MAKALAH

KROMATOGRAFI CAIR

Mata Kuliah: Kimia Analitik Fisik

Dosen Pengampu: Dr. Nursiah La Nafie, M.Sc

Kelompok 3
Aan Eko Putra H012211008
Rahmaniah Zainuddin H012211002

PROGRAM MAGISTER KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
2021

i
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang karena atas berkat Rahmat,
Hidayah dan Karunia-Nya yang diberikan penulis dapat menyelesaikan makalah yang
berjudul “Kromatografi Cair” ini dengan penuh kemudahan. Tanpa pertolongan-Nya penulis
mungkin tidak akan sanggup menyelesaikan makalah ini dengan baik.
Makalah ini disusun agar pembaca dapat memperluas ilmu yang penulis sajikan
berdasarkan pengamatan dari berbagai sumber. Makalah ini memuat tentang Kromatografi
Cair seperti definisi, sejarah, jenis-jenis kromatografi cair dan prinsip dan komponen HPLC
serta aplikasi HPLC dalam analisis secara kualitatif dan kuantitatif. Walaupun makalah ini
mungkin kurang sempurna tapi juga memiliki detail yang cukup jelas bagi pembaca.
Semoga makalah ini dapat memberikan wawasan dan manfaat yang lebih luas kepada
pembaca. Penulis sadar bahwa makalah ini masih banyak memerlukan perbaikan. Untuk itu
mohon saran dan kritiknya. Terima kasih.

Penulis

i
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR........................................................................................................... i
DAFTAR ISI........................................................................................................................ ii
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang......................................................................................................... 1
B. Rumusan Masalah.................................................................................................... 1
C. Tujuan....................................................................................................................... 2
BAB II PEMBAHASAN
A. Definisi dan Sejarah Perkembangan Kromatografi Cair...........................................3
B. Jenis-Jenis Kromatografi Cair...................................................................................4
C. Komponen HPLC (High Liquid Performance Chromatography).............................8
D. Prinsip Dasar HPLC................................................................................................10
E. Uji Kualitatif Dan Kuantitatif HPLC di Laboratorium...........................................11
BAB III SIMPULAN......................................................................................................... 18
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................................... 19

ii
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Proses pemisahan suatu campuran dari komponen-komponen penyusun
sangat penting dalam ilmu kimia. Hal ini dikarenakan beberapa keperluan dalam
kimia yang membutuhkan senyawa dengan kemurnian yang tinggi, tetapi senyawa
kimia di alam banyak ditemukan dalam keadaan yang tercampur dengan senyawa
lain dan tidak murni. Oleh karena itu, dibutuhkan proses pemisahan untuk
mendapatkan senyawa dengan tingkat kemurnian yang tinggi. Salah satu metode
pemisahan yang sering digunakan dalam kimia adalah metode kromatografi.
Metode kromatografi merupakan metode yang memungkinkan pemisahan,
identifikasi dan pemurnian komponen campuran untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif. Terdapat beberapa jenis metode kromatografi yaitu kromatografi kolom,
kromatografi pertukaran ion, kromatografi permeasi gel (saringan molekuler),
kromatografi afinitas, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas,
kromatografi ligan-pewarna, kromatografi hidrofilik, kromatografi pseudoafinitas
dan kromatografi cair kinerja tinggi (Coskun, 2016).
Kromatografi cair merupakan salah satu jenis kromatografi yang banyak
digunakan saat ini. Kromatografi cair memiliki ketepatan analisis dan kepekaan yang
tinggi. Selain itu, kromatografi cair juga cocok untuk memisahkan senyawa-senyawa
nonvolatile yang tidak tahan pada pemanasan. Kedua hal ini menjadi keunggulan
kromatografi cair dibandingkan metode kromatografi lainnya (Susanti &
Dachriyanus, 2017).
Metode kromatografi cair menjadi salah satu metode pemisahan yang penting
dalam kimia. Oleh karena itu, dalam makalah ini penulis akan membahas beberapa
hal terkait metode kromatografi cair dan khususnya kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC).
B. Rumusan Masalah
1. Apa yang dimaksud dengan kromatografi dan bagaimana sejarah
perkembangannya?
2. Apa saja jenis-jenis kromatografi cair?
3. Apa saja komponen-komponen yang terdapat pada HPLC?
4. Bagaimana prinsip dasar HPLC?
1
 5. Bagaimana aplikasi HPLC di laboratorium untuk uji kualitatif dan kuantitatif?
C. Tujuan
1. Mengetahui definisi kromatografi dan bagaimana sejarah perkembangannya
2. Mengetahui jenis-jenis kromatografi
3. Mengetahui komponen-komponen yang terdapat pada HPLC
4. Mengetahui bagaimana prinsip dasar HPLC
5. Mengetahui kelebihan dan kekurangan dari HPLC
6. Mengetahui bagaimana aplikasi HPLC di laboratorium untuk uji kualitatif dan
kuantitatif

