MAKALAH ANALISIS SEDIAAN FARMASI

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Di susun oleh :

Reza Diar Milanda (17040082/19A)

Aninda Fellysia Wibowo (19040008/19A)
Bintang Bagas Pratama (19040015/19A)
Devi Restina Fikri (19040021/19A)
Dhaniyar Reno Pramudita (19040023/19A)
Falakh Noferyana Hartania Wati (19040043/19A)

PROGRAM STUDI SI FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN dr. SOEBANDI JEMBER

YAYASAN PENDIDIKAN JEMBER INTERNATIONAL SCHOOL

TAHUN 2020/2021

Jl.dr. Soebandi No. 99 Jember, Telp/Fax. (0331) 483536

E_mail : jstikesdr.soebandi@yahoo.comLaman: www.stikesdrsoebandi.ac.id

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT, karena atas berkah, rahmat, dan
hidayah yang dilimpahkan-Nya, kami dapat menyusun dan meneylesaikan makalah yang
berjudul “HPLC ”.

Makalah ini ditulis untuk memenuhi salah satu mata kuliah Analisis Sediaan Farmasi
dengan dosen pengampu Ibu Linda Setyaningrum., M.Farm., Apt

Dengan segala keterbatasan, kami sepenuhnya menyadari bahwa dalam penulisan

makalah ini masih banyak terdapat kekurangan, baik dalam pembahasan maupun tata bahasanya
atau cara penulisannya. Untuk itu, dengan segala kerendahan hati kiranya koreksi dan saran yang
sifatnya membangun dari semua pihak khususnya para pembaca sangat saya harapkan demi
kesempurnaan penulisan makalah ini.

Akhir kata saya mengharapkan semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi kami sebagai
penulis khususnya dan bagi pembaca pada umumnya.

Jember,17 Oktober 2020

Penyusun

ii
DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR.................................................................................................................................ii
DAFTAR ISI..............................................................................................................................................iii
BAB 1. PENDAHULUAN..........................................................................................................................1
1.1 Latar Belakang.............................................................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah........................................................................................................................2
1.3 Tujuan..........................................................................................................................................2
BAB 2. PEMBAHASAN............................................................................................................................3
2.1 Kromatografi.....................................................................................................................................3
2.2 Klasifikasi Kromatografi...................................................................................................................3
2.3 HPLC.................................................................................................................................................4
2.4 Penggunaan HPLC............................................................................................................................5
2.5 Perbandingan HPLC dan UHPLC......................................................................................................7
BAB 3. PENUTUP....................................................................................................................................12
3.1 Kesimpulan......................................................................................................................................12
DAFTAR PUSTAKA................................................................................................................................13
LAMPIRAN..............................................................................................................................................14

iii
 BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Salah satu bahan baku propelan yang dikembangkan oleh LAPAN saat ini adalah
Ammonium Perkhlorat (AP). Sedangkan bahan baku utama dari Ammonium Perkhlorat
adalah garam dapur (NaCl) yang akan mengalami proses elektrolisis dan dilanjutkan dengan
proses amoniasi hingga menjadi Ammonium Perkhlorat. Saat ini LAPAN masih
menggunakan NaCl pro analis (pa) yang kadar kemurniaannya sangat tinggi, karena larutan
NaCl yang akan diumpankan ke dalam sel elektrolisis harus terbebas dari impurities
(pengotor) yang bisa mengganggu jalannya proses elektrolisis. Sedangkan NaCl teknis
belum cukup murni untuk digunakan sebagai bahan baku proses produksi Ammonium
Perkhlorat, karena masih cukup banyak mengandung impurities seperti ion Ca, Ba, dan Mg.
Akan tetapi kekurangan dari NaCl (pa) tersebut harganya masih jauh lebih mahal bila
dibandingkan dengan NaCl teknis. Oleh karena itu, dalam rangka memanfaatkan realitas
yang ada, dikembangkan teknik pemurnian NaCl teknis yang masih mengandung banyak
impurities seperti Ca,Mg dan Ba untuk dihilangkan kandungan impuritis-nya. Untuk
mengetahui seberapa banyak kandungan impurities mula-mula di dalam senyawa NaCl
teknis dan kandungan impurities setelah proses pemurnian NaCl, maka perlu dilakukan
analisa terhadap contoh sampel larutan NaCl keduanya. Untuk melakukan analisa tersebut,
tentu dibutuhkan suatu metode dan instrumen yang dapat melakukan pendeteksian adanya
kation atau anion dalam suatu sampel tertentu.
Proses pemurnian NaCl di LAPAN membutuhkan perlakuan analisa deteksi ion, yang
mempunyai tujuan untuk mengetahui seberapa besar konsentrasi ion (khususnya kation)
yang terkandung di dalam larutan NaCl sebelum dan sesudah dimurnikan. Dalam proses
analisa ini, di antara sekian banyak metode kromatografi yang ada, LAPAN menggunakan
metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau lebih populer disebut dengan istilah
High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Pemilihan teknik kromatografi ion ini
didasarkan pada kemampuan lebihnya untuk melakukan pendeteksian secara simultan,
mudah dalam pengoperasian, mempunyai kecepatan analisis dan akurasi hasil yang cukup
tinggi serta memiliki kolom pemisah yang cukup stabil sehingga dapat digunakan kembali.

