LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA PEMISAHAN

“ANALISA TABLET VITAMIN C DENGAN HPLC”

KELOMPOK 1

NAMA ANGGOTA:

IRFAN FAUZI (1811012210008)

NADILA AGUSTINA (1811012320012)
NASRULLAH HAMDANI (1811012110001)
NOVIA HARIANI (1811012220001)
VERONIKA LASMAIDA PANJAITAN (1811012120003)

PROGRAM STUDI S-1 KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT

BANJARBARU

2021
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Prinsip Percobaan

Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan
direkam dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah
komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran. Pada dasarnya HPLC merupakan perkembangan dari metode
kromatografi kolom (Kusuma, 2016).
1.2 Tujuan Percobaan
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk melakukan analisis kadar vitamin c
menggunakan HPLC.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

HPLC (High Performance Liquid Chromatographi) merupakan metode

yang tidak dekstruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun
kuantitatif serta memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi. Metode
HPLC memiliki sensitivitas lebih tinggi dibanding dengan menggunakan alat
spektrofotometer UV-Vis (Dipahaya & Permatasari, 2019). Metode ini
mempunyai beberapa keuntungan antara lain dapat digunakan pada senyawa
dengan bobot molekul besar dan dapat dipakai untuk senyawa yang tidak tahan
panas (Ratnayani & Gitadewi). Dianggap lebih akurat antara teknik kromatografi,
metode HPLC jauh lebih sering digunakan dari pada kromatografi gas (Klimczak
& Swigio, 2015). Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas wadah fase
gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom detektor,
wadah penampung buangan fase gerak dan suatu komputer atau integrator atau
perekam (Underwood, 2002).
Vitamin merupakan senyawa kompleks yang sangat dibutuhkan oleh tubuh
yang berfungsi untuk membantu pengaturan atau proses metabolisme tubuh. Salah
satu vitamin yang diperlukan oleh tubuh adalah vitamin C. Vitamin C berperan
dalam pembentukan kolagen interseluler1. Vitamin C atau asam askorbat adalah
salah satu vitamin yang terbuat dari turunan heksosa yang larut dalam air dan
mudah teroksidasi. Proses tersebut dipercepat oleh panas, sinar, alkali, enzim serta
oleh katalis tembaga dan besi. Disamping itu, asam askorbat memiliki gugus
kromofor yang peka terhadap rangsangan cahaya (Badriyah et al, 2015). Vitamin
C merupakan senyawa yang memiliki beragam manfaat bagi manusia, antara lain
berperan dalam menghambat pembentukan senyawa karsinogenik, stimulan untuk
sintesis kolagen, menghambat penuaan, antioksidan, dan berperan dalam imunitas
tubuh terhadap penyakit berbahaya seperti kanker, penyakit jantung, dan penyakit
lainnya [5]. vitamin C mudah sekali teroksidasi akibat pengaruh suhu maupun
logam berat, reaktif dialam dan berinteraksi dengan komponen makanan lainnya
sehingga menyebabkan manfaat vitamin C menjadi berkurang (Hudiyanti et al,
2017).
 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN

1. Alat & Bahan

a. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah :
 Neraca analitik
 Set HPLC
 Kolom C18 dengan panjang 25 cm
 Labu ukur
 Ultrasonik
 Membran filter 0,2 mikron
 Mortar alu
 Pipet volume
 Pipet ukur
 pH meter
 Propipet
 Botol wadah fasa gerak
 Gelas beker

b. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah :
 Sampel Obat Bodrex
 Akuabides
 Standar kafein
 Standar paracetamol
 Metanol pa
 Asam asetat glasial
 NaOH
3.2 Prosedur Kerja
Tahap 1
A. Pembuatan Larutan Baku Induk Campuran (Parasetamol = 1000 ppm,
Kafein = 100 ppm)

Standar Kafein

 Ditimbang sebanyak 25 mg
 Dimasukkan ke dalam labu ukur
 Dilarutkan dengan pelarut metanol p.a
(ditambahkan 5 mL terlebih dahulu)
 Dilakukan ultrasonik sampai benar-benar
larut
 Ditambahkan lagi 5 mL pelarut metanol p.a
(2500 ppm)

Larutan A

Standar Parasetamol
 Ditimbang sebanyak 25 mg
 Dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL
 Dilarutkan dengan methanol p.a kira-kira
10 mL
1 mL larutan A
 Ditambahkan
Metanol p.a
 Ditambahkan sampai tanda batas
 Dikocok sampai homogen

