D.

PRINSIP DASAR HPLC

Pada dasarnya HPLC merupakan perkembangan dari metode kromatografi kolom.
HPLC mengizinkan penggunaan pertikel dengan ukuran yang sangat kecil dengan luas
permukaan yang lebih besar sehingga interaksi akan semakin besar. Hal ini akan membuat
sistem pemisahan akan semakin baik (Kusuma, 2016). HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) atau yang biasa disebut Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
merupakan suatu instrumen yang digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dalam
kimia analisis dan biokimia dengan tujuan mengidentifikasi, mengukur, atau memisahkan
masing-masing komponen campuran. Prinsip dasar dari instrumen ini adalah pemisahan
analit-analit berdasarkan kepolarannya (LPPT UGM, 2017)
Prinsip dasar dari HPLC (High Performance Liquid Chromatography) juga
dikemukakan oleh Sarmento (2020), yaitu pemisahan analit dalam kolom kromatografi
berdasarkan kepolarannya pada aliran fase gerak yang membawa campuran analit melalui
fase diam dimana pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan
setiap komponen dalam campuran.
Adapun prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam
dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan
luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran (Sumar, 2006).

E. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN ALAT HPLC

1. KELEBIHAN
2. KEKURANGAN

F. UJI KUALITATIF DAN KUANTITATIF HPLC DI LABORATORIUM

1. UJI KUALITATIF
Salah satu contoh uji kualitatif dengan metode HPLC yang dilakukan oleh Anggraini
(2020) adalah Optimasi penggunaan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
untuk analisis asam askorbat guna menunjang kegiatan Praktikum Bioteknologi Kelautan
untuk mengetahui adanya kandungan asam askorbat dalam ekstrak mangrove dengan alat
HPLC
Pembuatan Ekstrak Mangrove Rhizopora apiculata
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan menghaluskan mangrove Rhizopora apiculata
dengan menggunakan mesin penghalus kecepatan sedang. Serbuk mangrove kemudian
dimaserasi dengan pelarut etanol 70 % selama 1 x 24 jam. Maserat kemudian disaring
dengan menggunakan kertas saring lalu di evaporasi dengan rotary evaporator pada suhu

dibawah 60 oC sehingga diperoleh ekstrak mangrove dalam bentuk pasta.

Pembuatan Larutan Induk Asam Askorbat Dan Larutan Standar

Pembuatan larutan induk asam askorbat dilakukan dengan menimbang standar L-
Ascorbic Acid sebanyak 50 mg lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, larutkan
dengan larutan pengencer, cukupkan sampai tanda batas dan homogenkan (konsentrasi
larutan induk 500 ppm). Dari larutan induk 500 ppm diencerkan menjadi beberapa
konsentrasi larutan standar yaitu 300 ppm, 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 0 ppm.

Selama proses penelitian, larutan induk dan larutan standar disimpan pada suhu ± 4 oC.

Persiapan Larutan Uji

Timbang ± 0.5 gram ekstrak mangrove, masukkan ke labu ukur 25 mL lalu larutkan
dengan larutan pengencer sebanyak 20 mL. Lakukan ultrasonic selama 15 menit
kemudian tambahkan larutan pengencer sampai tanda batas dan homogenkan.
Selanjutnya saring fitrat menggunakan saringan dengan membrane filter ukuran 0,45μm,

diameter 13 mm. Sampel siap di injeksikan.

 (a) (b)

(c) (d)

Kromatogram untuk larutan standar askorbat (a) 50 ppm; (b) 100 ppm; (c) 200 ppm;
dan (d) 300 ppm

Kromatogram sampel mangrove Rhizopora apiculata.

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan oleh Anggraini (2020) Asam askorbat
terindikasi pada ekstrak mangrove Rhizopora apiculata yang dianalisis dengan HPLC
dengan konsentrasi 9.021 ppm.

2. UJI KUANTITATIF
Salah satu contoh uji kuantitatif dengan metode HPLC yang dilakukan oleh Sarmento
(2020) adalah Penentuan Kadar Parasetamol dan Kafein dengan Metode HPLC untuk
mengetahui kadar parasetamol dan kafein dalam sediaan tablet yang ada di masyarakat.

Alat dan Bahan :

Tablet obat yang mengandung parasetamol dan kafein (Panadol 65mg kafein, 500mg
parasetamol). Berdasarkan data pada

USP-32, jumlah tabel parasetamol dan kafein yang digunakan dalam pembuatan larutan
sampel sebanyak 20 tablet. Digunakan 60 tablet panadol karena akan dilakukan replikasi
sebanyak 3 kali.
Pengkondisian instrument HPLC dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak
melalui membran filter. Fase gerak yang digunakan adalah kecepatan alir 2 mL/menit.
Kolom reversed phase C18 yang digunakan adalah kolom panjang 4,6 mm x 10 cm

dengan temperatur kolom 45 ± 1 oC. Sedangkan detektor yang digunakan adalah

detector UV 275 nm [3] dan seperangkat alat-alat gelas.

Pembuatan Larutan Seri Parasetamol

Diperlukan larutan standar parasetamol dalam pembuatan larutan seri. Pembuatan
larutan seri parasetamol 10 mL dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 300 ppm.
Pembuatan larutan seri paracetamol dilakukan dengan cara dipipet masing-masing
larutan standar parasetamol 500 ppm dengan volume masing – masing 1 mL; 2 mL; 3
mL; 4 mL; 5 mL dan 6 mL ke dalam labu ukur 10 mL. Diencerkan sampai tanda batas.