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Definisi dan Sejarah Perkembangan Kromatografi Cair
Kromatografi didefinisikan sebagai seperangkat teknik yang digunakan untuk
pemisahan komponen dalam campuran. Teknik ini melibatkan 2 fasa yaitu fasa diam dan
fasa gerak. Pemisahan didasarkan pada partisi atau distribusi sampel (zat terlarut) antara
fase bergerak dan fase diam. Istilah kromatografi berasal dari bahasa Yunani yaitu
chroma (warna) dan graphein (menulis). Kromatografi adalah teknik yang sangat
populer dan banyak digunakan secara analitis (Thammana, 2016).
Kromatografi dapat dilihat sebagai rangkaian kesetimbangan antara fase gerak dan
fase diam. Interaksi relatif zat terlarut dengan dua fase ini dijelaskan oleh partisi (K) atau
koefisien distribusi (D). Fase gerak dapat berupa gas (GC), cairan (LC) atau cairan
superkritis (SFC) (Ismail & Nielsen, 2009). Metode kromatografi yang menggunakan
fase gerak berupa cairan disebut sebagai kromatografi cair.
Kromatografi cair awalnya ditemukan sebagai teknik analisis pada awal abad
Sembilan belas dan pertama kali digunakan sebagai metode pemisahan senyawa
berwarna. Di sinilah nama kromatografi chroma berarti warna, graphy berarti tulisan
diturunkan. Seorang ahli botani Rusia bernama Mikhail S. Tswett pada tahun 1906
menggunakan bentuk dasar pemisahan kromatografi untuk memurnikan campuran
pigmen tumbuhan menjadi unsur murni. Dia memisahkan pigmen berdasarkan
interaksinya dengan fase diam, yang mana ini penting untuk setiap pemisahan
kromatografi. Fasa diam yang digunakan adalah serbuk kapur dan aluminia, fasa gerak
dalam pemisahannya adalah pelarut (Ghanjaoui dkk, 2020).
Kromatografi Tswett telah digunakan secara luas selama beberapa dekade. Pada
tahun 1940 dua ilmuwan bernama Archer John Porter Martin dan Richard Lawrence
Millington Synge mengembangkan pendekatan baru untuk kromatografi. Pengembangan
ini menggunakan dua fase cair dan bukan hanya satu. Hal ini memungkinkan mereka
untuk memisahkan senyawa dengan koefisien partisi yang berbeda dan merupakan awal
dari pengembangan kromatografi cair tekanan tinggi. Pada tahun 1970-an teknik ini
disempurnakan dan penambahan pompa dikembangkan untuk membantu mendorong
fase cair dan senyawa melalui fase diam. Oleh karena itu, senyawa dapat lolos secara
menyeluruh dan dipisahkan dengan cepat. Teknik ini disebut kromatografi cair tekanan
tinggi (Thammana, 2016).

3
B. Jenis-Jenis Kromatografi Cair
Berikut skema pembagian kromatografi berdasarkan teknik yang diterapkan.

Gambar 2.1. Skema pembagian kromatografi berdasarkan teknik yang diterapkan

(Sumber: Ismail & Nielsen, 2010)
Ada beberapa metode kromatografi cair, yaitu kromatografi kertas, kromatografi
lapis tipis (KLT) (kedua teknik ini dapat disebut sebagai kromatografi planar), dan
kromatografi cair kolom, yang semuanya melibatkan fase gerak cair dan fase diam padat
atau cair.
1. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas diperkenalkan pada tahun 1944. Dalam kromatografi
kertas fase diam dan fase gerak keduanya cair (kromatografi “cair-cair”). Kertas
umumnya berfungsi sebagai penopang fase diam cair. Sampel terlarut dibuat sebagai
titik kecil atau coretan dengan jarak satu setengah inci atau lebih dari tepi strip atau
kertas saring persegi (biasanya selulosa), yang kemudian dibiarkan kering. Strip
kering digantung di wadah tertutup sehingga atmosfer dalam wadah jenuh dengan
uap pelarut agar dapat menaikkan pelarut (fase gerak). Ujung yang lebih dekat ke
sampel ditempatkan dalam pelarut, yang kemudian pelarut akan bergerak ke atas atau
ke bawah kertas karena gaya kapiler. Setelah bagian pelarut telah melewati panjang