1
1.2 Rumusan Masalah
1. Jelaskan apa itu Kromatografi ?
2. Jelaskan klasifikasi Kromatografi ?
3. Jelaskan tentang HPLC ?
4. Apa penggunaan HPLC ?
5. Apa perbandingan HPLC dan UHPLC ?

1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui tentang kromatografi
2. Untuk mengetahui klasifikasi kromatografi
3. Mengetahui apa itu HPLC
4. Mengetahui bagaimana penggunaan HPLC.
5. Mengetahui apa saja perbandiang antara HPLC dan UHPLC

2
 BAB 2. PEMBAHASAN

2.1 Kromatografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan

kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Istilah kromatografi berasal
dari gabungan kata “chroma” (warna) dan “graphein” (menuliskan). Kromatografi dapat
digunakan untuk analisa kualitatif dan kuantitatif. Pada dasarnya semua cara
kromatografi menggunakan dua fase yaitu fase diam (stationer) dan fase bergerak
(mobile).
Persyaratan utama kromatografi adalah:
 Ada fase diam dan fase gerak. Fase diam tidak boleh bereaksi dengan fase gerak.
 Komponen sampel (contoh) harus larut dalam fase gerak dan berinteraksi dengan
fase tetap (diam).
 Fase gerak harus bisa mengalir melewati fase diam, sedangkan fase diam harus
terikat kuat di posisinya.

2.2 Klasifikasi Kromatografi

Komponen utama kromatografi adalah fase diam dan fase gerak. Kromatografi
dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fase gerak, fase diam dan
mekanisme pemisahannya, seperti ditunjukkan pada Tabel

Berikut kromatografi yang sering digunakan dalam analisa laboratorium

3
  Kromatografi partisi
Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali
proses. Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang
digunakan luas karena sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik.
 Kromatografi kertas
Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino.
Asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam
air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi).
 Kromatografi gas
Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Metode ini
sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti
hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah
telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.

2.3 HPLC

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah teknik kromatografi

cair (LC) yang penting dan sering digunakan untuk pemisahan berbagai komponen dalam
campuran. Tujuan penggunaan HPLC adalah memisahkan molekul dalam waktu
minimum. Karena berbagai alasan kekurangan dari metode HPLC, dewasa ini muncul
suatu instrumentasi yang disebut sebagai UHPLC (Ultra High Performance Liquid
Chromatograph) yang menawarkan efisiensi tinggi dalam analisis. UHPLC mencakup
pemisahan LC menggunakan kolom yang mengandung partikel yang lebih kecil dari
ukuran 2,5-5-µm yang biasanya digunakan dalam HPLC. Salah satu manfaat yang
ditawarkan dalam sistem UHPLC adalah efisiensi yang lebih tinggi dibandingkan dengan
HPLC. Hasil yang diperoleh adalah analisis menggunakan metode UHPLC terbukti dapat
meningkatkan efiensi dibandingkan dengan metode konvensional HPLC. Efisensi
tersebut berupa penurunan waktu analisis, jumlah sampel dan fase gerak yang
dibutuhkan, serta biaya. Selain itu, keuntungan dari metode UHPLC adalah peningkatan