Pembuatan Larutan Seri Kafein

Diperlukan larutan standar kafein dalam pembuatan larutan seri. Pembuatan larutan
seri kafein 10 mL dengan konsentrasi 25, 50, 75, 100, 125, 150 ppm. Pembuatan larutan
seri kafein dilakukan dengan cara dipipet masing – masing larutan standar kafein 500
ppm dengan volume masing – masing 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5 mL dan 3 mL ke
dalam labu ukur 10 mL. Diencerkan sampai tanda batas.

Pembuatan Fase Gerak

Pembuatan 100 mL fase gerak, diperlukan methanol sebanyak 28 mL, asam asetat
glacial sebanyak 3 mL, dan aquadest sebanyak 69 mL.

Pembuatan Larutan Sampel

Menimbang 4,1 mg sampel obat, dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL, ditambahkan
pelarut (aquabides) dan dienncerkan hingga tanda batas.

Diduga zat yang terkandung Waktu Retensi (menit) Luas Area

Paracetamol 2.38 11705288
Kafein 3.62 2164128
 Deret standar Paracetamol
Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)
50 2252106 2.38
100 4239085 2.38
150 6208253 2.38
200 7979072 2.38
250 10093086 2.39
300 12261550 2.38

Deret Standar Paracetamol

14000000
12000000
f(x) = 39645.74 x + 234187.8
10000000 R² = 1
Luas Area

8000000
6000000
4000000
2000000
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Konsentrasi (ppm)

Berdasarkan data hasil percobaan, luas area kandungan sampel yang diduga paracetamol
(11705288), berada pada rentang deret standar paracetamol (10093086-12261550).
Sehingga kadar paracetamol dapat dihitung menggunakan persamaan garis
y = 39646 x + 234188
Sehingga,
y = 39646 x + 234188
11705288 = 39646 x + 234188
11705288-234188
x = 39646
x = 289,3381 ppm

mg paracetamol = ppm V (L)

= 289,3381 ppm 0,01 L

= 2,8934 mg
 Bobot sampel = 4,1 mg
Berat rata-rata penimbangan obat bodrex = 840,16 mg

Kadar mg Paracetamol dalam Hasil percobaan

2,8934 mg x mg
=
4 ,1 mg l 840 , 16 mg
2,8934 mg x 840,16 mg
x=
4,1 mg
Paracetamol =5 92, 9070 mg/tablet

Deret standar Kafein

Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)
25 2164416 3.64
50 4252400 3.62
75 6242196 3.6
100 7989484 3.58
125 10033548 3.59
150 12097707 3.56

Deret Standar Kafein

14000000
12000000
f(x) = 78579.64 x + 254239.8
10000000 R² = 1
Luas Area

8000000
6000000
4000000
2000000
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Konsentrasi (ppm)
Berdasarkan data hasil percobaan luas area kandungan sampel yang diduga kafein
(2164128) berada di luar rentang deret standar kafein ( < 2164416), sehingga kadar
kafein dalam sampel dihitung menggunakan perbandingan standar dengan sampel,
yaitu konsentrasi dan luas areanya.

[Sampel ] Luas Area Sampel

[Standar ] = Luas Area Standar
[Standar ]. Luas Area Sampel
[Sampel] = Luas Area Standar
25 ppm. 216412
[Sampel] = 216416

[Sampel] = 24,9967 ppm

Mg kafein = ppm V (L)

= 24,9967 ppm 0,01 L

= 0,2500 mg

Kadar mg Kafein dalam hasil percobaan

0,2500 mg x mg
=
4 ,1 mg l 840 , 16 mg
0,2500 mg x 840,16 mg
x=
4,1 mg
Kafein =5 1,2293 mg/tablet

Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan oleh Sarmento (2020), diperoleh
kadar paracetamol dan kafein dalam sampel obat masing-masing sebesar 592,9070
mg/tablet dan 51,2293 mg/tablet. Hasil tersebut mendekati kadar yang tercantum pada
 kemasan obat yaitu paracetamol sebanyak 600 mg/tablet dan kafein sebanyak 50
mg/tablet.

DAFTAR PUSTAKA

Anggraini, Novi dan Putri Desmaniar. 2020. Optimasi penggunaan High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) untuk Analisis Asam Askorbat Guna Menunjang Kegiatan
Praktikum Bioteknologi Kelautan. Jurnal Penelitian Sains. Vol. 22 No. 2.

Kusuma, Arif Satria Wira dan Raisha Metantryana Hajar Ismanto. 2016. Penggunaan
Instrumen High-Performance Liquid Chromatography sebagai Metode Penentuan
Kadar Kapsaisin pada Bumbu Masak Kemasan “Bumbu Marinade Ayam Special”
Merek Sasa. Jurnal Farmaka. Vol. 8 No. 2.

LPPT UGM. 2018. Peralatan Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu. Yogyakarta:
UGM Press.

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis

Modern. Bandung: Remaja Rosdakarya Offset

Sarmento, Zigela Luis Corvelo., Olivia Santavena Goncalves Rangdi., Benilda Mariaa
Cesario De Sena., dan Kadek Nadia Martha Dewi. 2020. Penetapan Kadar Parasetamol
dan Kafein Dengan Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Cakra Kimia (Indonesian E-Journal of Applied Chemistry). Vol. 8 No. 2.