4
 kertas, strip dikeluarkan dari ruang pengembangan dan zona yang terpisah dideteksi
dengan metode yang sesuai (Ismail & Nielsen, 2010).
Luasnya pergerakan komponen diukur dengan menghitung “nilai RF”. Nilai
RF didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dari titik aplikasi
dibagi dengan jarak dilalui oleh pelarut dari titik aplikasi. Faktor-faktor yang
mempengaruhi
nilai RF adalah sistem pelarut dan komposisinya, suhu, pH dari larutan, kualitas
kertas dan adsorben, serta jarak di mana pelarut berjalan (Priyadarshini, 2016)
jarak yang ditempuh komponen
Rf=
jarak yang ditempuh pelarut

Gambar 2.2. Kromatografi kertas (Sumber: Priyadarshini, 2016)

Kromatografi kertas khusus digunakan untuk pemisahan campuran yang
bersifat polar dan senyawa non polar, untuk pemisahan pigmen, pewarna, tinta, dan
asam amino, utuk menentukan senyawa organik dan biokimia lainnya dalam urin dan
untuk penentuan hormon dan obat-obatan, serta valuasi senyawa anorganik seperti
garam dan kompleks.
2. Kromatografi Lapis Tipis
Schraiber pada tahun 1939, mengembangkan dan menggunakan kromatografi
lapis tipis untuk pertama kalinya. Kromatografi lapis tipis adalah teknik kromatografi
yang digunakan untuk memisahkan campuran yang tidak mudah menguap.
Kromatografi lapis tipis dilakukan pada lembaran kaca, plastik, atau aluminium foil
yang dilapisi dengan bahan adsorben seperti alumina gel, silica gel dan selulosa
(Sharma, 2018).

5
 Untuk prosedur kerja dari kromatografi lipis tipis yaitu sampel campuran
ditempatkan di dekat bagian bawah pelat lapisan tipis. Pelarut kemudian dibiarkan
meresap ke atas pelat dengan gaya kapiler. Ruang dalam keadaan jenuh dengan uap
pelarut untuk mencegah pelarut menguap dari permukaan pelat dan juga mengontrol
mekanisme retensi dengan penonaktifan permukaan pencelupan tempat sampel.
Sebuah komponen yang kuat teradsorpsi akan bergerak lebih lambat. Hasil diwakili
oleh nilai RF dimana nilai ini memiliki persamaan yang sama dengan kromatografi
kertas (Priyadarshini, 2016).
jarak yang ditempuh komponen
Rf=
jarak yang ditempuh pelarut

Gambar 2.3. Kromatografi lapis tipis (KLT) (Sumber: Priyadarshini, 2016)

Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan semua kelas produk
organik. Misalnya asam, alkohol, amina, makromolekul seperti asam amino dan
protein, dll. Selain itu, KLT juga banyak digunakan untuk identifikasi dan
pemurnian, untuk memeriksa kinerja proses pemisahan lainnya, untuk mengevaluasi
proses reaksi dengan analisa zat antara, jalur reaksi, dll. Sedangkan untuk pemisahan
Ion Anorganik, kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan zat kationik &
anionic. KLT juga dapat melakukan pemisahan vitamin misalnya Vitamin E,
Vitamin D3, vitamin A (Priyadarshini, 2016).
3. Kormatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan di mana komponen dalam
campuran dipisahkan berdasarkan adsorpsi komponen-komponen dengan fase diam,

6
sehingga komponen akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda ketika melewati
kolom. Ini merupakan teknik kromatografi padat-cair di mana fase diamnya adalah
padatan dan fase geraknya adalah cairan atau gas (Ismail & Nielsen, 2010).
Teknik ini didasarkan pada prinsip adsorpsi komponen-komponen campuran
dimana molekul yang dalam campuran memiliki afinitas yang berbeda dengan
penyerap yang ada pada fase diam. Molekul yang memiliki afinitas lebih tinggi akan
tetap teradsorpsi untuk waktu yang lebih lama sehingga mengurangi kecepatan
pergerakannya melalui kolom. Namun untuk molekul dengan afinitas lebih rendah
bergerak dengan gerakan yang lebih cepat, sehingga memungkinkan molekul untuk
dipisahkan dalam fraksi yang berbeda. Di sini, fase diam dalam kromatografi kolom
yang juga disebut penyerap adalah padatan (kebanyakan silika) dan fase gerak adalah
cairan yang memungkinkan molekul bergerak melalui kolom dengan lancar
(Priyadarshini, 2016).