4
 sensitivitas yang ditunjukkan dengan penurunan nilai LOD dan LOQ dibandingkan degan
metode HPLC konvensional.
Metode analisis obat yang direkomendasikan oleh Farmakope saat ini didasarkan
pada teknik kromatografi (CieleckaPiontek, 2013). Salah satu metode kromatografi yaitu
High Performance Liquid Chromatography (HPLC), merupakan teknik kromatografi cair
(LC) yang digunakan untuk pemisahan berbagai komponen dalam campuran. HPLC juga
digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi senyawa dalam proses pengembangan obat
dan telah digunakan di seluruh dunia sejak beberapa dekade (Chawla, 2016). Efisiensi,
kecepatan, peningkatan throughput, dan pengurangan biaya analisis adalah karakteristik
penting HPLC. Tujuan penggunaan HPLC adalah memisahkan molekul dalam waktu
minimum (Behnoush, 2015), sehingga penting untuk meningkatkan hasil analisis dan
mengurangi waktu analisis. Metode paling sederhana yang tersedia untuk mempersingkat
proses analisis adalah mempersingkat panjang kolom dan meningkatkan kecepatan aliran.
Pendekatan ini, bagaimanapun, bisa berisiko, karena campuran kompleks dari senyawa
tidak akan dipisahkan secara memadai dan efisiensi kolom akan jauh lebih rendah. Cara
kedua untuk mempersingkat waktu analisis adalah dengan mengurangi ukuran partikel.
Hal ini memungkinkan analisis kecepatan tinggi dengan efisiensi tinggi, tetapi aspek
negatifnya adalah generasi tekanan balik tinggi yang tidak dapat diterima untuk sistem
HPLC konvensional dan kolom analitik konvensional (Novakova, 2016).

2.4 Penggunaan HPLC

Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fase gerak ke
dalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat
ditingkatkan dengan besar. Kromatografi penukar ion telah berhasil digunakan untuk
analisis kation, anion dan ion organik. ( Veronika, R.M, 1999).

5
Beberapa kelebihan yang dimiliki kromatografi HPLC sehingga menjadikannya sebagai “the best
choice” dalam dunia penentuan/pemisahan ion/logam, di antaranya:

 Kecepatan (speed). Kecepatan dalam analisis suatu sampel menjadi aspek yang sangat
penting dalam hal analisis ion yaitu untuk mengurangi biaya, bisa menghasilkan data
analisis yang akurat dan cepat dan bisa mengurangi limbah (waste) yang dihasilkan dari
penggunaan eluen.
 Sensitivitas (sensitivity). Perkembangan teknologi mikro prosessor yang dikombinasikan
dengan efisiensi kolom pemisah, mulai ukuran diameter dalam milimeter sampai skala
mikro yang biasa juga disebut microcolumn, membuat pendeteksian ion dalam sampel
menjadi lebih baik, meskipun jumlah sampel yang diinjeksikan ke dalam kolom pemisah
sangat sedikit
 Selektivitas (selectivity) Dengan sistem ini, bisa dilakukan pemisahan berdasarkan
keinginan, misalnya kation/ anion organik saja atau kation/anion anorganik yang ingin
dipisahkan. Itu dapat dilakukan dengan memilih kolom pemisah yang tepat.
 Pendeteksian yang serempak (simultaneous detection) Teknik pendeteksian sekali injeksi
untuk sebuah sampel seperti ini penting untuk dilakukan karena tentunya mempunyai
sejumlah kelebihan dibanding pemisahan terpisah. Sebagaimana telah diulas di atas,
beberapa kelebihan di antaranya dapat menekan biaya operasional, memperkecil jumlah
limbah saat analisis berlangsung, memperpendek waktu analisis (short time analysis)
serta dapat memaksimalkan hasil yang diinginkan.
 Kestabilan pada kolom pemisah (stability of the separator column) Walaupun sebenarnya,
ketahanan kolom ini berdasarkan pada paking (packing) material yang diisikan ke dalam
kolom pemisah. Namun kebanyakan, kolom pemisah bisa bertahan pada perubahan yang
terjadi pada sampel, misalnya konsentrasi suatu ion terlalu tinggi, tidak akan
mempengaruhi kestabilan material penyusun kolom. Namun, diakui bahwa ada juga
kolom pemisah yang mempunyai waktu penggunaan yang tidak terlalu lama, dikarenakan
kemasan kolom yang kurang baik atau karena faktor internal lainnya. (download
November 2009)

6
Gambar 5-1 memperlihatkan rangkaian alat atau komponen dasar yang biasa dipakai dalam
teknik kromatografi ion, yang terdiri atas:

 Eluent, yang berfungsi sebagai fase gerak yang akan membawa sampel tersebut
masuk ke dalam kolom pemisah;
 Pompa, yang berfungsi untuk mendorong eluent dan sampel tersebut masuk ke
dalam kolom. Kecepatan alir ini dapat dikontrol dan perbedaan kecepatan bisa
mengakibatkan perbedaan hasil; Injektor, tempat memasukkan sampel dan
kemudian sampel dapat didistribusikan masuk ke dalam kolom;
 Kolom pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada dalam sampel.
Keterpaduan antara kolom dan eluent bisa memberikan hasil/puncak yang
maksimal, begitu pun sebaliknya, jika tidak ada “kecocokan”, maka tidak akan
memunculkan puncak;
 Detektor, yang berfungsi membaca ion yang lewat ke dalam detektor;
 Rekorder data, berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang masuk. (Weiss.
J, 1995).