Hasil
. Pembuatan Larutan Baku Kerja Campuran

Larutan Baku Induk Campuran

 Dibuat sebanyak 2 buah (larutan baku
induk pertama untuk pengenceran standar 1
& 2, sedangkan larutan baku induk kedua
untuk pengenceran standar 3, 4 & 5)
 Dipipet masing-masing 1, 2, 3, 4, dan 5 mL
larutan baku induk campuran yang sudah
dibuat terlebih dahulu tadi
 Dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL
Metanol p.a
 Ditambahkan ke dalam masing-masing labu
takar sampai tanda batas
 Disaring masing-masing larutan baku
dengan membran filter 0,2 mikron

Hasil

C. Preparasi Sampel

Tabel Obat Bodrex

 Ditimbang 10 sampel tablet secara seksama
 Dicatat berat masing-masing sampel
 Ditentukan rata-rata dan RSDnya
 Digerus tablet menggunakan mortar
 Ditimbang secara seksama sejumlah sampel
sehingga mengandung parasetamol 50 mg
dan kafein 5 mg
 Dilakukan penimbangan sampel sampai
tiga kali replikasi
 Ditambahkan metanol ± 10 mL

A
 A
 Dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL
 Dilakukan ultrasonikasi selama 10 menit
Metanol p.a
 Ditambahkan sampai tanda batas
 Diambil 1 mL larutan sampel dan
masukkan ke dalam labu ukur 10 mL
 Dilakukan pengenceran
 Dibilas terlebih dahulu pipet volume
dengan setiap larutan yang akan digunakan

Metanol p.a
 Ditambahkan sampai tanda batas
 Disaring sampel dengan membran filter 0,2
mikron sebelum dianalisis

Hasil

Tahap 2
A. Pembuatan Fase Gerak atau Eluen

Aquabides : Metanol : Asam asetat glasial (138 : 56 : 6)

 Dilakukan pembuatan eluen dilemari asam

 Diambil aquabides dan metanol dengan
labu ukur, sedangkan asam asetat glasial
dengan pipet ukur
 Dicek pH eleun menggunakan pH meter
NaOH
 Ditambahkan beberapa tetes sampai pH
mencapai 3,35
 Disaring eluen menggunakan membran
nilon 0,2 mikrometeer

Hasil
 B. Kesetimbangan Fase Gerak dan Fase Diam

HPLC

 Dinyalakan pompa
 Dilakukan purging(dihilangkan gelembung udara pada saluran
eluen)
 Dimasukan selang eluen ke dalam botol berisi eluen
 Dialirkan eluen supaya mengisi saluran eluen
 Diatur kondisi laju alir 1 mL/menit
 Diatur panjang gelombang 275 nm
 Diatur waktu analisis 15 menit untuk satu kali injek
 Dicek kembali kondisi HPLC
 Dipastikan detektor menyala
 Dibiarkan terjadi kesetimbangan fasa diam dan fasa gerak
sampai didapat respon stabil yang ditandai dengan
kromatogram yang lurus dan tidak ada puncak.

Hasil

Tahap 3
a. Analisis HPLC
HPLC

 Diatur kondisi HPLC

 Diatur kondisi analisis kuantitatif meliputi panjang gelombang,
panjang kolom
 Diatur kondisi penyuntikan larutan standar dan larutan sampel
 Dilakukan baseline kurang lebih 15 menit (kolom dialiri eluen
agar jenuh)
 Dilakukan injek larutan menggunakan syringe
 Dilakukan injek larutan setiap 15 menit
 Dilakukan report hasil analisis

A
 A

 Diperoleh data berupa kromatogram, tabel kuantitatif hasil

pengukuran HPLC yang berisi retention time, area,
konsentrasi larutan sampel (ppm), tailing factor, resolusi,
HETP, k dan teoritical plate.

Hasil

b. Pencucian Kolom
Kolom

 Dicuci dengan akuabides selama 1 jam

 Dicuci dengan metanol selama 30 menit sampai 1 jam
agar tidak berjamur

Hasil
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Data Pengamatan

a. Preparasi Larutan Standar
Prosedur Hasil Pengamatan

1. Kofein ditimbang 25 mg, dilarutkan Cairan tidak berwarna

dalam metanol p.a sampai 10 ml.
2. Parasetamol p.a ditimbang kira-kira Cairan tidak berwarna
25 mL, masukkan ke dalam labu ukur
25 mL dilarutkan dalam metanol p.a
kira-kira 10 ml, ditambah 1 ml larutan
(a) kemudian ditambah metanol p.a
sampai tepat tanda
b. Pembuatan Larutan Baku Kerja Campuran
Prosedur Hasil Pengamatan