Gambar 2.3. Kromatografi Kolom (Sumber: Priyadarshini, 2016)

Kolom dibuat dengan mengambil tabung gelas yang dikeringkan dan dilapisi
dengan lapisan tipis yang seragam dari fase diam (selulosa, silika). Kemudian sampel
dipreparasi dengan menambahkan campuran fase gerak. Sampel dimasukkan ke
dalam kolom dari atas dan dibiarkan fase gerak melewati sampel di bawah pengaruh
gravitasi. Molekul yang terikat pada kolom dipisahkan dengan teknik elusi di mana
digunakan larutan dengan polaritas yang sama (teknik isokratik), atau sampel yang

7
 berbeda dengan polaritas yang berbeda digunakan (teknik gradien). Molekul yang
terpisah dapat dianalisis lebih lanjut untuk berbagai tujuan (Priyadarshini, 2016).
Kromatografi kolom secara rutin digunakan untuk pemisahan pengotor dan
pemurnian berbagai campuran biologis. Teknik ini juga dapat digunakan untuk
isolasi molekul aktif dan metabolit dari berbagai sampel. Kromatografi kolom
semakin banyak digunakan untuk mendeteksi obat dalam ekstrak kasar
(Priyadarshini, 2016).
C. Komponen HPLC (High Liquid Performance Chromatography)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) adalah teknik analisis populer yang
digunakan untuk pemisahan, identifikasi dan kuantifikasi setiap komponen campuran.
HPLC adalah teknik lanjutan dari kromatografi cair kolom. Pelarut biasanya mengalir
melalui kolom dengan bantuan gravitasi tetapi dalam teknik HPLC pelarut akan dipaksa
di bawah tekanan tinggi hingga 400 atm sehingga sampel dapat dipisahkan menjadi
komponen yang berbeda dengan bantuan perbedaan afinitas relatif. Komponen
terpenting dari instrumen HPLC adalah: fase gerak/reservoir pelarut, sistem pengiriman
pelarut (pompa), perangkat pengantar sampel (injector), kolom, detektor, pengumpulan
dan keluaran data.

Gambar 2.2. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

(Sumber: Ghanjaoui dkk, 2020)
1. Fase Gerak/Reservoir Pelarut
Reservoir yang menampung fase gerak seringkali tidak lebih dari botol kaca.
Botol reagen yang menampung pelarut HPLC juga dapat digunakan sebagai reservoir
Jenis dan komposisi fase gerak mempengaruhi pemisahan komponen. Pelarut yang