2.5 Perbandingan HPLC dan UHPLC

Metode dan hasil

Menggunakan sumber data primer yang dilakukan mengunakan instrumen search
engine online seperti Google, Google Scholar, Pubmed, Science Direct sebagai sumber
informasi dan data dalam artikel review ini. Pencarian dilakukan dengan menggunakan

7
kata kunci “Determination HPLC and UHPLC journal”, “Comparison determination
HPLC and UHPLC journal”, “UHPLC vs HPLC”, dan lain sebagainya. Tabel berikut
menjelaskan perbedaan kondisi analisis dan simpulan yang diuraikan pada artikel
berikut :

8
Pembahasan:

9
Ukuran partikel yang kecil ini merupakan perbedaan major yang membedakan antara
UHPLC dengan HPLC. Faktor ukuran particle kolom ini dapat dijelaskan melalui
persamaan Van Demteer dimana menurut persamaan van Deemteer, penurunan ukuran
partikel dapat meningkatkan efisiensi pemisahan sementara di sisi lain efisiensi berkurang
pada peningkatan laju aliran atau kecepatan linier. Tetapi pada ukuran partikel kurang
dari 2,5 mm, tidak hanya terdapat peningkatan efisiensi yang signifikan, tetapi efisiensi
tidak berkurang pada laju aliran yang meningkat atau kecepatan linier.

Pompa pada sistem HPLC konvensional hanya mencapai tekanan 400 bars. Sedangkan
pompa pada sistem UHPLC dapat mencapai tekanan hingga 1000 bar. Hal ini membuat
sistem UHPLC dapat menjalankan sistem dengan kolom ukuran partikel yang lebih kecil
(< 2,0 mm) dan masih dapat menghasilkan flow rate hingga 5 mL/menit (Roge, 2011).
metode UHPLC dapat direkomendasikan untuk studi yang mengadopsi prinsip ramah
lingkungan dalam analisis farmasi (Cielecka-Piontek, 2013). Adapun parameter LOD dan
LOQ yang lebih kecil pada sistem UHPLC menunjukkan bahwa metode UHPLC lebih
sensitif dibuktikan dengan adanya hasil kromatogram yang lebih sempit, tajam, dan tinggi
dibandingkan kromatogram HPLC konvensional yang menghasilkan kromatogram yang
lebih lebar dan pendek. Tekanan UPLC dapat mencapai 100 MPa, sedangkan pada sistem
HPLC maksimum hanya 35-45 MPa, tergantung pada sistem tertentu. Dengan demikian,
analisis yang dilakukan pada sistem UHPLC dapat menahan tekanan balik sekitar 90 MPa
tanpa masalah, sedangkan penggunaan tekanan sebesar itu pada HPLC umum tidak
mungkin dilakukan. Maksimum untuk metode analitik yang digunakan secara rutin pada
HPLC adalah sekitar 30 MPa. Nilai tekanan yang lebih tinggi akan membahayakan
sistem, yang bisa terjadi dengan penuaan kolom. Namun, masalah ini dapat diabaikan
pada penggunaan kolom monolitik karena sistem tersebut menghasilkan tekanan balik
yang sangat rendah (2006).

Persamaan Vandem-Teer Ukuran partikel kecil yang digunakan dalam UHPLC adalah
hasil optimasi cermat fase padat berdasarkan teori yang dijelaskan oleh Van Deemter.
Menurutnya pelebaran pita disebabkan oleh tiga faktor: difusi Eddy (A), difusi
longitudinal (B), dan transfer massa (C). Ketinggian plat (H) digunakan untuk

10
memperkirakan efisiensi kolom berdasarkan tiga faktor ini. Transfer massa dan difusi
longitudinal keduanya tergantung pada kecepatan fase gerak linier (u). Pada kecepatan
rendah, difusi longitudinal dominan dan ketika kecepatan meningkat efeknya berkurang;
senyawa-senyawa tidak punya waktu untuk berdifusi secara longitudinal. Di sisi lain,
input perpindahan massa tumbuh dengan meningkatnya kecepatan (Salonen, 2017).