1. Masing-masing dipipet 1,0; 2,0; 3,0; Cairan tidak berwarna

4,0; dan 5,0 mL larutan baku induk
campuran, masukkan ke dalam labu
takar 10 mL
2. Tambahkan ke dalam masing-masing
labu takar metanol p.a sampai tanda
3. Masing-masing larutan baku disaring
dengan membran filter 0,2 mikron

c. Preparasi sampel

Prosedur Hasil Pengamatan

1. 10 sampel tablet ditimbang secara Rata-rata berat penimbangan
seksama, ditentukan rata-rata dan sampel= 0,84016 g
RSDnya
2. Tablet digerus dan ditimbang secara
seksama sejumlah tertentu sehingga
mengandung parasetamol 50 mg dan
 kofein 5 mg (replikasi 3x)
3. Tambahkan metanol ± 10 mL
masukkan dalam labu ukur 25 ml dan
ultrasonikasi selama 10 menit Diultrasonikasi agar homogen
4. Setelah dingin tambahkan metanol
sampai tanda
5. Ambil 1,0 ml larutan sampel dan
masukkan ke dalam labu ukur 10 ml,
tambahkan metanol sampai tanda
6. Sebelum dianalisis, sampel disaring
dengan membran filter 0,2 mikron
d. Pembuatan Fase Gerak (eluen)

Prosedur Hasil Pengamatan

1. Pembuatan eluen di lemari asam, Cairan tidak berwarna
komposisi eluen aquabides: metanol:
asam asetat glasial (138: 56: 6)
2. Cek pH eluen di buat 3,35 dengan
penambahan NaOH
3. Eluen disaring menggunakan
membran nilon 0,2 mikrometer
e. Kesetimbangan Fase Diam dan Fase Gerak

Prosedur Hasil Pengamatan

1. Buka sofware atur kondisi HPLC
2. Atur kondisi HPLC laju alir 1 ml/menit
panjang gelombang 275 nm waktu
analisis 15 menit
3. Ricek ulang kondisi HPLC pastikan
detektor menyala
4. Simpan kondisi HPLC yang sudah diatur
5. Download ke alat HPLC kemudian
pompa eluen bisa dijalankan biarkan
terjadi kesetimbangan fase diam dan fase
gerak
 f. Analisis Menggunakan HPLC

Prosedur Hasil Pengamatan

1. Atur kondisi HPLC
2. Atur kondisi analisis kuantitatif
3. Atur kondisi penyuntikan
4. Report hasil analisis

Tabel 1. Penimbangan Tablet Obat Bodrex

No. Berat Setiap 1 Tablet Obat Bodrex
1. 0,8321 g
2. 0,8530 g
3. 0,8407 g
4. 0,8326 g
5. 0,8350 g
6. 0,8315 g
7. 0,8418 g
8. 0,8568 g
9. 0,8321 g
10. 0,8427 g
Rata-rata 0,84016 g

Tabel 2. Sampel Obat

Diduga zat yang terkandung Waktu Retensi Luas Area

(menit)
Paracetamol 2.38 11705288
Kafein 3.62 2164128

Tabel 3. Deret Standar Paracetamol

Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)
50 2252106 2.38
100 4239085 2.38
150 6208253 2.38
200 7979072 2.38
250 10093086 2.39
300 12261550 2.38

Tabel 4. Deret Standar Kafein

Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)
25 2164416 3.64
50 4252400 3.62
75 6242196 3.6
100 7989484 3.58
 125 10033548 3.59
150 12097707 3.56

a. Pembahasan
Prinsip dari percobaan ini yaitu pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, sehingga sampel akan terpisah berdasarkan sifat kepolarannya
masing masing komponen dalam sampel. Jika kepolaran mirip dengan fase diam
maka dia akan tertinggal difase diam/bergerak lebih lambat dan jika kepolarannya
lebih mirip dengan fase gerak maka akan terdistribusi lebih jauh dan cepat. HPLC
merupakan metode didekstruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif maupun kuantitatif serta memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang
tinggi. Karakteristik vitamin C adalah sangat mudah teroksidasi oleh panas,
cahaya dan logam. Vitamin C mudah larut dalam air. Bila suatu senyawa telah
teroksidasi maka senyawa kimia tersebut tidak dapat lagi memiliki efektifitas
sebagai antioksidan (Dipahayu & Permatasari, 2019).

Perhitungan
a. Massa Paracetamol
Diketahui: y = 39646 x + 234188
Luas area paracetamol = 11705288

Bobot sampel = 4,1 mg

Berat Rata-rata penimbangan paracetamol = 840,16 mg

Ditanya : massa paracetamol?