8
 berbeda digunakan untuk berbagai jenis HPLC. Untuk HPLC fase normal, pelarut
biasanya nonpolar, dan dalam HPLC fase terbalik pelarut biasanya campuran air dan
pelarut organik polar. Aturan umum dari pelarut adalah menggunakan pelarut dengan
tingkat kemurnian tertinggi yang tersedia dan praktis tergantung pada aplikasi
tertentu (Thammana, 2016).
Pelarut dikirim dari reservoir ke pompa melalui pipa teflon yang disebut
"saluran masuk" ke pompa. Beberapa sistem HPLC memiliki kompartemen khusus
untuk menampung satu atau lebih reservoir fase gerak (Ghanjaoui dkk, 2020).
2. Sistem Pengiriman Pelarut (Pompa)
Pompa menyedot fase gerak dari reservoir pelarut dan memaksanya ke kolom
dan kemudian melewati detektor. Pompa bertekanan tinggi diperlukan untuk
mendorong fase gerak melalui fase diam. Tekanan pada pompa yang stabil
diperlukan untuk memastikan reproduktifitas dan akurasi. Tekanan pompa yang
stabil biasanya sekitar 1000-2000 psi. Pompa biasanya dikenal kuat, tetapi perawatan
yang memadai harus dilakukan untuk mempertahankan karakteristik itu.
Ketidakmampuan untuk membangun tekanan, tekanan tinggi atau kebocoran dapat
menunjukkan bahwa pompa tidak berfungsi dengan benar. Perawatan yang tepat dari
sistem pompa akan meminimalkan waktu henti (Thammana, 2016).
3. Perangkat Pengantar Sampel (Injeksi)
Injektor pada HPLC dapat berupa injeksi tunggal atau sistem injeksi otomatis.
Injektor untuk sistem HPLC harus menyediakan injeksi sampel cair dalam kisaran
volume 0,1-100 mL dengan reproduktifitas tinggi dan di bawah tekanan tinggi
(hingga 4000 psi). Untuk kromatografi cair, sampel cair dapat langsung disuntikkan
dan sampel padat hanya perlu diencerkan dalam pelarut yang sesuai (Thammana,
2016).
Injeksi sampel pada tekanan atmosfer ke dalam sistem dilakukan dengan
tekanan tinggi, merupakan langkah penting dalam proses kromatografi. Katup injeksi
sampel, atau katup sakelar, digunakan untuk memasukkan jumlah sampel yang dapat
direproduksi ke dalam aliran eluen HPLC tanpa menyebabkan perubahan tekanan
atau aliran (Ghanjaoui dkk, 2020).
4. Kolom
Kolom atau fase diam adalah inti dari setiap sistem kromatografi. Kolom
tersedia secara komersial dalam berbagai panjang, ukuran lubang dan bahan
pengepakan, biasanya memiliki panjang sekitar 50 mm dan 300 mm dan memiliki
9
 jarak ke dalam sekitar 2 dan 5 mm. Kolom dengan diameter dalam <2 mm sering
disebut sebagai segmen lubang mikro. Penggunaan kombinasi panjang dan bahan
pengemas yang benar dalam korelasi dengan fase gerak yang sesuai dapat membantu
pemisahan senyawa sampel yang paling efektif. Berbagai dimensi kolom tersedia
termasuk kolom preparatif, normal-bore, mikro dan mini-bore dan kapiler. Dimensi
kolom yang berbeda dapat digunakan untuk berbagai jenis pemisahan dan dapat
menggunakan bahan pengepakan dan laju aliran yang berbeda. Bahan pengemas
yang paling banyak digunakan untuk pemisahan HPLC adalah berbasis silica
(Thammana, 2016).
5. Detektor
Detektor HPLC, terletak di ujung kolom membedakan analit saat mereka
terelusi dari kolom kromatografi. Ada banyak jenis detektor yang dapat digunakan
untuk HPLC. Detektor digunakan untuk merasakan keberadaan senyawa yang
melewatinya dan untuk memberikan sinyal elektronik ke perangkat akuisisi data.
Jenis utama dari detektor yang digunakan dalam HPLC adalah indeks bias (RI),
ultraviolet (UV-Vis) dan fluoresensi, tetapi ada juga detektor array dioda,
elektrokimia dan konduktivitas (Thammana, 2016).
6. Pengumpulan dan Keluaran Data.
Sinyal dari detektor dapat dikumpulkan pada perekam grafik atau integrator
elektronik untuk memproses, menyimpan, dan memproses ulang informasi
kromatografi (Thammana, 2016). Output dicatat sebagai serangkaian puncak,
masing-masing mewakili senyawa dalam campuran yang melewati detektor dan
menyerap sinar UV (dalam kasus HPLC-UV/Vis). Area di bawah puncak sebanding
dengan jumlah zat yang melewati detektor, dan area ini dapat dihitung secara
otomatis oleh komputer yang terhubung ke layar. Karena sinyal detektor adalah
elektronik, penggunaan teknik akuisisi data modern dapat membantu dalam analisis
sinyal. Sistem akuisisi data dari sebagian besar sistem HPLC adalah komputer.
Komputer mengintegrasikan respons detektor ke setiap komponen dan
menempatkannya ke dalam kromatografi yang mudah dibaca dan ditafsirkan. Fitur
lain yang lebih canggih juga dapat diterapkan pada sistem kromatografi. Fitur-fitur
ini termasuk injektor otomatis yang dikendalikan komputer, pengontrol gradien
multi-pompa, dan pengumpul fraksi sampel (Ghanjaoui dkk, 2020).

D. PRINSIP DASAR HPLC

10
 Pada dasarnya HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan
perkembangan dari metode kromatografi kolom. HPLC mengizinkan penggunaan
pertikel dengan ukuran yang sangat kecil dengan luas permukaan yang lebih besar
sehingga interaksi akan semakin besar. Hal ini akan membuat sistem pemisahan akan
semakin baik (Kusuma, 2016). HPLC atau yang biasa disebut Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) merupakan suatu instrumen yang digunakan untuk memisahkan
campuran senyawa dalam kimia analisis dan biokimia dengan tujuan mengidentifikasi,
mengukur, atau memisahkan masing-masing komponen campuran. Prinsip dasar dari
instrumen ini adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya (LPPT UGM,
2017)
Prinsip dasar dari HPLC (High Performance Liquid Chromatography) juga
dikemukakan oleh Sarmento (2020), yaitu pemisahan analit dalam kolom kromatografi
berdasarkan kepolarannya pada aliran fase gerak yang membawa campuran analit
melalui fase diam dimana pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan
kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam sehingga terjadi perbedaan
waktu perpindahan setiap komponen dalam campuran.
Adapun prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam
dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen,
sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran (Sumar,
2006).