Simbol A adalah istilah yang menjelaskan sebagian besar keuntungan UHPLC

dibandingkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) reguler. Saat packing
kolom semakin kecil dan semakin kecil jalur molekul memiliki perbedaan yang lebih
kecil dalam rute yang ditempuh melalui kolom. Ini berarti bahwa suku A menyatu ke nol
ketika ukuran partikel (dp) berkurang, seperti pada kolom tubular terbuka (persamaan 2)
(Salonen, 2017).

di mana 𝜆 menjelaskan kualitas dan keseragaman packing. Hal ini berarti bahwa
pengepakan seragam kecil memiliki potensi nyata. Juga, variabel C berkurang sebagai
pengepakan kolom semakin kecil, terutama untuk partikel kulit inti, dan senyawa tidak
dapat berdifusi sejauh ke fase diam, yang mengurangi C. Menariknya, faktor A
tampaknya sama untuk semua kolom packing yang lebih kecil dari 3 μm. Sisi lain dari
ukuran partikel kecil adalah akan menghasilkan tekanan balik yang tinggi, yang tidak
dapat ditangani oleh HPLC biasa. Setiap kali ukuran partikel berkurang dua kali lipat,
tekanan balik meningkat empat kali lipat, tanpa ada perubahan pada parameter lainnya.
Tekanan ini disebabkan oleh resistensi cairan melalui jalur sempit antara dan dalam fase
diam. Sistem UHPLC dapat menangani tekanan hingga 1300 bar. Hal ini memungkinkan
untuk menggunakan partikel lebih kecil dari 3 μm tanpa mengurangi laju alir. Metode
lain untuk mengurangi perbedaan rute adalah dengan menggunakan core-shell particle.
Inti padat mengurangi difusi ke dalam partikel, dan karenanya mengurangi waktu yang
11
dibutuhkan senyawa untuk menyeimbangkan di antara fase. Biasanya partikel
sepenuhnya berpori. Karena faktor difusi diminimalkan dalam partikel yang dikemas,
puncak yang sangat sempit terbentuk. Resolusi tersebut menggambarkan kekuatan
pemisahan suatu sistem. Resolusi (Rs) dapat dinyatakan dengan waktu retensi dan lebar
puncak (wb).

12
 BAB 3. PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan
kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) adalah teknik kromatografi cair (LC) yang penting dan sering
digunakan untuk pemisahan berbagai komponen dalam campuran. Ciri teknik ini adalah
penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fase gerak ke dalam kolom. Dengan
memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan
besar. Kromatografi penukar ion telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion
dan ion organik. ( Veronika, R.M, 1999).
Perbedaan utama dalam membandingkan HPLC dan UHPLC yaitu
memungkinkan untuk analisis partikel yang ukurannya sekitar 5 mikrometer sedangkan
UHPL memungkinkan partikel yang jauh lebih kecil sekitar 2 mikrometer. Namun
UHPLC lebih efesien dibandingkan HPLC karena menggunakan tekanan pompa yang
tinggi: 40 MPA sementara itu UHPLC menggunakan pompa 100MPA. Oleh karena itu,
teknik UHPLC adalah versi HPLC yang dikembangkan. Dengan demikian metode
operasinya sama, tetapi kita tidak dapat menemukan beberapa fitur yang ditingkatkan di
UHPLC dibandingkan dengan HPLC. Jadi UHPLC adalah bentuk HPLC.

HPLC memiliki keunggulan sebagai berikut

 Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran.
 Mudah dalam pengoperasian instrumentasinya.
 Memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi.
 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/ kerusakan bahan yang dianalisis.
 Memiliki resolusi yang baik.
 Dapat menggunakan bermacam-macam detektor.
 Kolom dapat digunakan kembali.
 Mudah melakukan "sample recovery"

13
14
DAFTAR PUSTAKA

Ardianingsih, R. (2009). PENGGUNAAN HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY (HPLC) DALAM PROSES ANALISA DETEKSI ION. Berita
Dirgantara Volume 10 Nomor 4, 101-104.

safira Annisa, I. M. (2020). PERBANDINGAN METODE ANALISIS INSTRUMEN HPLC

DAN UHPLC: ARTICLE REVIEW. Farmaka Volume 17 Nomor 3, 189-197.

15
LAMPIRAN

16
17
18