Jawab:
y = 39646 x + 234188 Sehingga,
y = 39646 x + 234188
11705288 = 39646 x + 234188
11705288 - 234188
x =
39646
x = 289,3381 ppm

mg paracetamol = ppm V (L)

 = 289,3381 ppm 0,01 L

= 2,8934 mg

Massa mg Paracetamol dalam Hasil percobaan:

2,8934 mg x mg

4,1 mg l 840,16mg
2,8934 mg x 840,16 mg
x
4,1mg
Paracetamol  592, 9070 mg/tablet

Gambar 1. Deret Standar Paracetamol

b. Massa kafein
Diketahui: y = 78580 x + 25424
Luas area kafein = 2164128
Ditanya : massa kafein?
Jawab:
Luas Area Sampel
=
Luas Area Standar
[Standar]. Luas Area Sampel
[Sampel] =
Luas Area Standar
25 ppm. 216412
[Sampel] =
216416
[Sampel] = 24,9967 ppm

Mg kafein = ppm V (L)

 = 24,9967 ppm 0,01 L

= 0,2500 mg
Massa mg Kafein dalam Hasil percobaan:
0,2500 mg x mg

4,1 mg l 840,16mg
0,2500 mg x 840,16 mg
x
4,1mg
Kafein  51,2293 mg/tablet

Gambar 2. Deret Standari Kafein

Prinsip dari percobaan ini yaitu analisis terhadap sampel vitamin C

menggunakan alat HPLC. Prinsip kerja dari HPLC yaitu pemisahan komponen
sampel dilakukan berdasarkan kepolarannya, hasil deteksi komponen sampel oleh
detektor selanjutnya akan direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada
kromatogram menyatakan konsentrasi komponen campuran, sedangkan luas peak
menyatakan konsentrasi komponen campuran. Metode HPLC jauh lebih sering
digunakan karena dianggap lebih akurat (Klimczak dan Swiglo, 2015).
 Gambar 1. Gambar rangkaian alat HPLC

Wadah fase gerak atau reservoir fase gerak biasanya terbuat dari stainless
steel atau kaca. Daya tampungnya berkisar antara 200-1000 mL. Reservoir ini
biasanya dilengkapi dengan alat degasse yang dapat menghilangkan gas terlarut
pada fase gerak yang dapat mengganggu analisis. Hal ini karena gas tersebut dapat
menghasilkan gelembung pada kolom dan sistem detektor (Susanti dan
Dachriyanus, 2017).

Pompa pada alat HPLC berfungsi untuk memompa pelarut dari reservoir ke
kolom HPLC. Pompa memompakan pelarut secara terus menerus dengan
kecepatan aliran yang tetap. Larutan sampel dipompa dari injektor melewati
kolom analitik hingga ke detektor dan berakhir di pembuangan. Rangkaian alat
HPLC memerlukan sebanyak satu pompa jika menggunakan sistem isokratik dan
memerlukan sebanyak dua pompa jika menggunakan sistem gradien (Murningsih
dan Chairul, 2000).

Injektor adalah alat yang berfungsi untuk memasukkan sampel ke dalam

kolom. Injeksi sampel merupakan salah satu proses yang sangat penting dalam
proses analisis dengan HPLC. Hal ini karena jika injeksi tidak dilakukan dnegan
baik, maka kromatogram yang dihasilkan tidak akan memadai meskipun kolom
yang digunakan telah memadai. Injektor digunakan untutk menyuntikkan sampel
cair dan larutan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah
tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang dilengkapi dengan
selang sampel (sample loop) internal atau eksternal. Sampel dialirkan melewati
selang sampel lalu sisanya dikeluarkan menuju ke pembuangan. Presisi
penyuntikan menggunakan selang sampel dapat mencapai nilai RSD sebesar 0,1%
(Skoog et al., 1998).
Kolom terbuat dari logam berat , kaca dan logam stainless yang dibuat
dengan bentuk tabung agar mampu menahan tekanan dan tidak bereaksi dengan
pelarut. Fasa diam dalam kolom harus bertekstur halus dengan keseragaman
diameter yang sama. Kolom dibuat berbentuk tabung lurus dan dilatakkan dengan
posisi vertikal serta didesain sedemikian rupa agar tidak terjadi kehampaan pada
bagian ujung kolom. Pemilihan kolom yang tepat pada proses analisis
menggunakan HPLC sangat penting untuk dilakukan. Hal ini karena keberhasilan
dalam analisa baik kualitatif dan kuantitatif sangat bergantung pada pemakaian
jenis kolom yang tepat. Kolom merupakan tempat terjadinya pemisahan
komponen-komponen dari sampel yang diuji. Komponen-komponen yang ada
pada sampel ditahan secara selektif oleh fasa diam lalu akan terlarut pada fase
gerak yang terus menerus mengalir menuju detektor (Murningsih dan Chairul,
2000).