E. UJI KUALITATIF DAN KUANTITATIF HPLC DI LABORATORIUM

1. Uji Kualitatif
Salah satu contoh uji kualitatif dengan metode HPLC yang dilakukan oleh
Anggraini (2020) adalah Optimasi penggunaan High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) untuk analisis asam askorbat guna menunjang kegiatan
Praktikum Bioteknologi Kelautan untuk mengetahui adanya kandungan asam
askorbat dalam ekstrak mangrove dengan alat HPLC

Pembuatan Ekstrak Mangrove Rhizopora apiculata

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan menghaluskan mangrove Rhizopora
apiculata dengan menggunakan mesin penghalus kecepatan sedang. Serbuk
mangrove kemudian dimaserasi dengan pelarut etanol 70% selama 1x24 jam.
11
Maserat kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring lalu di evaporasi

dengan rotary evaporator pada suhu dibawah 60oC sehingga diperoleh ekstrak
mangrove dalam bentuk pasta.

Pembuatan Larutan Induk Asam Askorbat Dan Larutan Standar

Pembuatan larutan induk asam askorbat dilakukan dengan menimbang standar
L-Ascorbic Acid sebanyak 50 mg lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL,
larutkan dengan larutan pengencer, cukupkan sampai tanda batas dan homogenkan
(konsentrasi larutan induk 500 ppm). Dari larutan induk 500 ppm diencerkan
menjadi beberapa konsentrasi larutan standar yaitu 300 ppm, 200 ppm, 100 ppm, 50
ppm, dan 0 ppm. Selama proses penelitian, larutan induk dan larutan standar

disimpan pada suhu ± 4oC.

Pembuatan Larutan Uji

Timbang ± 0.5 gram ekstrak mangrove, masukkan ke labu ukur 25 mL lalu
larutkan dengan larutan pengencer sebanyak 20 mL. Lakukan ultrasonic selama 15
menit kemudian tambahkan larutan pengencer sampai tanda batas dan homogenkan.
Selanjutnya saring fitrat menggunakan saringan dengan membrane filter ukuran
0,45μm, diameter 13 mm. Sampel siap di injeksikan.

Prosedur Analisa Kadar Asam Askorbat

Larutan standard dan larutan uji masing- masing sebanyak 20 L diinjeksikan
dengan menggunakan syringe 50 L ke dalam alat HPLC. Kondisi alat HPLC pada
saat analisa diatur sebagai berikut:
Kolom : Shimpack VP ODS C18
Fase gerak : Asam asetat : Metanol (60:40)
Kecepatan alir : 1.0 mL/menit
Detektor : UV (panjang gelombang 264)

12
 Kromatogram untuk larutan standar askorbat (a) 50 ppm; (b) 100 ppm;
(c) 200 ppm; dan (d) 300 ppm

Kromatogram sampel mangrove Rhizopora apiculata.

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan oleh Anggraini (2020) Asam askorbat
terindikasi pada ekstrak mangrove Rhizopora apiculata yang dianalisis dengan HPLC
dengan konsentrasi 9.021 ppm.

2. UJI KUANTITATIF
Salah satu contoh uji kuantitatif dengan metode HPLC yang dilakukan oleh Sarmento
(2020) adalah Penentuan Kadar Parasetamol dan Kafein dengan Metode HPLC untuk
mengetahui kadar parasetamol dan kafein dalam sediaan tablet yang ada di masyarakat.

Pembuatan Larutan Seri Parasetamol

13
 Diperlukan larutan standar parasetamol dalam pembuatan larutan seri. Pembuatan
larutan seri parasetamol 10 mL dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 300 ppm.
Pembuatan larutan seri paracetamol dilakukan dengan cara dipipet masing-masing
larutan standar parasetamol 500 ppm dengan volume masing – masing 1 mL; 2 mL; 3
mL; 4 mL; 5 mL dan 6 mL ke dalam labu ukur 10 mL. Diencerkan sampai tanda batas.

