting
analisis massa seperti perangkap ion
dan instrument quadrupole tiga
 Beberapa pengisian memungkinkan  Carryover dari sampel ke sampel
untuk analisis ion massa yang tinggi
dengan kisaran instrument m/z relatif
rendah
 Tidak ada gangguan matrik  
 Ionisasi kimia tekanan atmosfer (APCI)
APCI menjadi sumber ionisasi penting karena menghasilkan ion langsung dari larutan dan mampu
menganalisis senyawa yang relatif nonpolar. eluen cair dari APCI dimasukkan langsung ke sumber ionisasi, tetapi
droplet tidak bermuatan dan sumber APCI berisi pemanas uap dapat mempercepat desolvasi/penguapan dari
tetesan. Molekul sampel menguap dalam wilayah reaksi molekul ion pada tekanan atmosfer.
 Fotoionisasi tekanan atmosfer (APPI)
Fotoionisasi tekanan atmosfer (APPI) menjadi sumber ionisasi penting karena menghasilkan ion langsung dari
larutan dengan latar belakang relatif rendah dan mampu menganalisis senyawa yang relatif nonpolar. Sama dengan
APCI, efluen cair dari APPI dimasukkan langsung ke sumber ionisasi.
Perbedaan utama antara APCI dan APPI yaitu pada APPI sampel menguap melewati sinar ultra-violet (sumber
cahaya kripton dipancarkan pada 10,0 eV dan 10,6 eV). APPI lebih sensitif dibandingkan dengan ESI atau APCI,
sebab memiliki rasio sinyal kebisingan yang lebih rendah karena ionisasi latar belakang. Sinyal latar belakang yang
lebih rendah disebabkan tingginya potensial ionisasi pelarut standar seperti metanol dan air (masing-masing, IP
10.85 dan 12.62 eV) yang tidak terionisasi oleh lampu kripton
 Analisis Massa

 Quadrupole Analisis Massa

 TOF (Time of Flight) Analisis Massa
 Quadrupole Ion Perangkap Analisis Massa
 Ion Cyclotron Resonance (ICR)
Quadrupole adalah analisis massa yang menggunakan medan listrik untuk memisahkan ion. Quadrupole terdiri atas 4
batang/tiang yang paralel, di mana batang yang berdekatan memiliki polaritas tegangan yang berlawanan. Tegangan
yang diterapkan pada setiap batang adalah penjumlahan dari tegangan konstan DC (U) dan frekuensi radio yang
bervariasi (Vrfcos (wt)), dimana w adalah frekuensi sudut dari bidang frekuensi radio. Gaya listrik pada ion
menyebabkan ion berosilasi/orbit di daerah antara 4 batang, di mana jari-jari orbit tetap konstan
 Pergerakan ion dalam gerakan yang sangat kompleks berbanding lurus dengan
massa ion, tegangan pada quadrupole, dan frekuensi radio. Ion-ion akan tetap
mengorbit di daerah antara kutub tanpa terjemahan sepanjang kutub kecuali ion
memiliki kecepatan konstan yang dibuat sebagai ion yang memasuki quadrupole
tersebut. Sebelum memasuki analisis, ion melewati potensi tegangan tertentu
(biasanya dibuat oleh elektroda cincin) untuk memberikan ion kecepatan konstan
sehingga dapat melintang di sepanjang pusat quadrupole tersebut.Sementara di
quadrupole, lintasan ion berubah sedikit berdasarkan massanya. Ion massa tertentu
memiliki frekuensi tertentu dimana semakin besar massa, semakin besar
frekuensinya.
triple
quadrupole
TERIMA KASIH