Detektor adalah alat untuk mendeteksi komponenkomponen kimia yang

telah terpisah setelah melewati kolom. Detektor yang digunakan pada HPLC
yang percoban ini adalah detektor photodiode array (PDA). Kelebihan dari
detektor jenis ini yaitu mampu mengasilkan kumpulan kromatogram secara
simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run).
Detektor ini dapat menghasilkan spektrum UV pada setiap puncak yang terpisah.
Hal ini dapat mempermudah proses pemilihan panjang gelombang maksimal
untuk sistem HPLC yang digunakan. Detektor ini juga dapat melakukan uji
kemurnian puncak dengan membandingkan antara spektra analit dengan spektra
senyawa yang sudah diketahui (Skoog et al., 1998).
Recorder adalah alat yang berfungsi untuk mencatat setiap sinyal yang
muncul pada detektor untuk kemudian dirubah menjadi kromatogram. Tinggi
rendahnya kurva didasarkan pada pulsa listrik yang diterima rekorder dari
detektor dan tergantung pada sensitivitas detektor yang digunakan. Biasanya
rekorder digabungkan dengan suatu sistem komputer untuk melakukan analisa
data yang dikenal sebagai "Data Prosesor". Hal ini bertujuan untuk
mempermudah proses analisis terhadap data yang dihasilkan. Informasi yang
disajikan dari hasil prosessing data diantaranya yaitu peak area, prosentase (%),
waktu retensi, dan jumlah total dari setiap kurva yang dihasilkan (Murningsih dan
Chairul, 2000).

BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari percobaan ini adalah sebagai berikut :
1. Prinsip kerja dari HPLC yaitu pemisahan komponen sampel dilakukan
berdasarkan kepolarannya, hasil deteksi komponen sampel oleh
detektor selanjutnya akan direkam dalam bentuk kromatogram.
1.
2.
 DAFTAR PUSTAKA

Badriyah, L., Algafari, B., Manggara. 2015. Penetapan Kadar Vitamin C Pada
Cabai Merah (capsicum annum L.) Menggunakan Metode
Spektrofotometri UV-VIS. Jurnal Wiyata. 2(1). 26-28.

Dipahaya, D & Permatasari, N.S. 2019. Pengaruh Metode Penggerusan Tablet

Vitamin C Terhadap Kadar Bahan Aktif. Jurnal Kimia Riset. 4(2). 94-99.

Hudiyanti, D., Triana, D., Siahaan, P. 2017. Studi Pendahuluan Tentang

Enkapsulasi Vitamin C Dalam Liposom Kelapa (cocos nucifera L.). Jurnal
Kimia Sains dan Aplikasi. 20(1). 5-8.

Klimczak & Swigio, G. A. 2015. Comparison Of UPLC and HPLC Methods For
Determination Of Vitamin C. Journal Food Chemistry. 175. 100-105.

Klimczak, I., & A. G. Świgło. 2015. Comparison of UPLC and HPLC methods
for determination of vitamin C. Food chemistry. 175: 100-105.
Kusuma, A. S. W., & R. M. H. Ismanto. 2016. Penggunaan Instrumen High-
Performance Liquid Chromatography Sebagai Metode Penentuan Kadar
Kapsaisin Pada Bumbu Masak Kemasan “Bumbu Marinade Ayam
Special” Merek Sasa. Jurnal Farmasi Universitas Padjajaran. 14(2): 41-
46.
Murningsih, T., & Chairul, C. 2000. Mengenal HPLC: Peranannya dalam Analisa
dan Proses Isolasi Bahan Kimia Alam. Berita Biologi. 5(2): 261-271.
Ratnayani, K. N. M. A & Gitadewi, S. A. M. A. 2008. Penentuan Kadar Glukosa
dan Fruktosa Pada Madu Randu dan Madu Kelengkeng Dengan Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Jurnal kimia. 2(2). 77-86.

Skoog, A. D., Holler, F. J., & Nieman, T. A. 1998. Principles of Instrumental

Analysis. David Haris Publisher, USA.
Susanti, M. & Dachriyanus. 2017. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. LPTIK
Universitas Andalas, Padang.
Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga, Jakarta.