Pembuatan Larutan Seri Kafein

Diperlukan larutan standar kafein dalam pembuatan larutan seri. Pembuatan larutan
seri kafein 10 mL dengan konsentrasi 25, 50, 75, 100, 125, 150 ppm. Pembuatan larutan
seri kafein dilakukan dengan cara dipipet masing – masing larutan standar kafein 500
ppm dengan volume masing – masing 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5 mL dan 3 mL ke
dalam labu ukur 10 mL. Diencerkan sampai tanda batas.

Prosedur Analisa Kadar Parasetamol dan Kafein

Pengkondisian instrument HPLC dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak
melalui membran filter. Fase gerak yang digunakan adalah kecepatan alir 2 mL/menit.
Kolom reversed phase C18 yang digunakan adalah kolom panjang 4,6 mm x 10 cm
o
dengan temperatur kolom 45 ± 1 C. Sedangkan detektor yang digunakan adalah detector
UV 275 nm [3] dan seperangkat alat-alat gelas.

Pembuatan Larutan Sampel

Menimbang 4,1 mg sampel obat, dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL, ditambahkan
pelarut (aquabides) dan dienncerkan hingga tanda batas.

Pembuatan Fase Gerak

Pembuatan 100 mL fase gerak, diperlukan methanol sebanyak 28 mL, asam asetat
glacial sebanyak 3 mL, dan aquadest sebanyak 69 mL.

Diduga zat yang terkandung Waktu Retensi (menit) Luas Area

Paracetamol 2.38 11705288
Kafein 3.62 2164128

Deret standar Paracetamol

14
 Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)
50 2252106 2.38
100 4239085 2.38
150 6208253 2.38
200 7979072 2.38
250 10093086 2.39
300 12261550 2.38

Deret Standar Paracetamol

14000000
12000000
f(x) = 39645.74 x + 234187.8
10000000 R² = 1
Luas Area

8000000
6000000
4000000
2000000
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Konsentrasi (ppm)

Berdasarkan data hasil percobaan, luas area kandungan sampel yang diduga paracetamol
(11705288), berada pada rentang deret standar paracetamol (10093086-12261550).
Sehingga kadar paracetamol dapat dihitung menggunakan persamaan garis
y = 39646 x + 234188
Sehingga,
y = 39646 x + 234188
11705288 = 39646 x + 234188
11705288-234188 11705288−234188
x = 39646 39646
x = 289,3381 ppm
mg paracetamol = ppm V (L)
= 289,3381 ppm 0,01 L
= 2,8934 mg
Bobot sampel = 4,1 mg
Berat rata-rata penimbangan obat = 840,16 mg
Kadar mg Paracetamol dalam Hasil percobaan

15
 2,8934 mg x mg
=
4 ,1 mg l 840 , 16 mg
2,8934 mg x 840,16 mg
x=
4,1 mg
Paracetamol =5 92, 9070 mg/tablet
2,8934 mg
Deret standar Kafein
4,1 mg
Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)
25 2164416 3.64
50 4252400 3.62
75 6242196 3.6
100 7989484 3.58
125 10033548 3.59
150 12097707 3.56

Deret Standar Kafein

14000000
12000000
f(x) = 78579.64 x + 254239.8
10000000 R² = 1
Luas Area

8000000
6000000
4000000
2000000
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Konsentrasi (ppm)

16
Berdasarkan data hasil percobaan luas area kandungan sampel yang diduga kafein
(2164128) berada di luar rentang deret standar kafein ( < 2164416), sehingga kadar
kafein dalam sampel dihitung menggunakan perbandingan standar dengan sampel,
yaitu konsentrasi dan luas areanya.

[Sampel ] [Sampel ] [ Standar ] . Luas Area Sampel Luas Area Sampel

[Standar ] [Standar ] = Luas Area Standar Luas Area Standar

[Standar ]. Luas Area Sampel

[Sampel] = Luas Area Standar

25 ppm . 2164128 25 ppm. 216412

[Sampel] = 216416 216416

[Sampel] = 24,9967 ppm

Mg kafein = ppm V (L)
= 24,9967 ppm 0,01 L
= 0,2500 mg
Kadar mg Kafein dalam hasil percobaan
0,2500 mg x mg
=
4 ,1 mg l 840 , 16 mg
0,2500 mg x 840,16 mg
x=
4,1 mg
Kafein =5 1,2293 mg/tablet
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan oleh Sarmento (2020), diperoleh
kadar paracetamol dan kafein dalam sampel obat masing-masing sebesar 592,9070
mg/tablet dan 51,2293 mg/tablet. Hasil tersebut mendekati kadar yang tercantum pada
kemasan obat yaitu paracetamol sebanyak 600 mg/tablet dan kafein sebanyak 50
mg/tablet.

17
 BAB III
KESIMPULAN
Metode kromatografi merupakan metode yang memungkinkan pemisahan, identifikasi
dan pemurnian komponen campuran untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Kromatografi
didefinisikan sebagai seperangkat teknik yang digunakan untuk pemisahan konstituen dalam
campuran. Teknik ini melibatkan 2 fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan
didasarkan pada partisi atau distribusi sampel (zat terlarut) antara fase bergerak dan fase
diam. Salah satu metode kromatografi yaitu kromatografi cair.
Kromatografi cair merupakan salah satu jenis kromatografi yang banyak digunakan saat
ini. Kromatografi cair memiliki ketepatan analisis dan kepekaan yang tinggi. Selain itu,
kromatografi cair juga cocok untuk memisahkan senyawa-senyawa nonvolatile yang tidak
tahan pada pemanasan. Ada beberapa metode kromatografi cair, yaitu kromatografi kertas,
kromatografi lapis tipis (KLT) (kedua teknik ini dapat disebut sebagai kromatografi planar),
dan kromatografi cair kolom, yang semuanya melibatkan fase gerak cair dan fase diam padat
atau cair. Salah satu metode lanjutan dari kromatografi kolom adalah Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (HPLC).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) merupakan teknik analisis populer yang
digunakan untuk pemisahan, identifikasi dan kuantifikasi setiap konstituen campuran.
Komponen terpenting dari instrumen HPLC adalah: fase gerak/reservoir pelarut, sistem
pengiriman pelarut, perangkat pengantar sampel, kolom, detektor, pengumpulan dan keluaran
data. Prinsip dasar dari HPLC (High Performance Liquid Chromatography) juga
dikemukakan oleh Sarmento (2020), yaitu pemisahan analit dalam kolom kromatografi
berdasarkan kepolarannya pada aliran fase gerak yang membawa campuran analit melalui
fase diam dimana pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan
setiap komponen dalam campuran.
Adapun prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam
dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan
luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Oleh karena itu, metode
HPLC ini dapat digunakan untuk analisa secara kualitatif dan kuantitatif.

18
 DAFTAR PUSTAKA

Anggraini, Novi dan Putri Desmaniar. 2020. Optimasi penggunaan High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) untuk Analisis Asam Askorbat Guna Menunjang Kegiatan
Praktikum Bioteknologi Kelautan. Jurnal Penelitian Sains. Vol. 22 No. 2.

Coskun, Ozlem. 2016. Separation techniques: Chromatography. Northern Clinics of Istanbul.

Vol. 3 (2) : 156-160.

Ghanjaoui, M.e., A. Mandil., A. Ait Sidi Mou., dan R. Slimani, 2020. High Performance
Liquid Chromatography Quality Control. International Journal of Advanced
Chemistry, Vol. 8 (1): 160-169

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis

Modern. Bandung: Remaja Rosdakarya Offset.

Ismail, B. dan S. S. Nielsen. 2010. Basic Principles of Chromatography. Food Analysis. Vol.
1 (27) : 473 – 498.

Kusuma, Arif Satria Wira dan Raisha Metantryana Hajar Ismanto. 2016. Penggunaan
Instrumen High-Performance Liquid Chromatography sebagai Metode Penentuan
Kadar Kapsaisin pada Bumbu Masak Kemasan “Bumbu Marinade Ayam Special”
Merek Sasa. Jurnal Farmaka. Vol. 8 No. 2.

LPPT UGM. 2018. Peralatan Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu. Yogyakarta:
UGM Press.

Malviya, R., Bansal V., Pal O.P., and Sharma P.K. 2018. High Performance Liquid
Chromatography: A Short Review. Journal of Global Pharma Technology. Vol 2 (5):
22-26

Priyadarshini, R., Gerard, M.R., and Deepak, G.S. 2016. Chromatography–The Essence of
Bioanalysis. European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciencese. Vol. 3
(1): 366-377.

Sarmento, Zigela Luis Corvelo., Olivia Santavena Goncalves Rangdi., Benilda Mariaa
Cesario De Sena., dan Kadek Nadia Martha Dewi. 2020. Penetapan Kadar Parasetamol
dan Kafein Dengan Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Cakra Kimia (Indonesian E-Journal of Applied Chemistry). Vol. 8 No. 2.

Susanti, M dan Dachriyanus. 2017. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Padang: Carano
Pustaka Universitas Andalas.

Thammana, M. 2016. A Review on High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

Research & Reviews: Journal of Pharmaceutical Analysis. Vol. 5 (2): 22-28.

19